Name: בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: למד לבודד תת-קבוצות של תאי B מקדמים מדם טבורי באמצעות צנטריפוגה בגרדיאנט צפיפות ומיון ציטומטרי זרימה. שיטה זו מספקת חומצות גרעין איכותיות לניסויים במחקר התפתחות החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NCI R00 CA132784) לKT

1. בידוד של תאי mononuclear מדם טבורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן EDTA-PBS חיץ להוסיף 5 מיליליטר פתרון שור אלבומין (BSA) מלאה לחיץ שטיפת מ&quot;ל 95 (1:20 דילול). דגת חיץ ולשמור על החיץ על קרח. החשוב: אי דגת המאגר עלול לגרום לפחות מתוצאות אופטימליות כאשר בידוד CD19 + תאי B בגלל בועות עלולות לחסום את טור הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל לצנטריפוגה שיפוע הצפיפות. לקבוע את מספר הצינורות הנדרשים לעיבוד דם הטבורים (צינור 1 יכול לעבד דם מ&quot;ל 8) ומוסיף 15 מ&quot;ל של PLUS Ficoll-Paque לכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל 8 מ&quot;ל של דם טבורים עם 24 המ&quot;ל DPBS (1X) ושכבה בזהירות את תערובת דם הטבורים המדוללת על גבי PLUS Ficoll-Paque בכל אחד מצינורות חרוטי 50 המ&quot;ל. אין לערבב את הדם וPLUS Ficoll-Paque. חשוב: כדי להימנע מערבוב של דם הטבורים וPLUS Ficoll-Paque, מחזיק את הצינור בזווית של 45 מעלות ושכבת תערובת הדם באיטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 400 במשך 40 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס תאי mononuclear (MNC) יישארו ב- Ficoll-Paque פלזמת PLUS ממשק אילו גרנולוציטים ואריתרוציטים משקעים עקב צפיפות גבוהה יותר בלחץ האוסמוטי של Ficoll-Paque PLUS. תווית 7 5 צינורות מיליליטר ישבן עגול שישמשו בחלק 3 עם מדגם הזהות, התאריך והבא: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שפופרת </td><td> מדבקה </td><td> מטרה </td></tr><tr><td> 1 </td><td> בתוליים </td><td> תאי בתוליים לנורמליזציה במהלך הזרימה cytometry </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td> כדי לקבוע כדאיות במהלך הזרימה cytometry </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> מכיל את התאים שיסודרו </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> לאסוף CD34 + / CD19 +(מאוחר פרו-B - מוקדם מראש BI) תאים </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 45 נמוכים </td><td> לאסוף CD34 - / CD19 + / CD45 הנמוך (טרום BI) תאים </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 מד </td><td> לאסוף CD34 - / CD19 + / CD45 (לפני BII) תאי med </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 45 גבוהים </td><td> לאסוף CD34 - / CD19 + / CD45 גבוה (B) תאים לא בשלים </td></tr></tbody></table> מעייל צינורות 4, 5, 6, 7 ועם 2% FBS ולמקם את כל הצינורות על קרח. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את השכבה העליונה בזהירות הפלזמה ולהימנע ממגע עם שכבת תא mononuclear. באמצעות 10 מיליליטר זכוכית פיפטה, להעביר את שכבת תא mononuclear זהירות לצינור חרוטי מ&quot;ל חדש 50. שלב את תאי mononuclear משלושה צינורות יחד לתוך צינור מ&quot;ל אחת 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הצינור עם PBS, מערבב בעדינות וסרכזת ב 300 XG עבור 10 דקות ב20 ° C. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא הגלול. חזור על 1x. לאחר השטיפה הראשונה, resuspend את הכדורים ולהעביר לצינור מיליליטר חרוטי 50 אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות resuspend התא גלול ב 200 μl של PBS. הסר μl 1 להשעית התא, להוסיף אותו ל1 מ&quot;ל של PBS בצינור microcentrifuge מ&quot;ל 1.5 ומניח בצד לספירה (ספירת תאים לאחר ביצוע השעית התא 50 המ&quot;ל בצנטריפוגה). מלא את הצינור עם PBS וסרכזת ב 200 XG במשך 15 דקות כדי להסיר הטסיות. הסר את supernatant לחלוטין מבלי להפריע לתא הגלול. </li></ol> 2. בידוד תא B שונה מתאי mononuclear באמצעות הפרדת MACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגלולה מצעד 1.7 עם קור μl 160 (4 מעלות צלזיוס) חיץ EDTA-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 קוקטייל נוגדני μl B-CLL ביוטין. פיפטה לערבב היטב ודגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים - להוסיף 1 מ&quot;ל קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS לכל 10 מיליון תאים (תאים נוmber קבע בשלב 1.7) וסרכזת ב 300 XG למשך 10 דקות. לשאוב supernatant לחלוטין ואז resuspend התא גלול ב קר μl 320 (4 מעלות צלזיוס) חיץ EDTA-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 microbeads μl אנטי ביוטין, מערבב היטב ודגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים - להוסיף 1 מ&quot;ל קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS לכל 10 מיליון תאים וצנטריפוגות XG בטמפרטורה של 300 למשך 10 דקות. Resuspend עד 100 מיליון תאים ב500 μl של קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS. נפח חיץ בקנה מידה בהתאם למספר תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עמודות מקים ומפרידי מקים בצנטריפוגה (שלב 2.5). הנח עמודת LS בשדה המגנטי של מפריד MACS, להוסיף 3 מ&quot;ל של קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS על העמודה ולאפשר החיץ לטפטף דרך העמודה. השתמש בכלי קיבול לתפוס את הזרימה דרכו. השלך את הזרימה דרכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינור חרוטים 50 מ&quot;ל מתחת לעמודה ופיפטה השעית התא על העמודה. לאפשר את התאים ללא תווית לטפטף through העמודה ולתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. חשוב: אלו הם תאים שישמשו לתיוג נוגדן ומיון תא. אל תמחק את הזרימה דרכו. כדי לשחזר את כל התאים מצעד 2.5, להוסיף מ&quot;ל נוסף של 1 קר (4 ° C) החיץ EDTA-PBS לקירות צינור החרוטים. מערבב בעדינות ופיפטה השעית התא שנותר על העמודה. חזור על 1x. המשך לשלב 2.8 שימוש בתאים ללא תווית שנאספו בצינור החרוטים לאחר שעבר דרך העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צינור החרוטים המכילים תאים ללא תווית עם PBS וצנטריפוגה XG ב 300 למשך 10 דקות. הסר בזהירות את supernatant מבלי להפריע לתא הגלול. הוסיפו 200 μl של חיץ EDTA-PBS ועדינות resuspend התאים. </li></ol> 3. תיוג נוגדן והכנה למיון תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב μl 1 להשעית התא והמקום לצינור כותרתו &quot;כתם&quot; (שלב 1.4). הוסף 500 חיץ μl EDTA-PBS ולאחסן את הצינור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20μl של כל נוגדן (CD19, CD34 ו CD45) למיליון תאים לתוך השעית התא הנותרת. מערבב היטב ומניח את השפופרת בחושך למשך 30 דקות ב RT. נוגדני CD הם צעדים רגישים לאור, להשלים 2-4 עם האורות כבויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות של דגירה עם נוגדנים, לשאוב 40 μl של השעית התא ולמקם אותו לתוך הצינור שכותרתו &quot;7AAD&quot;. הוסף 1 המ&quot;ל PBS לתוך הצינור וצנטריפוגה XG ב 500 במשך 2 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים ב100 μl של חיץ מחייב. הוסף 7 μl של 7AAD (7-Aminoactinomycin D) ודגירה בחושך למשך 10 דקות בRT. במהלך שלב דגירת 10 דקות המלאה 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PBS לראש של הצינור המכיל את התאים הנותרים שכותרתו עם נוגדני CD. צנטריפוגה הצינור ב 500 XG ל3 דקות. הסר את supernatant, להוסיף 500 μl EDTA-PBS חיץ וresuspend התא הגלול. להעביר את כל הנפח של השעית התא לתוך הצינור שכותרתו &quot;+ + +&quot;. כדי לשחזר את כל השעית התאdd 1 חיץ נוסף מ&quot;ל EDTA-PBS לצינור 50 מיליליטר חרוטים והעברה לתוך צינור כותרתו &quot;+ + +&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה (שלב 3.3), להוסיף חיץ מחייב 300 μl לתוך צינור 7AAD. &quot;כתם&quot;, &quot;7AAD&quot; ו &quot;+ + +&quot; דגימות ו&quot; 34 + &quot;,&quot; 45 נמוכים &quot;,&quot; 45 מד &quot;ו&quot; 45 &quot;גבוהים צינורות מוכנים לcytometry זרימה. </li></ol> 4. מיון נייד באמצעות Cytometer התזרים XDP MoFlo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת MoFlo למיון: יישור לייזרים; לייצב זרם אגל; לקבוע עיכוב ירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פקדי פיצויי צבע אחד באמצעות Invitrogen ABC עכבר חרוז ערכה (או דומה) על פי הוראות היצרן. הפעלת פקדי צבע אחד, כדי להתאים את המתחים של ערוצי קרינה להפרדה אופטימלית של אוכלוסיות חיוביות ושליליות. הגדר מקדמי פיצויים ולהחיל פרמטר פיצוי לפרוטוקול אוסף. להקים מחדש מקדמי פיצויים בכל פעם הרבה חדש של נוגדן מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת פרוטוקול כולל חלקות כפי שמוצג באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מדגם כתם, להגדיר מתח ורווח לפיזור קדימה וצד, ולזהות אוכלוסיות קרינה שליליות. בגלל התאוששות הדנ&quot;א היא המטרה של המיון, הסף צריך להיות מוגדר נמוך (≤% 1), כך שפסולת דנ&quot;א המכיל לא לזהם את הדגימות שנאספו. * ודא שמערכת פינוי התרסיס פועלת בכל העת שגרות תאים אנושיים מתנהלים בMoFlo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל aliquot קטן של + + + מדגם (~ 50,000 אירועים) להגדיר את אסטרטגית gating (איור 2). בגלל אבות B-cell לא פיזור זהה להתבגר תאי B, backgate CD19 + ungated / CD34 + אוכלוסייה על עלילת SSC vs FSC כדי להבטיח את שער הלימפוציטים כולל תאים פוטנציאליים Pro-B. מתוך מדגם זה גם להגדיר את אוכלוסיית פלואורסצנטי השלילית ל7AAD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מדגם 7AAD כדי לקבוע כדאיות מדגם. רק תאים למיין במדגם עם כדאיויות גבוהות במלכתחילה (≥ 95%) כתאים מתים יהיה כתם ללא הבחנה ועלול לזהם אוכלוסיות מיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את החלטות מיון לאסוף 4 אוכלוסיות: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 נמוך; CD19 + / CD34 - / CD45 מד; וCD19 + / CD34 - / CD45 גבוה. כלול את הלימפוציטים ושערי אפלית מקטורן בהחלטות המיון של כל האוכלוסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע סתימות בקצה המיון, סינון + + + מדגם דרך מסננת תא 40 מיקרומטר מייד לפני המיון והסינון מחדש אם בכלל צבירה מתרחשת במדגם במהלך מיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין את התאים לתוך צינורות איסוף (שלב 1.4) מצופים 2% FBS ב PBS בבעל צינור מקורר או קרח וגדוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר המיון יושלם, לחלץ דנ&quot;א. </li></ol>

