טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לטהר קומפלקס מקרומולקולרי מקורי באיכות מתאימה למחקרים ביופיזיקליים. פרוטוקול זה משמש לא רק כדרך לטיהור קומפלקס, אלא כמדריך מפורט להערכת האיכות המבנית של הדגימה במהלך הטיהור. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לטהר מכלול מקומי בתנאי חיץ כמעט פיזיולוגיים בפשטות ובמהירות, כדי להבטיח הומוגניות קומפוזיציונית.

לאחר צנטריפוגה של תאי S.cerevisiae, וניקוז הסופרנטנט על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף שני מיליליטר של מאגר ליזה צונן, וסובב ו/או השתמש בפיפטה סרלוגית של 10 מיליליטר כדי לתלות את הגלולה. העבירו את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטי ריק בנפח 50 מיליליטר הנשמר על קרח. לאחר מכן השתמש בשני מיליליטר נוספים של מאגר ליזה צונן כדי לשטוף כל בקבוק צנטריפוגה ולהוסיף את התמיסה לצינור של 50 מיליליטר.

לאחר קביעת המשקל הרטוב של גלולת התא, צור אמבט חנקן נוזלי בתוך ומסביב לצינור צנטריפוגה מפוליפרופילן חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן, צייר תאים תלויים למזרק של חמישה מיליליטר וחבר מחט בגודל 16 למזרק. לאחר מכן, הקפיאו את תרחיף התא על ידי העברתו דרך המזרק והמחט לאמבטיה בקצב של כמיליליטר לדקה ליצירת טיפות.

כדי לזרוק את תאי השמרים, התחל בשימוש בחנקן נוזלי כדי לקרר מראש מטחנת קפה. לאחר מכן מוסיפים עד 40 גרם תאי שמרים וטוחנים במשך 25 שניות, וחוזרים על הטחינה שמונה או תשע פעמים. מומלץ לא לטהר יותר מ -10 ליטר תרבית תאים בבת אחת.

זה ממזער את זמן הטיהור ומבטיח שמירה על השלמות המבנית של המתחם. לאחר כל שני סבבי טחינה, הוסיפו שכבה רדודה של חנקן נוזלי למטחנה והניחו לה להתאדות. כדי למנוע מהתאים להתגבש, מנעו מהתאים להפשיר באמצעות מרית מקוררת חנקן נוזלית כדי לערבב את התאים.

לאחר ליזה, התאים צריכים להופיע כאבקה לבנה דקה. לאחר בדיקת ליזיס תאים והכנת מאגר ליזה עם מעכבי PMSF, DTT ופרוטאז על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במרית מקוררת חנקן נוזלי כדי לגרוף בהדרגה את אבקת התאים הקפואה לתוך צינורות 50 מיליליטר המוכנים של המאגר. עם כל תוספת נוספת, סובב בעדינות את צינורות 50 מיליליטר בטמפרטורת החדר כדי להפשיר ולהמיס את התאים ולמנוע היווצרות בועות.

כאשר התאים מתמוססים, הוסיפו עוד אבקת תאים. לאחר הוספת כל התאים, המשיכו להפשיר ולהמיס את התאים עד שלא נצפו גושי תאים קפואים בצינורות. זה אמור לקחת בערך 50 דקות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התא ליזאט ב -25, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר שהתאים עוברים ליזה ובעקבות צנטריפוגה, אתה עשוי להבחין בשכבה כהה קטנה בכדור הבלתי מסיס. העבירו את הסופרנטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגה מפוליקרבונט והוסיפו 10 מיקרוליטר של PMSF של 200 מילי-מולרי לכל צינור מלא.

צנטריפוגה את הדגימות ב-100, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. בסוף הסיבוב צריכות להיות גלויות ארבע שכבות. כדור שקוף קשה המכיל בעיקר קומפלקסים ריבוזומליים; גלולה עשירה בשומנים רכים; שכבה גדולה, שקופה, בגוון צהוב המכילה את רוב החלבונים והקומפלקסים המסיסים של התא; ושכבה עליונה קשקשית המורכבת משומנים.

בחדר קר בארבע מעלות צלזיוס, השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי להסיר כמה שיותר משכבת השומנים הקשקשית העליונה ולהשליך. השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לשחזר את רוב השכבה הצהובה השקופה. לאחר מכן, בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד כדי למנוע הפרעה לשתי השכבות התחתונות, שחזר את המיליליטר האחרון של שכבה זו.

מ-40 גרם של כדור תאים רטובים, בדרך כלל מתאוששים כ-48 מיליליטר מהשכבה האמצעית. לאחר הכנת ספרוז IgG על פי פרוטוקול הטקסט, שלב את שרף ה-IGG עם סופרנטנט השלב האמצעי ושתי טבליות מעכב פרוטאז מיני לכל 40 גרם תאים. לאחר מכן מניחים על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

זהו פתרון האצווה של IgG. הכן שני עמודי פוליפרפ של 10 מיליליטר על ידי חיתוך קצות העמודים כדי לייצר פתח שטוח. יוצקים את 24 מיליליטר תמיסת שרף IgG תלויה או תמיסת אצווה לכל עמודה, ומניחים לשקוע על ידי כוח הכבידה.

