טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לטהר קומפלקס מקרו-מולקולרי טבעי באיכות מתאימה למחקרים ביופיזיקליים. פרוטוקול זה משמש לא רק כדרך לטיהור קומפלקס, אלא כמדריך מפורט להערכת האיכות המבנית של הדגימה במהלך הטיהור. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לטהר התארגנות טבעית בתנאי באפר קרובים לתנאים פיזיולוגיים באופן פשוט ומהיר, וזאת כדי להבטיח הומוגניות בהרכב.

לאחר סנטריפוגציה של תאי S.cerevisiae ושפיכת הנוזל העליון בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הוסיפו שני מיליליטר של תמיסת ליזיס מקוררת, וסובבו את המבחנה ו/או השתמשו בפיפט סרולוגי של 10 מיליליטר כדי להשעות את המשקע. העבירו את ת сусפנזיית התאים למבחנה קונית ריקה מפּוליפרופילן בנפח 50 מיליליטר שנשמרה על קרח. לאחר מכן, השתמשו בשני מיליליטר נוספים של תמיסת ליזיס מקוררת כדי לשטוף כל מבחנת סנטריפוגה והוסיפו את התמיסה למבחנה של 50 מיליליטר.

לאחר קביעת המשקל הרטוב של משקע התאים, הכינו אמבט חנקן נוזלי בתוך ומסביב למבחנה צנטריפוגית קונית מpolypropylene בנפח 50 milliliters. לאחר מכן, שאבו את התאים התלויים למזרק של five milliliters וחברו למזרק מחט במידה 16 gauge. לאחר מכן, הקפיאו את ת сусפנזיית התאים על ידי העברתה דרך המזרק והמחט אל תוך האמבט בקצב של כ-one milliliter לדקה כדי ליצור טיפות.

כדי ללוות את תאי השמרים, התחילו בשימוש בחנקן נוזלי לקירור מקדים של מטחנת קפה. לאחר מכן, הוסיפו עד 40 גרם של תאי שמרים וטחנו למשך 25 שניות, וחזרו על פעולת הטחינה שמונה או תשעה פעמים. מומלץ לא לטהר יותר מ-10 ליטר של תרבית תאים בבת אחת.

פעולה זו מקטינה את זמן הטיהור ומבטיחה את שמירת השלמות המבנית של הקומפלקס. לאחר כל שני סבבים של גריסה, הוסיפו שכבה דקה של חנקן נוזלי למטחנה והמתינו שיתאדה. כדי למנוע התגבשות של התאים, מנעו את הפשרתם על ידי ערבוב התאים באמצעות שפכטל שקוהל בחנקן נוזלי.

לאחר הליזה, התאים צריכים להיראות כאבקה לבנה דקה. לאחר בדיקת ליזת התאים והכנת תמיסת ליזה עם PMSF, DTT ומעכבי פרוטאז בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו בשפכטל שקולל בחנקן נוזלי כדי להעביר בהדרגה את אבקת התאים הליטיים הקפואים אל תוך מבחנות של 50 מיליליטר עם התמיסה שהוכנה. עם כל תוספת, סובבו בעדינות את מבחנות ה-50 מיליליטר בטמפרטורת החדר כדי להפשיר ולהמיס את התאים ולמנוע היווצרות בועות.

ככל שהתאים נמסים, הוסיפו עוד מאבקת התאים. לאחר הוספת כל התאים, המשיכו בהפשרה ובהמסה של התאים עד שלא יצופו גושים קפואים של תאים במבחנות. תהליך זה אמור להימשך כ-50 דקות.

בשלב הבא, סנטריפוגו את ליזאט התאים ב-25,000 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר ליזיס התאים והסנטריפוגה, ייתכן שתבחינו בשכבה כהה קטנה במשקע הבלתי מסיס. העבירו את העלייה (supernatant) למבחנות פוליקרבונט עבור אולטרה-סנטריפוגה והוסיפו 10 µL של 200 mM PMSF לכל מבחנה מלאה.

סובב את הדגימות בצנטריפוגה ב-100,000 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. בסיום הסבוב, ארבעה שכבות אמורות להיות גלויות: משקע קשיח ושקוף המכיל בעיקר קומפלקסים ריבוסומליים; משקע רך עשיר בליפידים; שכבה גדולה, שקופה ובעלת גוון צהוב המכילה את מרבית החלבונים והקומפלקסים המסיסים של התא; ושכבה עליונה קשקשית המורכבת מליפידים.

בחדר קירור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, השתמשו בפיפטה של מיליליטר אחד כדי להסיר כמה שיותר מהשכבה השומנית הקשקשית העליונה והשליכו אותה. השתמשו בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לאסוף את מרבית השכבה הצהובה הצלולה. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה של מיליליטר אחד כדי להימנע מהפרעה לשתי השכבות התחתונות, ואספו את המיליליטרים האחרונים של שכבה זו.

מתוך 40 גרם של משקאות תאים רטובים, מופקים בדרך כלל כ-48 מיליליטרים מהשכבה האמצעית. לאחר הכנת IgG sepharose לפי הפרוטוקול הכתוב, שלבו את שרף ה-IGG עם העילאי של השלב האמצעי ושני טבליות מיני-מעכבי פרוטאז לכל 40 גרם תאים. לאחר מכן, הניחו על רוטטור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

זהו תמיסת ה-IgG עבור תהליך ה-batch. הכינו שתי עמודות polyprep של 10 milliliters על ידי חיתוך קצוות העמודות ליצירת פתח שטוח. שפכו 24 milliliters של תרחיף שרף IgG מושעה או תמיסת batch לתוך כל עמודה, והמתינו לשקיעה בכוח הכבידה.

