בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תת-קבוצות של תאי B קודמים מדם טבורי. זה מושג על ידי בידוד תאים חד-גרעיניים מדם טבורי על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. בשלב השני, אנטיגנים על פני התא מסומנים בנוגדנים מצומדים של ביוטין כדי לרוקן מגנטית כל אחד מהתאים הנותרים שאינם B.

לאחר מכן, תאי B המבודדים מסומנים באופן פלואורסצנטי עם נוגדנים כנגד אנטיגנים על פני השטח של תאי CD 19, CD 34 ו-CD 45. בשלב האחרון, התאים ממוינים לפי ציטומטריית זרימה כדי לשחזר את תת-הקבוצות של תאי B המבשר. בסופו של דבר, ניתן לרכוש תאים במספר ובאיכות מספיקים לשימוש במבחנים במורד הזרם הדורשים DNA ו-RNA באיכות גבוהה.

יתרון אחד של אסטרטגיית מיון התאים על פני שיטות חלופיות הוא שהאסטרטגיה שלנו דורשת פחות זמן על ציטומטר הזרימה ורק שלושה נוגדנים פלואורסצנטיים מפחיתים מאוד את עלות הניסוי. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם מגוון השיטות הזמינות להכנת תאי דם טבורי לזרימה ציטומטרית והמורכבות של הכנת ציטומטר הזרימה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תאי B בריאים, ניתן ליישם אותה גם על סוגי תאים אחרים הקיימים בדם טבורי כגון תאי T או על מחקרים של מחלות הכוללות תאים המטופויאטיים כגון לוקמיה או לימפומה.

הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לתאר את הטכניקות המתאימות הנדרשות לעיבוד הדם והתאים הטבוריים באופן שממקסם את כדאיות התא ומפחית את נוכחות הפסולת המזהמת. כדי לבודד תאים חד-גרעיניים מדם טבורי יש לדלל תחילה שמונה מיליליטר של הדם הטבורי עם 24 מיליליטר DPBS. לאחר מכן שכבו לאט לאט כל תערובת דם מדוללת על גבי 15 מיליליטר ALI וואט של פיפה פלוס בצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר, תוך הקפדה על הפרדה בין השכבות.

לאחר מכן, צנטריפוגה של הדם למשך 40 דקות בטמפרטורה של 400 פעמים G ו-20 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים מופרדים על ידי תווית שיפוע צפיפות שבעה צינורות תחתונים עגולים של חמישה מיליליטר עם תאריך זיהוי הדגימה וכל מידע מתאים אחר כמתואר בטבלה. לאחר ההפרדה, התאים החד-גרעיניים יישארו בממשק הפלזמה האטום פלוס, ואילו הגרנולוציטים והאריתרוציטים ישקעו כעת את שכבות הפלזמה העליונות, וימנעו מגע עם שכבות התאים החד-גרעיניים. לאחר מכן השתמש בפיפטת זכוכית של 10 מיליליטר כדי לאסוף בזהירות את שכבות התאים החד-גרעיניים משלושה מתוך צינורות ה-50 מיליליטר לתוך שפופרת חדשה אחת של 50 מיליליטר.

מלאו את הצינור החדש הזה ב- PBS, ערבבו את תרחיף התאים בעדינות ואז שטפו את התאים פעמיים במשך 10 דקות ב -300 פעמים G ו -20 מעלות צלזיוס. לאחר הכביסה הראשונה, השעו מחדש את הכדורים והעבירו לצינור חרוטי יחיד של 50 מיליליטר. לאחר הכביסה השנייה, יש להחיות בעדינות את גלולת התא ב -200 מיקרוליטר של PBS להעביר מיקרוליטר אחד של תרחיף התא למיליליטר אחד של PBS בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לספירה.

לאחר מכן שטפו את התאים בשפופרת של 50 מיליליטר עם PBS נוסף ולאחר מכן הסירו לחלוטין את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. כדי לבודד את תאי B מהתאים החד-גרעיניים ראשית, Resus תשעה את הגלולה שזה עתה נשטפה ב-160 מיקרוליטר של ארבע מעלות צלזיוס. מאגר DGAs טרי E-D-T-A-P-B-S.