זה מתאים ל-200 מיקרוליטר של שרף IgG ארוז. אם המשקעים נמשכים יותר מ-30 דקות, ייתכן שהשלב האמצעי זוהם על ידי שומנים. לאחר השלמת המשקעים, השתמש בארבעה נפחים רצופים של 10 מיליליטר של מאגר IgG D150 כדי לשטוף את העמוד הארוז.

כדי לבצע וירוס תחריט טבק או מחשוף פרוטאז TEV על העמוד, אטום את החלק התחתון של העמודה והוסף מיליליטר אחד של מאגר IgG D150 ו-100 מיקרוליטר של פרוטאז TEV. אוטמים את החלק העליון של העמוד ובעזרת מערבל תרמי ב -750 סל"ד ו -18 מעלות צלזיוס מערבבים במשך 20 דקות. השעו מחדש את השרף וערבבו שוב למשך 20 דקות.

לאחר מכן השעו מחדש וחזרו על הערבוב של 20 דקות בפעם השלישית. החזר את העמודה לארבע מעלות צלזיוס והשתמש בכוח הכבידה כדי לחסל את קומפלקס החלבון. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של IgG D150 כדי לנטרל את הנפח המת.

לאחר הכנת שרף זיקה לקלמודולין על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף את מאגר קשירת הקלמודולין והדגימה לשרף, והשתמש במסובב צינור כדי לדגור בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. הכן עמודת פוליפרפ של שני מיליליטר לכל 100 מיקרוליטר של תמיסת קלמודולין על ידי חיתוך קצה העמוד ליצירת פתח שטוח. הפרוטוקול מפרט נפחי חיץ ומגורים ספציפיים שנבחרו כדי לשמור על ריכוז המתחם ולמזער את זמן השהייה של השרף שלו.

אם משתנה נפח תרבותי, מומלץ לשנות את נפחי השרף והחיץ של עמודי הכבידה כדי לקחת בחשבון את השינוי. ארזו את העמודה עם לא יותר מ -100 מיקרוליטר של תמיסת קלמודולין ובכוח הכבידה, השתמשו ב -5 מיליליטר של מאגר קשירת קלמודולין כדי לשטוף את השרף שלוש פעמים. באמצעות 200 מיקרוליטר של מאגר פליטת קלמודולין, יש להוציא את החלבון שלוש פעמים.

לאחר מכן, אטמו את החלק התחתון של העמוד והוסיפו 20 מיקרוליטר של מאגר פליטה ודגרו במשך 2.5 דקות לפני שחרור האיטום ומתן לחלבון להתרוקן על ידי כוח הכבידה. אטמו שוב את תחתית העמוד והוסיפו 200 מיקרוליטר של מאגר פליטה לפני הדגירה למשך חמש דקות. לאחר מכן, פתח את החלק התחתון של העמוד והוציא את התמיסה.

לפליטה השישית והאחרונה, אטמו את תחתית העמוד ודגרו עם מאגר פליטה למשך 10 דקות. לאחר מכן, פתחו את האטם והוציאו. בצע ניתוח לאחר הטיהור ואחסן דגימות על פי פרוטוקול הטקסט.

כפי שמוצג כאן, טיהור ראשוני של TAP של הקומפלקס בעקבות פרוטוקול שפורסם הניב קומפלקס שנודד כשלוש רצועות על ג'ל מוכתם בכסף. סבבים מרובים של אופטימיזציה של שיטת TAP נותנים לנו קומפלקס שנודד כפס בודד על ג'ל מקורי, המעיד על הרכבה הומוגנית יותר. בהתאם לתוצאת הג'ל המקומית, כתמים מערביים באמצעות נוגדן TAP כנגד הקומפלקס, מטוהרים על פי הפרוטוקול שפורסם, זיהו פרוטאוליזה של החלבון המתויג TAP, SNU-71.

שינויים בשיטת TAP הפחיתו משמעותית את כמות הפרוטאוליזה, מכיוון שכמעט כל 17 החלבונים בקומפלקס U1 snRNP נפתרו על ידי SDS-PAGE וזוהו באופן חיובי על ידי ספקטרומטריית מסה מרובה. מיקרוסקופ אלקטרונים של כתם שלילי מראה חלקיקים חד-מפוזרים מטיהור מוצלח לאחר השלב הראשון והשני של TAP. לעומת זאת, לא נצפים חלקיקים בגודל הנכון כאשר הטיהור אינו מוצלח.

האיכות המורכבת הסופית הוערכה על מדשאה של חלקיקים מטוהרים, המוצגים כאן, המופיעים בתמונה הגולמית של EM כתם שלילי. בנוסף, ממוצעי המחלקה של החלקיקים חושפים מאפיינים מובהקים המצביעים על כך שהדגימה עשויה להתאים למחקר מבני. לאחר השליטה, ניתן להשלים פרוטוקול זה תוך 10 עד 12 שעות מהפשרת אבקת התאים הקפואים.

תוך כדי ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לוודא שכל הפתרונות נקיים מפרוטאזות ונוקלאזות, כמו גם לפעול במהירות כדי למנוע צבירה או דיסוציאציה של הקומפלקס. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להבין כיצד לטהר קומפלקס מקומי באיכות מתאימה למחקר מבני, כמו גם כיצד להעריך כי הדבר הושג.