<ol><li>Song, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+%28TDMs%29+with+differential+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression.</a> PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).</li>
<li>Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+The+DNA+methylation+profile+of+tissue-dependent+and+differentially+methylated+regions+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells.</a> Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).</li>
<li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequential+determination+model+of+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The sequential determination model of hematopoiesis.</a> Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).</li>
<li>Clark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subsets+in+normal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subsets in normal bone marrow.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).</li>
<li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow.+II.+Normal+B+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development.</a> Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).</li>
<li>Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+precursors+in+normal+pediatric+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">B-cell precursors in normal pediatric bone marrow.</a> American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).</li>
<li>Tucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+cord+blood+B+cells+functionally+mature%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Are cord blood B cells functionally mature?</a> Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).</li>
<li>Ghia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+of+human+bone+marrow+B+lymphocyte+precursors+by+single-cell+polymerase+chain+reaction+analyses+of+the+rearrangement+status+of+the+immunoglobulin+H+and+L+chain+gene+loci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci.</a> J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).</li>
<li>Noordzij, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+precursor+B-cell+compartment+in+bone+marrow+from+patients+with+X-linked+agammaglobulinemia+compared+with+healthy+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children.</a> Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).</li>
<li>van Zelm, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+gene+rearrangement+steps+are+initiated+in+early+human+precursor+B+cell+subsets+and+correlate+with+specific+transcription+factor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression.</a> J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).</li>
<li>Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIRA+method+for+DNA+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MIRA method for DNA methylation analysis.</a> Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).</li>
<li>Kanof, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).</li>
<li>LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+human+B-cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li>
<li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li>
<li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+immature%2Ftransitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease%3A+correlation+with+increased+IL-7%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li>
</ol>

סופרים אין לי מה לחשוף.

