בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי אב אנדותל מדם טבורי אנושי. שיטה זו מתארת בידוד של תאי אב אנדותל מדם טבורי לשימושם הפוטנציאלי כתאים אוטולוגיים להנדסת רקמות של שתלי כלי דם. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שניתן לבצע את הליך הבידוד במדיה מיוחדת ללא צורך במיון אמינו כלשהו.

ניתן להשתמש בתאי האב האנדותליים המבודדים לחקר ניאו-וסקולריזציה, ודיווחים הציעו גם כי תאים אלה יכולים לשמש כסמנים ביולוגיים לזיהוי חולים עם סיכון למחלות לב וכלי דם. לפני שמתחילים בהליך הבידוד, יש לצפות מראש שש צלחות באר עם שני מיליליטר של זנב חולדה טרי שהוכן תמיסת קולגן אחת לכל באר. אזנו את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעה לפחות.

לאחר מכן יש לדלל כ-25 מיליליטר דם טבורי עם HBSS בריכוז של אחד לאחד. לאחר מכן, הוסף 20 מיליליטר של מגיב מדיום שיפוע צפיפות לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, והוציא בזהירות 20 מיליליטר של דם טבורי מדולל לאורך דופן הצינור כדי לשכב את הדם על המדיום. הפרד את התאים באמצעות צנטריפוגה, ואחריה הסרה זהירה של שכבת הפלזמה.

בעזרת מזרק המצויד במחט בקוטר 18, אספו את התא החד-גרעיני המכיל את מעיל באפי לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר. ולהוסיף נפח שווה של מדיום בסיסי אנדותל לתאים. שטפו את התאים על ידי צנטריפוגה וליזו את כדוריות הדם האדומות בחיך שנוצר עם חמישה מיליליטר תמיסת אמוניום כלוריד על קרח.

לאחר חמש עד 10 דקות עם טלטול מדי פעם, אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדור הלבן במצע גידול אנדותל טרי. לאחר הספירה, שאפו את הקולגן מכל באר מצלחת שש הבארות, ושטפו את הבארות שלוש פעמים ב-PBS. זרע את התאים החד-גרעיניים בריכוז אחד של 10 עד 10 עד שביעי לכל שני מיליליטר מדיום לבאר.

והחזירו את הצלחת לחממה למשך 24 שעות. למחרת, שטפו את התאים פעם אחת עם מדיום גידול אנדותל טרי. לאחר מכן החלף את הכביסה בשלושה מיליליטר של מדיום גידול אנדותל טרי, והחזיר את התאים לחממת תרבית התאים.

בעזרת מיקרוסקופ שדה בהיר, השג תמונות יומיות של התאים כדי לעקוב אחר התקדמות מושבות תאי האנדותל, וסמן את הלוחות שבהם המושבות מתעוררות כדי לעקוב אחר צמיחתן. כאשר מושבות תאי האנדותל מגיעות לגודל של כשלושה מילימטרים, מצפים בקבוק תרבית T25 בזנב חולדה טרי קולגן אחד למשך שעה לפחות באינקובטור תרבית התאים. לאחר מכן קצרו את התאים עם 150 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין-EDTA לבאר בחממת תרבית התאים למשך שתיים-שלוש דקות.

הקשה עדינה על הצלחת כדי לעקור את התאים המחוברים. כאשר התאים מתחילים להתנתק, הוסיפו מיד שני מיליליטר של מדיום גידול אנדותל טרי, ומשכו את התאים בצינור חרוטי יחיד של 15 מיליליטר. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה במדיום גידול אנדותל טרי.

לאחר הספירה, זרעו את התאים בבקבוק המצופה קולגן בחמישה כפול 10 עד חמישי תאים בשלושה מיליליטר של צפיפות בינונית לכל בקבוק, וסמנו את הבקבוק כמעבר ראשון. לאחר מכן החזירו את הבקבוק לחממה, זרעו מחדש את התאים בכל פעם שהמושבה מגיעה למפגש של 90%. לאחר הזריעה על הצלחות שטופלו בקולגן, צמיחת המושבה הראשונה נצפית בדרך כלל בין הימים החמישי לתשע.

המושבות ממשיכות לגדול ולרכוש מורפולוגיה של תאים בצורת ציר בשלבים המוקדמים של התרבית, שבהמשך מתקדמת למורפולוגיה דמוית אבן. המספר הכולל של תאים שנקצרים בכל מעבר עולה בקורלציה ישירה למספר הימים הכולל בתרבית. ניתוח כתמים מערביים חושף ביטוי מוקדם של CD 31 ו-CD 34 על ידי תאי האנדותל המתורבתים, שנראה כי פוחת עם המעבר שלאחר מכן.

עם זאת, הביטוי של קולטן גורם גדילה אנדותל כלי דם 2 נשמר לאורך זמן, אם כי ברמת ביטוי מעט נמוכה מזו שנצפתה לאחר המעבר הראשון. יש לציין כי תאי אב אנדותל אינם חיוביים לסמן התאים המזנכימלי אלפא שריר חלק אקטין, בניגוד למשל, ליזטים של תאי ביניים מסתמיים, שניתן לכלול כבקרה חיובית. ניתן להשלים את כל הליך הבידוד תוך פחות מחמש שעות בהתאם למנת הדם הטבורי שהתקבלה.

לאחר בידוד וזריעה של התאים החד-גרעיניים במדיום גידול אנדותל, בדרך כלל לוקח בין חמישה לתשעה ימים עד שמושבות ה-EPC מופיעות בתרבית. שיטת הבידוד המוצעת משתמשת במדיה מיוחדת לתרבית תאי האב האנדותליים, ונמנעת משימוש בציטומטר זרימה, בכל הנוגע לדרישה לסמני אנדותל. שיטה זו מספקת גם פרוטוקול יעיל להשגת כמויות גבוהות של תאי אב אנדותל בפרק זמן קצר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי אב אנדותל מיחידות דם טבורי אנושיות. אל תשכח שדם טבורי אנושי עלול להיות מסוכן, ויש להקפיד על סילוק נכון של פסולת דם ותוצרי תרבית תאים.