כמות זו מקבילה ל-200 µL של שרף IgG דחוס. אם השקיעה אורכת יותר מ-30 דקות, ייתכן שהשלב האמצעי זיהומה לשומנים. כאשר השקיעה הושלמה, השתמשו בארבעה נפחים עוקבים של 10 mL של תמיפת IgG D150 buffer כדי לשטוף את העמודה הדחוסה.

כדי לבצע עיכור באמצעות פרוטאזה של tobacco etch virus או TEV protease בעמודה, אטמו את תחתית העמודה והוסיפו 1 ml של IgG D150 buffer ו-100 µL של TEV protease. אטמו את חלקו העליון של העמודה וערבבו במשך 20 דקות באמצעות מיקסר תרמי ב-750 RPM ובטמפרטורה של 18 °C. השביו את השרף (resin) לתמיכה וערבבו שוב למשך 20 דקות.

לאחר מכן, השביה מחדש וחזור על הערבוב למשך 20 דקות פעם שלישית. החזר את העמודה לטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס והשתמש בכוח הכבידה כדי לאלות את קומפלקס החלבון. לאחר מכן, הוסף 200 microliters של IgG D150 כדי לאלות את הנפח המת.

לאחר הכנת שרף זיקה לקלמודין (calmodulin affinity resin) לפי הפרוטוקול הכתוב, הוסיפו לשרף את בופר הקישור לקלמודין ואת הדגימה, והשתמשו במערבל מבחנות (tube rotator) לדגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלסיוס למשך שעה אחת. הכינו עמודת polyprep בנפח של שני מיליליטר לכל 100 מיקרוליטר של תגליל קלמודין על ידי חיתוך קצה העמודה ליצירת פתח שטוח. הפרוטוקול מפרט בופר ונפחי שהייה ספציפיים שנבחרו כדי לשמור על ריכוז הקומפלקס ולמזער את זמן שהייתו בשרף.

אם נפח התרבית משתנה, מומלץ לשנות את נפחי השרף והבופר של עמודי הכבידה כדי להתאים לשינוי. ארזו את העמוד בלמ более 100 µL של תעכה (slurry) של קלמודולין, ובאמצעות כבידה, השתמשו ב-5 mL של בופר קישור לקלמודולין כדי לשטוף את השרף שלוש פעמים. באמצעות 200 µL של בופר אלוציה לקלמודולין, בצעו אלוציה של החלבון שלוש פעמים.

לאחר מכן, אטמו את תחתית העמודה, הוסיפו 20 µL של בופר אלוקציה (elution buffer) והדגירו למשך 2.5 דקות לפני שחרור האטם כדי לאפשר לחלבון להקלות בכבידה. אטמו שוב את תחתית העמודה והוסיפו 200 µL של בופר אלוקציה לפני הדגרה של חמש דקות. לאחר מכן, פתחו את האטם בתחתית העמודה והקלו את התמיסה.

עבור השטיפה (אלוציה) השישית והאחרונה, אטמו את תחתית העמודה והדגירו עם בופר אלוציה למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסירו את האיטום ובצעו אלוציה. בצעו אנליזה לאחר טיהור ואחסנו את הדגימות בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

כפי שמוצג כאן, טיהור TAP ראשוני של הקומפלקס לפי פרוטוקול שפורסם הניב קומפלקס שנדרה כשלושה פסים בג'ל צבוע בכסף. מספר סבבים של אופטימיזציה לשיטת ה-TAP הניבו קומפלקס שנדרה כפס בודד בג'ל native, דבר המעיד על הרכבה הומוגנית יותר. בדומה לתוצאה בג'ל ה-native, בלוט Western באמצעות נוגדן TAP נגד הקומפלקס, שתויח לפי הפרוטוקול שפורסם, זוהתה פרוטאוליזה של החלבון המסומן ב-TAP, SNU-71.

שינויים בשיטת ה-TAP הפחיתו באופן משמעותי את כמות הפרוטאוליזה, שכן כמעט כל 17 החלבונים בקומפלקס ה-U1 snRNP הופרדו באמצעות SDS-PAGE וזוהו באופן חיובי באמצעות ספקטרומטריית מסות מרובה. מיקרוסקופיה אלקטרונית עם צביעה שלילית מראה חלקיקים מפוזרים באופן אחיד (monodispersed) לאחר טיהור מוצלח בשלבים הראשון והשני של ה-TAP. לעומת זאת, לא נצפו חלקיקים בגודל הנכון כאשר הטיהור לא הצליח.

איכות הקומפלקס הסופי הוערכה על גבי שכבה של חלקיקים מטוהרים, כפי שמוצג כאן, הנראים כמונו-דיספרסיים בתמונת ה-EM הגולמית בצביעה שלילית. בנוסף, ממוצעי מחלקות של החלקיקים חושפים מאפיינים ברורים המצביעים על כך שהדגימה עשויה להתאים למחקר מבני. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים פרוטוקול זה בתוך 10 עד 12 שעות מהפשרת אבקת תאי התאים המולייזים הקפואים.

בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לוודא שכל התמיסות נקיות מפרוטאזים ונוקלאזים, וכן לעבוד במהירות כדי למנוע אגרגציה או דיסוציאציה של הקומפלקס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם תבינו כיצד לטהר קומפלקס טבעי (native complex) באיכות מתאימה למחקר מבני, וכן כיצד להעריך שפעולה זו הושגה.