הגורם בעל ההשפעה הגדולה ביותר על הצלחתו של הפרוטוקול הוא הנוכחות של זיהום פסולת. אם מבקש דם מבנק דם טבורים חשוב לי הדם נשלח מייד לאחר גבייה ככל האפשר. בנוסף, דגימות שסווגו כlymphocytosis להכיל מספרים גבוהים יותר של לימפוציטים, אך הדגימות הללו אין מספרים מספיקים של מבשר תאי B ולא צריך להיות בשימוש. כדי להגדיל את ההסתברות לקבלת כמות מספקת של תאים לכל אחת מקבוצות המשנה המבשר אנו ממליצים מתחילים עם לפחות 85 מ&quot;ל של דם טבורים. חשוב לציין כי בניגוד להפרדות דם היקפיות בוגרות, כאשר fractionating דם טבורי שכבת mononuclear לעתים קרובות מזוהמת בתאי דם אדומים 12. פרוטוקול זה כולל שטיפת צעד נוסף כדי להסיר טסיות מזהמות. פרוטוקולים מתארים הפרדות mononuclear מדם הטבורי מציעים כולל לא צעד תמוגהo להסיר תאים אדומים לא רצויים. אנו לא ממליצים על הצעד הזה, כי זה מייצר פסולת מזהמת ויש לו השפעה שלילית על ההצלחה של סוג התא. על מנת להקטין את מספר התאים שצריכים להיות מכובדים על ידי הזרימה cytometry יש צורך לבצע העשרת תא B לפני מיון תא. הפרוטוקול המסופק על ידי Miltenyi BIOTEC, המלווה את ערכת בידוד תא B (B-CLL), כבר מותאם לדם היקפי וממליץ להשתמש 10 קוקטייל μl B-CLL ביוטין נוגדן לכל 10 מיליון תאים. צעד זה נעשה שימוש בנוגדנים נגד CD2 (תאי T, תאי NK), CD4 (תאי T), CD11b (גרנולוציטים; מונוציטים; מקרופגים), CD16 (תאי NK; מקרופגים; תאי פיטום), CD36 (טסיות דם), CD235a (תאי erythroid) כדי לרוקן את התאים שאינם B מדם חבל הטבור. חשוב להשתמש בערכה שתוארה ולא ב-צינוק הערכה השנייה כי הערכה לשעבר מכילה נוגדנים נגד CD43 אשר שוהים בתאים פרו-B. במהלך אופtimization של פרוטוקול זה, מצא כי סכום כולל של 40 μl של קוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL הוא מספיק כדי לייצר תוצאת סוג תא חיובית. בנוסף מצאנו כי שימוש μl קטן כמו 5 יותר מקוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL היו השפעות שליליות על סוג התא. לכן, מומלץ מאוד להשתמש ב 40 μl של קוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL למספרים סלולריים mononuclear כלל בין 175-250000000. אם מתחיל עם מספרים נמוכים יותר או גבוהים יותר של תאים ייתכן שיהיה צורך להרחיב את ריאגנטים בהתאם. יש פרסומים סותרים רבים המתארים את הסמנים שיכולים לשמש כדי להבדיל תת אוכלוסיות של תאי B. רוב הפער יכול להיות מוסבר על ידי העובדה שבידול הוא תהליך מתמשך, וכי נוכחותו או היעדריו של סמנים בתא שטח מתרחשת באופן הדרגתי ולא באופן הכל או לא כלום. בפרוטוקול זה CD34 - / CD19 + ורמת האינטנסיביות של CD45 + (ביטוי נמוך, בינוני, גבוה) שמש להבחין מראש BI, B-תאים טרום BII ובוגרים עם עלייה ברמה של CD45 ביטוי מקביל להתקדמות של בידול 6. תאי Pro-B כבר תואר על ידי כמה להיות CD19 + / CD34 + 13 בעוד שאחרים הראו כי תאים פרו-B CD19 - / CD34 + ותאים טרום BI הם CD19 + / CD34 + 9,10. בהתבסס על פערים אלה יש לנו מיועדים לCD19 + / CD34 + תאים כמו תאים פרו-B מאוחרים / תאים מוקדמים מראש BI. חשוב לציין כי אסטרטגיה זו פותחה לבודד תת קבוצות של מבשר תאי B המתאים לתאים המושפעים מלוקמיה לימפובלסטית המחלה החריפה. עם זאת, ישנן אסטרטגיות מיון מרובות שעשויה להיות מועסק בהתאם לתת סוג התא של עניין. שילובי נוגדנים fluorochrome צריכים להיות נבחר על סמך היכולות של סדרן התא הזמין. כgeneraאני ככלל, fluorochrome הבהיר ביותר בלוח שלך יש להשתמש כדי לתייג את האנטיגן לפחות מאוכלס, ולהיפך. באיתור אוכלוסיות כפולות מוכתמות, במיוחד אירועים נדירים כגון אלה, אפלית כפיל (האיור 2B) היא חלק חשוב ביותר של אסטרטגית gating. הדבר מבטיח כי אירועים כפולים חיוביים הם באמת תאים בודדים מגואלים בשני נוגדנים ולא רק שני תאים בודדים מוכתמים דבקו זה לזה. מהירות גבוהה, מיון תא 4-way בהכרח יוצרת סביבת אירוסול מבוקרת. לכן, מיון תא אנושי חי צריך להתבצע בזהירות רבה. פורסמו הנחיות בטיחות וטיהור זמינות ויש לבחון וליישם לפני הסוג 14. אישור מועדות biosafety מוסדיות או מקביליהם ייתכן שיידרש קודם למיון. לטיהור נאותה לאחר מיון, אקונומיקה, יש להוסיף למכל הפסולת לריכוז סופי של 10%. סיmilarly, כל צינורות דגימות, כמו גם את כל המשטחים בסביבה הקרובה יש לטהר ביסודיות עם 10% תמיסת כלור טרי. לסיכום, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה להשגת אוכלוסיות נדירות של מבשר תאי B וניתן לשנותו לבודד אוכלוסייה נוכחת בדם טבורים כוללים תאי גזע hematopoietic ובשל תאי T נדיר. לאחרונה, תאי B בשלים זוהו בדם ההיקפי של אנשים עם מתקדם 15-HIV. לפיכך, התועלת שבשיטה זו מאריכה מעבר למחקר של סרטן הדם. לבסוף, יש לנו עדיין לא בצעו בידודי RNA בתאים הממוינים הזרימה, אך שיטה זו צריכה להיות התאמה שיש לשים לב כי בתא מיון התאים אמורים להיות מיון ישירות לתוך trizol או פתרון תואם מקביל RNA כגון RLT מערכת RNeasy זמין דרך Qiagen.