לאחר מכן מערבבים 40 מיקרוליטר של ערכת בידוד תאי B, קוקטייל נוגדנים bio ITIN עם תרחיף התאים. לאחר דגירה של התאים במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, יש לשטוף את הנוגדן החופשי במיליליטר אחד של ארבע מעלות צלזיוס, מאגר E-D-T-A-P-B-S לכל 10 מיליון תאים. לאחר מכן השעו מחדש את כדור התא ב-320 מיקרוליטר של ארבע מעלות צלזיוס E-D-T-A-P-B-S.

כעת מערבבים 80 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים אנטי-ביוטין עם תרחיף התא לאחר דגירה של 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את התאים שוב בזמן שהתאים מסתובבים. הנח עמודת LS בשדה המגנטי של מפריד מקסימלי וטפטף שלושה מיליליטר של ארבע מעלות צלזיוס E-D-T-A-P-B-S דרך העמודה.

לאחר מכן יש להשעות עד 100 מיליון מהתאים השטופים ב-500 מיקרוליטר של ארבע מעלות צלזיוס, מאגר E-D-T-A-P-B-S. לאחר מכן פיפטה את תרחיף התא על העמוד ואוספת את התאים הלא מסומנים העוברים דרך העמודה בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. הוסף שני מיליליטר נוספים של ארבע מעלות צלזיוס, מאגר E-D-T-A-P-B-S לדפנות הצינור החרוטי המקורי, מיליליטר אחד בכל פעם ולאחר מכן ערבב בעדינות ופיפטה את מתלה התאים הנותר על העמודה בכל פעם כדי להיות בטוח לשחזר את כל התאים.

לבסוף מלאו את הצינור החרוטי המכיל את התאים הלא מסומנים ב-PBS. אחרי הצנטריפוגה, התאים מסירים בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורית התא. לאחר מכן החייאו בעדינות את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר E-D-T-A-P-B-S.

התחל את תיוג הנוגדנים. שלב על ידי העברת מיקרוליטר אחד של מתלה התא לתוך הצינור הלא מוכתם שסומן בעבר. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר E-D-T-A-P-B-S לצינור ואחסן אותו על קרח.

כבה את כל האורות ולאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר כל אחד של נוגדנים CD 19, CD 34 ו-CD 45 לכל מיליון תאים לתרחיף התאים הנותר. מערבבים היטב ומניחים את הצינור בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו 40 מיקרוליטר של תרחיף התאים המסומן בנוגדנים לתוך הצינור המסומן ב-7 A a D.

שטפו את התאים במיליליטר אחד של PBS ואז השעו מחדש את המזרן ב -100 מיקרוליטר של מאגר קשירה. הוסף שבעה מיקרוליטרים של שבעה A a d לתאים אלה ולאחר מכן דגר אותם בחושך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזמן שהתאים מסומנים ב-7 A a d מעל הצינור של התאים המסומנים בנוגדנים עם PBS, שטפו את התאים המסומנים בנוגדנים ולאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר E-D-T-T-A-P-B-S. כעת העבר את כל הנפח של תרחיף התאים המסומן בנוגדנים לתוך הצינור החיובי CD 19 CD 34 חיובי CD 45 חיובי.

שטפו את השפופרת עם מיליליטר נוסף של מאגר E-D-T-A-P-B-S והעבירו את מתלה התאים הנותר לתוך הצינור החיובי CD 19 CD 34 חיובי CD 45 חיובי. לבסוף, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר קשירה לשבעה A A D כדי למיין את התאים באמצעות ציטומטר הזרימה MO flow XDP. ראשית הגדירו את זרימת ה-MO למיון, הריצו בקרות פיצוי מתאימות ולאחר מכן צרו פרוטוקול הכולל מגרשים כפי שמוצג באיור זה.

ודא שמערכת פינוי התרסיס פועלת בכל עת ולאחר מכן השתמש בדגימה הלא מוכתמת כדי להגדיר את כרךtage ורווח עבור חלקות הפיזור קדימה וצדדית. לזהות את אוכלוסיות הקרינה השלילית. הגדר את הסף לפחות או שווה ל-1% כך שכל DNA המכיל פסולת לא יזהם את הדגימות ששוחזרו.