על מנת לזהות את הסטיות שנמצאות במחלה, חשוב וחיוני שאנו משתמשים רקמות או תאים שמתאימים לסוג הרקמה או תא המושפע מהמחלה בריאות. אחת סיבות לכך היא שוריאצית epigenetic בין סוגי רקמות היא אחראית לויסות התבטאות של גנים שהן קריטי להתמיינות תאים במהלך ההתפתחות האנושית 1,2 הנורמלי. סיבה שנייה היא שהרגולציה של הגנים ספציפית החריגה הרקמה עלולה להיות השלכות חמורות על התפתחות נורמלית וידועה לתרום למספר רב של מצבי מחלה, כוללים סרטן. לכן, הבנה טובה יותר של מחלה המערבת תאי hematopoietic דורשת ידע בתאי hematopoietic בריאים. הפיתוח של תאי hematopoietic בתמורת מח העצם באמצעות סדר שיטתי של אירועים המתאפיינים בשינויים בביטוי של סמנים פני תא 3. מחקרים שכלל משתתף מבוגרים ישהראה כי מוח עצם מכיל בדרך כלל מספר נמוך של מבשר תאי B 4,5, ואילו מחקרים שכלל ילדי משתתפים הראו כי אחוז מבשר תאי B הוא גבוה יחסית אצל אנשים פחות מ 5 שנים של גיל 6. דם חבל טבור משמש כמקור לתאי גזע hematopoietic בטיפול בהפרעות ומחלות ממאירות הקשורות בדם, הוא זמין דרך בנקי דם טבורים ומועשר לB לא בוגר ותאי T 7 שהם תאי המטרה של הפרעות רבות, כולל לוקמיה ו לימפומה. מבשר תאי B במח העצם כבר phenotyped הרחבת 8,9 ויכול להיות מוגדר על ידי הנוכחות של סמנים בתא שטח ספציפיים שניתן להשתמש בם כדי למיין תאים אלה לקבוצות משנה נפרדות. תמורה נורמלית B-cell בידול באמצעות סדרה של שלבים במח העצם, החלו בתאים המוקדמים פרו-B וכלה בתאי B בשלים או נאיביים. פיולאן Zelm ועמיתים 10, תאים פרו-B מאופיינים על ידי הנוכחות של CD34 ובמעבר לשלב 2 (Pre-BI) CD19 נרכש. שלב 3 (Pre-BII) תאים אינם מפורשים CD34 ולהתחיל לבטא IgM cytoplasmic. לבסוף, מאפיין בולט של שלב 4 (לא בוגר תאי B) הוא הביטוי של IgM פני שטח. אסטרטגית המיון המתואר בפרוטוקול זה תואר לראשונה על ידי קאלדוול ועמיתים 6 וכוללת את השימוש של רק 3 סמנים בתא שטח אשר מקטינים מאוד את המורכבות והעלות של ביצוע ניסויי מיון תא. בעבודתם, יחסים בין CD45 ושלבי התמיינות תא B הוקמו. הם הבחינו כי B-תאים במח עצם הצגת רמות משתנות של ביטוי של CD45. באופן ספציפי, תאים שהביעו רמות גבוהות של CD45 התכתבו לתאים המבטאים את IgM משטח (-B תאים לא בשלים), אלה שהביעו רמה בינונית של CD45 התכתבו לתאים שהביעו cytoplasmic IgM (תאים טרום BII), ואלה שהביעו רמות נמוכות של CD45 התכתב לתאים שלא מבטאים IgM cytoplasmic (תאים טרום BI). פרוטוקול זה משתמש באסטרטגיה שפותחה על ידי קאלדוול ועמיתים 6 לבודד תת קבוצות של מבשר תאי B מדם הטבורי (איור 1) אשר ניתן להשתמש במבחנים הדורשים זרם חומצות גרעין באיכות גבוהה כגון assay התאוששות האי מפוגל-CPG (מירה ) 11 ומבחנים PCR כמותיים בזמן אמת. השיטה מעסיקה הפרדה ראשונית באמצעות חרוזים מגנטיים לרוקן את כל התאים שאינם B מדם חבל טבור ודורשת הכתמה עם רק 3 נוגדנים (CD34, CD19 וCD45). התאים שהם התאוששו מייצגים 4 שלבי התמיינות תא B: 1) CD34 +; CD19 + (מאוחר פרו B-ובתחילה מראש BI), 2) CD34 -; CD19 +; CD45 הנמוך (מאוחר מראש BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 מד (לפני BII); ו4) CD34 -; CD19 +; CD45 גבוה (לא בשל תאי B).

<table><tbody><tr><td>DPBS (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>LS טור</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multi Stand</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>מפריד MidiMACS</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד תאי B (B CLL)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-660</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)</td><td>MIDSCI</td><td>SS1500</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>DB Pharmingen APC עכבר אנטי-אנושי CD19</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555415</tr><tr><td>DB Pharmingen PE עכבר אנטי אנושי CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>560941</td><td></td></tr><tr><td>CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS פתרון שטיפה</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock</td><td>Solution MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 מ"ל שפופרת</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td><td>בקמן קולטר</td><td>CY30230</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck חרוזי יישור</td><td>בקמן קולטר</td><td>6605359</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow Alignment חרוזים</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>ViroSafe אירוסול פינוי מסנן</td><td>בקמן ערכת</td> חרוזי עכבר קולטר <td>ML01330</td><td></td></tr><tr><td>ABC</td><td>Invitrogen</td><td>A-10344</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; מסננת תאים m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>פישר המוציטומטר מדעי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>accuSpin דגם 3R צנטריפוגה ספסל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-100-516</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP זרימה ציטומטר</td><td>בקמן קולטר</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>יחידת פינוי אירוסול</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של קבוצות משנה מבשר b-cell מדם טבורים

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

דם חבל טבור מועשר לתאי אבות היווצרות דם בשלבי מחויבות שושלת שונים. פתחנו פרוטוקול לבידוד מבשר תאי B בארבעה שלבים שונים של בידול. בגלל גנים בא לידי ביטוי ושינויי epigenetic להתרחש באופן ספציפי רקמות, הוא חיוני, כדי להבדיל בין רקמות וסוגי תאים כדי להיות מסוגל לזהות שינויים בגנום וepigenome שעלול להוביל להתפתחות של מחלה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לכל סוג של תא בהווה דם טבורים בכל שלב של דיפרנציאציה. שיטה זו כוללת 4 שלבים עיקריים. ראשית, תאי mononuclear מופרדים על ידי צנטריפוגה צפיפות. שנית, תאי B מועשרים באמצעות נוגדנים מצומדות ביוטין שמכירים ולהסיר תאי B שאינם מתאי mononuclear. שלישית את B-תאים מסומנים fluorescently עם נוגדני חלבון בתא שטח ספציפיים לשלבים בודדיםהתפתחות תא B-. לבסוף, את התאים שכותרתו fluorescently מסודרים ואוכלוסיות בודדות הם התאוששו. התאים התאוששו הם בכמות ובאיכות מספקות כדי להיות מנוצלת במבחני חומצות גרעין במורד זרם.

בין מדגם וריאציה משחקת תפקיד בהצלחה של מיון התא (טבלה 1). את הדגימות עם שיעורי הצלחה טובים יש רמות נמוכות של פסולת מזהמת (איור 3 א) ואת הדגימות עם שיעורי הצלחת עניים יש רמות גבוהות של פסולת מזהמת (איור 3 ב &#39;). בין מדגם וריאציה ניתן לשלוט במידה מסוימת אם דגימת דם הטבורים שנאספה תוך 24 שעות ממשלוח (העדיפות הראשונה O / N). התאים הממוינים הזרימה מכל תת מבשר תא B הם כמות ובאיכות לביצוע בידודי חומצות גרעין מספיק. דנ&quot;א המבודד הוא באיכות גבוהה והוא יכול לשמש בניתוחים במורד זרם. אנחנו באופן שגרתי לנצל דנ&quot;א זה ב11 מירה להעשיר לDNA מפוגל (איור 4). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נתוני מתקן דם טבורים </td><td> מיין עניים </td><td><strong&gt; מיין טוב </td></tr><tr><td> נפח עבודת דם עם נוגד קרישה (מ&quot;ל) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> תאי דם לבנים [10 3 / μl] </td><td> 8.68 </td><td> 11.19 </td></tr><tr><td> הלימפוציטים [10 3 / μl] </td><td> 3.88 </td><td> 3.76 </td></tr><tr><td> הלימפוציטים (%) </td><td> 44.70 </td><td> 33.6 </td></tr><tr><td> תאי דם אדומים [10 6 / μl] </td><td> 3.65 </td><td> 3.05 </td></tr><tr><td colspan="3"> נתונים בתוך הבית </td></tr><tr><td> מספר סלולרי לאחר Ficoll-Paque </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> מספר סלולרי לאחר הפרדת MACS </td><td> ז 22 </td><td> 16.5 M </td></tr><tr><td> רוזן אירועים סה&quot;כ (MoFlo XDP) </td><td> 30.57 M </td><td> 19.97 M </td></tr><tr><td> כדאיות (%) </td><td> 98.00 </td><td> 98.00 </td></tr><tr><td> תאים בשער ימפוציט (%) </td&gt; <td> 17.00 </td><td> 50.00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> סה&quot;כ מספר סלולרי </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> % של סה&quot;כ אירועים </td><td> 0.04 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> יעילות </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 הנמוך </td></tr><tr><td> סה&quot;כ מספר סלולרי </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> % של סה&quot;כ אירועים </td><td> 0.05 </td><td> 0.13 </td></tr><tr><td> יעילות </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 רפואה </td></tr><tr><td> סה&quot;כ מספר סלולרי </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> % של סה&quot;כ אירועים </td><td> 1.54 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td> יעילות </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 הגבוה </td></tr><tr><td> סה&quot;כ מספר סלולרי </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> % של סה&quot;כ אירועים </td><td> 6.2 </td><td> 10.25 </td></tr><tr><td> יעילות </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> טבלת 1. סטטיסטיקת נציג תא מיון. 1-5 שורות הן ספירות הניתנות על ידי מתקן דם הטבורים. את השורות שנותרו הן נתונים שנאספו במעבדה שלנו. עלובים הכיל רמות גבוהות של פסולת ואחוז נמוך של תאי הלימפוציטים בשער. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> Figuמחדש 1. תרשים זרימה של הליך. דם טבורי מעובד ותאי mononuclear מבודדים באמצעות תוספת Ficoll-paque. צעד לשטוף נוסף כלול להסיר טסיות מזהמות. תאי B מבודדים מתאי mononuclear באמצעות ערכת MACS האנושית B-תא הבידוד (B-CLL). צעד זה נעשה שימוש בנוגדנים חד שבטי ביוטין-מצומדות (CD2, CD4, CD11b, CD36, Anti-IgE וCD235a) כדי להסיר את כל התאים שאינם B. את B-התאים התאוששו מסומנים עם CD19-APC, CD34-PE ונוגדני CD45-FITC לאחר מכן ממוינים באמצעות cytometer MoFlo XDP הזרימה להתאושש תת מבשר B-cell: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 נמוך ; CD19 + / CD34 - / CD45 מד; וCD19 + / CD34 - / CD45 גבוה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> איור 2. אסטרטגית gating לזיהוי ומיון פופulations. חיצים אדומים מציין את השער שחל על מגרש בהמשך. R4, R5, R6 וR7 שערים מצביעים אוכלוסיות ממוינות.) קדימה לעומת עלילת פיזור צד הצגת אוכלוסיית הלימפוציטים מועשרים. שער R1, הלימפוציטים. ב) גובה מול רוחב של עלילת פיזור קדימה לזיהוי תאים לעומת כפילויות בודדות. R2 שער, תא בודד. ג) תאים חיוביים CD19-APC לנפול לאוכלוסיות CD34-PE שליליות וחיוביות. R3, CD19 + / CD34 - שער; R4, CD19 + / CD34 + אוכלוסיית מין רצוי המציין שער ד) CD19 + / CD34 - תאים מתחלקים לשלוש אוכלוסיות שונות במקצת CD45-FITC.. R5 ו R6, CD19 + / CD34 - / CD45 נמוך וCD19 + / CD34 - / CD45 אוכלוסיות med, בהתאמה. R7, בגלל מספר תאים גבוה בCD19 + / CD34 - / CD45 אוכלוסייה גבוהה, שער מסוג זה מקיף רקחלק מהאוכלוסייה. כל התאים של אוכלוסייה זו לא צריכות להיות שנאספו עבור ניתוחים במורד זרם. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> איור 3.) רמות נמוכות של זיהום פסולת לאחר העשרת עמודה. R1, שער לימפוציטים. ב) רמות גבוהות של זיהום פסולת לאחר העשרת עמודה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> איור 4. העשרה של DNA המפוגל מתת קבוצות של מבשר תאי B. DNA) sonicated המבודד מתת מבשר B-cell היא באיכות גבוהה. לדנ&quot;א בניית הספרייה sonicated לממוצע של 200-600 נקודתי בסיס. 1 ליין: 100 סולם Promega נ&quot;ב (קטלוג # G2101); ליין 2: DNA סה&quot;כ מבודדים מCD19 + / CD34 + תאים; 3 ליין: DNA סה&quot;כ מבודדים מCD19 + </sעד&gt; / CD34 - / תאי CD45 נמוכים; ליין 4: 100 ng DNA המבודד מCD19 + / CD34 - / תאי CD45 מד; ליין 5: 100 ng DNA המבודד מCD19 + / CD34 - CD45 / תאים גבוהים. DNA היה sonicated באמצעות Bioruptor Diagenode על גבוה עבור סכום כולל של 9 דקות (30 שניות על; 30 השניות OFF). ה-DNA הייתה מטוהרת עמודה ומדמיינת על 1% agarose ג&#39;ל עם ג&#39;ל חומצות גרעין SYBR הכתם הירוק. ב) לאחר מירה באמצעות ActivMotif MethylCollector Ultra הערכה, PCR עם SLC25A37 (1-6) וAPC1 (7-12) מבוצע כדי לאשר העשרה של DNA המפוגל. 