הפעל כ-50,000 אירועים של CD 19 חיובי CD 34 חיובי CD 45 חיובי. כדי להגדיר את אסטרטגיית השער כפי שהודגמה זה עתה, שער אחורי של האוכלוסייה החיובית CD 19 חיובי CD 34 על פיזור צדדי לעומת תרשים פיזור קדימה. כדי להבטיח שהליכת הלימפוציטים תכלול תאי פרו B פוטנציאליים.

השתמש בדגימה זו כדי להגדיר גם את אוכלוסיית הקרינה השלילית עבור צביעת 7 a a d. לאחר מכן, הפעל את הדגימה 7 a a d כדי לקבוע את כדאיות הדגימה רק למיין תאים מדגימה עם כדאיות גדולה או שווה ל-95% בהתחלה מכיוון שתאים מתים יכתמו ללא הבחנה ועלולים לזהם את אוכלוסיות המיון כעת להגדיר החלטות מיון לאסוף עבור אוכלוסיות CD 19 חיובי, CD 34 חיובי CD 19 חיובי, CD 34 שלילי CD 45, CD נמוך 19 חיובי, CD 34 שלילי CD 45 בינוני ו-CD 19 חיובי. CD 34 נגטיב CD 45 גבוה.

כלול את שערי האפליה הלימפוציטים והכפולים בהחלטות המיון של כל האוכלוסיות כדי למנוע סתימות. בקצה המיון, סנן את הדגימה החיובית CD 19 CD 34 חיובית CD 45 דרך מסננת תאים של 40 מיקרון מיד לפני המיון. לאחר מכן הנח צינורות איסוף מסומנים המצופים ב-2% FBS ב-PBS במחזיק צינור ארוז בקרח ומיין את התאים לצינור האיסוף המתאים מיד לאחר השלמת המיון.

חילוץ ה- DNA בין שונות הדגימה ממלא תפקיד בהצלחת התא, מיון במיון טוב. יש אחוז גבוה של תאים בהליכה הלימפוציטים. דגימות עם שיעורי הצלחה טובים מכילות רמות נמוכות של פסולת מזהמת כפי שמעיד המספר הנמוך של אירועים הנופלים מתחת ומשמאל לאוכלוסיית הלימפוציטים המגודרת.

הדגימות עם שיעורי הצלחה נמוכים מכילות רמות גבוהות של פסולת מזהמת. דגימות גרועות מראות עלייה ניכרת באירועים אלה. התאים הממוינים בזרימה וה-DNA שלאחר מכן שבודד מכל תת-קבוצה של תאי B קודמים הם בכמות ובאיכות לביצוע ניתוחים במורד הזרם.

השתמשנו באופן שגרתי ב-DNA זה ב-Myra כדי להעשיר מ-DNA שעבר מתילציה כאן, מבודד מ-CD 19 חיובי, CD 34 תאים חיוביים, CD 19 חיובי, CD 34 שלילי, CD 45 תאים נמוכים, CD 19 חיובי, CD 34 שלילי, CD 45 תאים בינוניים ו-CD 19 חיובי CD 34. תאים גבוהים CD 45 שליליים עברו סוניקציה על גבוה במשך תשע דקות בסך הכל, טוהרו בעמודה ולאחר מכן הודגמו על ג'ל 1% עם כתם ג'ל חומצת גרעין ירוקה בנתיב זה. סולם זוגות בסיסים בקרה 100 הופעל גם לאחר ש-Myra השתמשה בשיטת המוטיב הפעיל Collector ultra kit PCR עם הבקרה SLC 25 A 37 ובקרת APC 1 ללא מתילציה בוצעה כדי לאשר את העשרת ה-DNA המתילי.

ההגברה הגבוהה יותר של ה-SLC 25. A 37 מאשר את העשרת ה- DNA המתילי בתת-קבוצות תאי B הקודמים לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 10 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בתא בעדינות רבה ולהשתמש בכמות האופטימלית של נוגדנים כך שיצירת הפסולת המזהמת תמוזער בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף הדור הבא על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אילו גנים עוברים מתילציה ותת-קבוצות קודמות של תאי B. אל תשכח שעבודה עם תאים אנושיים חיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון הפעלת מערכת פינוי אירוסול בכל עת בעת ביצוע הליך זה.