1 &amp; 7: DNA sonicated גנומית (לא מירה); 2 &amp; 8: מירה-CD19 + / CD34 + DNA; 3 &amp; 9: מירה-CD19 + / CD34 - / CD45-DNA הנמוך; 4 &amp; 10: מירה-CD19 + / CD34 - / CD45 התרופה ה-DNA; 5 &amp; 11: מירה -CD19 + / CD34 - / CD45-DNA גבוה; 6 &amp; 12: שליטת מים. הגברה גבוהה יותר של SLC25A37 מאשרת את ההעשרה של ה-DNA המפוגלבתת קבוצות של מבשר תאי B.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תת קבוצות של מבשר B-תאים מדם הטבורי. כמות ואיכות מספקת של חומצות גרעין עשויה להיות מופקים מהתאים והשתמשו במבחנים הבאים ניצול DNA או RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד תתי-אוכלוסיות של תאי B פרוקורסורים מדם חבל טורי. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד תאים חד-גרעיניים מדם חבל טורי באמצעות סרכוז במדרג צפיפות. בשלב השני, אנטיגנים על פני השטח של התאים מסומנים עם נוגדנים מצומדים לביוטין כדי להסיר באופן מגנטי את כל תאי ה-non B שנותרו.בשלב הבא, תאי ה-B המבודדים מסומנים פלואורסצנטית באמצעות נוגדנים נגד האנטיגנים CD 19, CD 34 ו-CD 45 על פני השטח של התא. בשלב האחרון, התאים ממוינים באמצעות ציטומטריית זרימה כדי להפיק את תתי-אוכלוסיות תאי ה-B הקדמוניים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תאים במספר ובאיכות מספקים לשימוש בבדיקות המשך הדורשות DNA ו-RNA באיכות גבוהה.יתרון אחד של אסטרטגיית מיון התאים על פני שיטות חלופיות הוא שאסטרטגיה זו דורשת פחות זמן במכשיר ה-flow cytometer ורק שלושה נוגדנים פלואורסצנטיים, מה שמפחית משמעותית את עלות הניסוי. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשרו עם מגוון השיטות הזמינות להכנת תאי דם משפורה עבור flow cytometry ועם מורכבות הכנת ה-flow Cytometer. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תאי B מקדימים בריאים, ניתן ליישמה גם על סוגי תאים אחרים הנמצאים בדם שפורה, כגון תאי T, או למחקרים של מחלות המערבות תאים המטופואטיים כלשהם, כגון לוקמיה או לימפומה.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שקשה לתאר את הטכניקות הנכונות הנדרשות לעיבוד דם ותאי חבל טרור בצורה שתמקסם את חיוניות התאים ותפחית את נוכחותם של שאריות מזוהמות. כדי לבודד תאים חד-גרעיניים מדם חבל טרור, יש לדלל תחילה מנות של 8 ml של דם חבל טרור ב-24 ml של DPBS. לאחר מכן, יש להוסיף בזהירות ובאיטיות כל תערובת דם מדוללת כשכבה מעל מנות של 15 ml של fipa plus במבחנות קוניות של 50 ml, תוך הקפדה על הפרדה בין השכבות.בשלב הבא, סבב את הדם בצנטריפוגה למשך 40 דקות ב-400 ×g ובטמפרטורה של 20 °C, בזמן שהתאים מופרדים על ידי מדרג צפיפות. סמן שבעה מבחנות בעלות תחתית עגולה בנפח 50 mL עם מזהה הדגימה, התאריך וכל מידע רלוונטי אחר כפי שמפורט בטבלה. לאחר ההפרדה, התאים חד-גרעיניים יישארו בממשק העכור בין הפלזמה לשכבה הבאה, בעוד שהגרנולוציטים והאריתרוציטים ישקעו. כעת, שאב את שכבות הפלזמה העליונות, תוך הימנעות ממגע עם שכבות התאים חד-גרעיניים. לאחר מכן, השתמש בפיפטת זכוכית של 10 mL כדי לאסוף בזהירות את שכבות התאים חד-גרעיניים משלוש ממבחנות ה-50 mL אל תוך מבחנת 50 mL חדשה אחת.מלאו את המבחנה החדשה ב-PBS, ערבבו בעדינות את תרחיף התאים ולאחר מכן שטפו את התאים פעמיים למשך 10 דקות ב-300 ×g ובטמפרטורה של 20 °C. לאחר השטיפה הראשונה, השביו את המשקעים לתרחיף והעבירו למבחנה קונית אחת של 50 milliliter. לאחר השטיפה השנייה, השביו בעדינות את משקע התאים ל-200 µL של PBS והעבירו 1 µL מתרחיף התאים ל-1 milliliter של PBS במבחנה למיקרוצנטריפוגה של 1.5 milliliter לצורך ספירה.לאחר מכן, שטפו את התאים בתוך המבחנה בנפח 50 milliliter עם PBS נוסף, והסירו לחלוטין את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע (pellet). כדי לבודד את תאי ה-B מהתאים המונונוקלאריים, השעו תחילה את המשקע ששטוף זה עתה ב-160 microliters של באפר DGAs E-D-T-A-P-B-S שהוכן טרי בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius.לאחר מכן, ערבבו 40 µL של תערובת הנוגדים bio ITIN מתוך ערכת בידוד תאי B עם תרחיף התאים. לאחר דגירה של התאים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C, שטפו את הנוגדים החופשיים באמצעות 1 mL של בופר E-D-T-A-P-B-S בטמפרטורה של 4 °C לכל 10 מיליון תאים. לאחר מכן, השהו שוב את משקע התאים ב-320 µL של בופר E-D-T-A-P-B-S בטמפרטורה של 4 °C.כעת ערבבו 80 µL של חרוזי מיקרו אנטי-ביוטין עם תרחיף התאים לאחר דגירה של 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C. שטפו את התאים שוב בעודם בסחרור. הניחו עמודת LS בשדה המגנטי של Max Separator וטפטפו 3 mL של בופר EDTA-PBS בטמפרטורה של 4 °C דרך העמודה.בשלב הבא, השביה מחדש עד 100 מיליון מהתאים השטופים ב-500 µL של באפר E-D-T-A-P-B-S בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, העבר בפיפט את תרחיף התאים אל העמודה, תוך איסוף התאים שאינם מסומנים העוברים דרך העמודה לתוך מבחנה קונית של 50 mL. הוסף 2 mL נוספים של באפר E-D-T-A-P-B-S בטמפרטורה של 4 °C לדפנות המבחנה הקונית המקורית, בתוספת של 1 mL בכל פעם, ולאחר מכן ערבב בעדינות והעבר בפיפט את שארית תרחיף התאים אל העמודה בכל פעם, כדי להבטיח את השחזור של כל התאים.לבסוף, מלאו את המבחנה הקונית המכילה את התאים שאינם מסומנים ב-PBS. לאחר הצנטריפוגה, הסירו בזהירות את הנוזל העליון מבלי להפריע למשקע התאים. לאחר מכן, השביו בעדינות את התאים ב-200 µL של תמיפת E-D-T-A-P-B-S.התחילו את סימון הנוגדנים. השלב הראשון הוא העברה של 1 µL מתליהי התאים למבחנה המסומנת שאינה צבועה. הוסיפו למבחנה 500 µL של תמיסת E-D-T-A-P-B-S ושמרו אותה על קרח.כבו את כל האורות ולאחר מכן הוסיפו לתלי suspension התאים שנותר 20 microliters של נוגדנים ל-CD 19, CD 34 ו-CD 45 לכל מיליון תאים. ערבבבו היטב והניחו את המבחנה בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו 40 microliters של תלי suspension התאים המסומן בנוגדנים למבחנה המסומנת ב-A a D.שטפו את התאים ב-1 ml של PBS ולאחר מכן השעיו מחדש את המשקע ב-100 µl של תמיסת קישור (binding buffer). הוסיפו שבעה µl של 7-AAD לתאים אלו ולאחר מכן הדגירו אותם בחושך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזמן שהתאים מסומנים ב-7-AAD. מלאו את השפופרת של התאים המסומנים בנוגדנים ב-PBS, שטפו את התאים המסומנים בנוגדנים ולאחר מכן השעיו מחדש את המשקע ב-500 µl של תמיסת EDTA-PBS. כעת העבירו את כל נפח תרחיף התאים המסומנים בנוגדנים לשפופרת המסומנת כ-CD19 positive CD34 positive CD45 positive.שטפו את המבחנה עם מיליליטר נוסף של בופר E-D-T-A-P-B-S והעבירו את תרחיף התאים הנותר למבחנה המסומנת כ-CD 19 positive CD 34 positive CD 45 positive. לבסוף, הוסיפו 300 microliters של בופר קישור למבחנה seven A a D כדי למיין את התאים באמצעות ה-MO flow XDP flow cytometer. ראשית, הגדירו את ה-MO flow למיון, הריצו בקרות קומפנסציה מתאימות ולאחר מכן צרו פרוטוקול הכולל תרשימים כפי שמוצג באיור זה.יש לוודא שמערכת פינוי האيروسול פועלת בכל עת, ולאחר מכן להשתמש בדגימה שאינה צבועה כדי לקבוע את המתח (voltage) וההגבר (gain) עבור תרשימי הפיזור הקדמי והצידי (forward and side scatter plots). כדי לזהות את אוכלוסיות הפלואורסצנציה השלילית, הגדירו את הסף (threshold) ל-1% ומטה, כך ששרידים המכילים DNA לא יזהמו את הדגימות שהופקו.הריצו כ-50,000 אירועים של הדגימה החיובית ל-CD 19, חיובית ל-CD 34 וחיובית ל-CD 45. כדי להגדיר את אסטרטגיית הגייט (gating) כפי שהודגם הרגע, בצעו back gating של אוכלוסיית התאים החיובית ל-CD 19 וחיובית ל-CD 34 שלא עברה גייטינג על גרף ה-side scatter מול ה-forward scatter. זאת כדי לוודא שגייט הלימפוציטים כולל תאי pro B פוטנציאליים.השתמשו בדגימה זו גם כדי לקבוע את אוכלוסיית הפלואורסצנציה השלילית עבור הצביעה ב-7-AAD. לאחר מכן, הריצו את דגימת ה-7-AAD כדי לקבוע את חיוניות הדגימה; מיינו תאים רק מדגימה בעלת חיוניות של 95% ומעלה בתחילת התהליך, שכן תאים מתים ייצבעו ללא הבחנה ועלולים לזהם את אוכלוסיות המיון. כעת הגדירו את החלטות המיון לאיסוף של ארבע אוכלוסיות: CD19 positive, CD34 positive; CD19 positive, CD34 negative, CD45 low; CD19 positive, CD34 negative, CD45 medium; ו-CD19 positive, CD34 negative, CD45 high.כללו את שערי ההבחנה (discrimination gates) של הלימפוציטים והדאבלטים בהחלטות המיון של כל האוכלוסיות כדי למנוע סתימות. בשלב קצה המיון, סננו את הדגימה החיובית ל-CD 19, CD 34 ו-CD 45 דרך מסננת תאים של 40 micron מיד לפני המיון. לאחר מכן, הניחו מבחנות איסוף מסומנות המצופות ב-2%FBS ב-PBS במחזיק מבחנות עם קרח, ומיינו את התאים למבחנת האיסוף המתאימה מיד לאחר השלמת המיון.חלץ את ה-DNA; לשונות בין הדגימות יש תפקיד בהצלחת התא, מיין במיון טוב. ישנו אחוז גבוה של תאים בשער הלימפוציטים. דגימות עם שיעורי הצלחה גבוהים מכילות רמות נמוכות של פסולת מזוהמת, כפי שמעיד מספר האירועים הנמוך הנופל מתחת ושמאלה מאוכלוסיית הלימפוציטים המסומנת.הדגימות עם שיעורי ההצלחה הנמוכים מכילות רמות גבוהות של פסולת מזוהמת. דגימות באיכות נמוכה מראות עלייה ניכרת באירועים אלו. התאים שעברו מיון באמצעות זרימה (flow sorted) וה-DNA שבודד לאחר מכן מכל תת-אוכלוסייה של תאי B מקדימים (precursor B-cell), הם בכמות ובאיכות המאפשרות ביצוע של ניתוחים המשכיים.השתמשנו באופן שגרתי ב-Myra כדי להעשיר DNA מתילטור מתוך DNA שבודד מתאי CD 19 positive CD 34 positive, תאי CD 19 positive, CD 34 negative CD 45 low, תאי CD 19 positive, CD 34 negative CD 45 medium ותאי CD 19 positive CD 34 Negative CD 45 high. הדגימות עברו סוניקציה בעוצמה גבוהה למשך תשעה דקות בסך הכל, טיהור בעמודה, ולאחר מכן ויזואליזציה על ג'ל agarose בריכוז 1% עם צבע nucleic acid ג'ל מסוג cyber green. בנתיב זה הורץ גם סולם בקרה של 100 base pair. לאחר Myra, תוך שימוש בערכה collector ultra kit PCR של active motif, בוצע PCR עם הגנים SLC 25 A 37 מתילטורים כביקורת והגנים APC one לא-מתילטורים כביקורת כדי לאשר את העשרת ה-DNA המתילטור.ההגברה הגבוהה יותר של SLC 25. A 37 מאשרת את העשרת ה-DNA הממתיל בתתי-אוכלוסיות של תאי B מקדימים. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 10 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להתייחס לתאים בעדינות רבה ולהשתמש בכמות אופטימלית של נוגדנים כדי למזער את היווצרות פסולת מזוהמת בעקבות פרוצדורה זו.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ריצוף מהדור הבא (next generation sequencing), כדי לענות על שאלות נוספות, כמו אילו גנים עברו מתילציה ומהן תתי-האוכלוסיות של תאי B מקדימים. זכרו כי עבודה עם תאי אדם חיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות, כגון הפעלת מערכת לפינוי אירוסולים, בכל עת בעת ביצוע פרוצדורה זו.

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מתארים אימון הראשון הטוב הייצור (GMP)-תואמת שיטה של ​​ייצור תאי T ציטוטוקסיים וירוס ספציפיים (CTL) מדם טבורים, מקור לתאי T בעיקר נאיביים.

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

הסרטון מסביר דרך לטהר תאי B על ידי מיקוד אימונומגנטי והפרדה מהשעיית תאי דם חד-גרעיניים היקפיים. השיטה כוללת סימון סוגי תאים לא רצויים עם נוגדנים או ליגנדים ספציפיים (הקשורים לחלקיקים מגנטיים) המכוונים לחלבונים ספציפיים על פני התא, כדי להתרוקן מתרחיף התא ההטרוגני על ידי הפרדה מגנטית.

ברירה אימונומגנטית שלילית: שיטה לטיהור תאי B מתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

בסרטון זה אנו מדגימים את הבידוד של תאי B מדם היקפי אנושי באמצעות נוגדנים ביוטיניליים ספציפיים לתאים שאינם מסוג B ומיקרו-כדוריות מגנטיות מצומדות סטרפטווידין.

בידוד וטיהור תאי B מדם היקפי אנושי

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת עכברי מערכת החיסון האנושית (HIS). CD34+ תאי גזע hematopoietic (HSC) מבודדים מתאי מעיל דם טבורי אנושי באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים. CD34+ HSCs מורחבים במדיום גידול מועשר בציטוקינים ונשמר בהקפאה. לבסוף, HSCs מופשרים מוזרקים לתוך גור עכבר מדוכא חיסון כדי לבסס את מודל העכבר שלו.

בידוד תאי גזע המטופויטיים מדם טבורי ליצירת עכברי מערכת החיסון האנושית

כאן, אנו מספקים פרוטוקול אופטימלי לבידוד ושיבוט של ישות תאי T הנדירה של תאי T Vδ1+CD4+ היקפיים, שהיא, כפי שהראינו לאחרונה, אב תאי T αβ חוץ-תימיים. טכניקה זו מאפשרת לבודד כמותי, לשכפל ולהרחיב ביעילות תאים אלה בתרבית ex vivo.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

דם היקפי אנושי משמש בדרך כלל להערכת התגובה החיסונית ההומורלית. כאן, מתוארות השיטות לבידוד תאי B אנושיים מדם היקפי, התמיינות תאי B אנושיים לתאי B מפרישי נוגדנים (AB) (ASCs) בתרבית, וספירת סך ה-IgM וה-IgG-ASCs באמצעות בדיקת ELISpot.

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

אוכלוסיה מאוד טהור של megakaryocytes ניתן להשיג כבל דם-derived CD34+ תאים. שיטה CD34+ בידוד תאית התמיינות מגקריוציט מתואר כאן.

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור האפיון האימונוophenic ו ציטוקינים המושרה בידול של דם טבורי הנגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל לארבעה הלישנים מיאלואידים. היישומים של פרוטוקול זה כוללים חקירות על ההשפעה של מוטציות המחלה מיאלואידית או מולקולות קטנות על הבידול מיאלואיד של CD34+ תאים.

פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל

אנו מציגים פרוטוקול פשוט לבידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי מדם שלם המתקבל מחולים שאובחנו עם תסמונת סזארי, ולאחר מכן בחירה של תאי CD4+ T, הגירוי שלהם עם phorbol12-myristate13-acetate ו-A23187 ionophore, והכנת RNA ליצירת פרופיל שעתוק.

בידוד תאים חד-גרעיניים של דם היקפי אנושי ותאי T מסוג CD4+ מחולי תסמונת סזארי לצורך פרופיל תעתיק

פרוטוקול זה מפרט שיטה תואמת אוטומציה בתפוקה גבוהה לבידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים למטרות ביו-בנקאות ולמטרות אחרות.

בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים ממעילי באפי באמצעות הפרדת חרוזים אימונומגנטית בתפוקה גבוהה

למד לבודד תת-קבוצות של תאי B מקדמים מדם טבורי באמצעות צנטריפוגה בגרדיאנט צפיפות ומיון ציטומטרי זרימה. שיטה זו מספקת חומצות גרעין איכותיות לניסויים במחקר התפתחות החיסון.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

גלה סרטונים נוספים