פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

ניסוי זה משתמש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולכמת חלבונים גרעיניים בגרעינים מבודדים המסומנים אימונולוגית מנויטרופילים, במטרה לטהר נויטרופילים מדם פריפריאלי אנושי. הסר את תאי הדם האדומים באמצעות דקסטרין, ולאחר מכן בצע סבב צנטריפוגה במדרג צפיפות של הפלזמה. לאחר מכן, באמצעות נוגדנים אנטי-רצפטור, גרה את הנויטרופילים המטוהרים באמצעות אינטגרינים או רצפטורים של FC.

המשיכו בבידוד הגרעינים ובקיבוע הדגימות לצורך סימון אימונו-היסטוכימי באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד גורם הגרעין (nuclear factor) הרלוונטי. לדוגמה, NF kappa B. לבסוף, נתחו את הגרעינים באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לזהות שינויים קטנים בהפעלה של גורם הגרעין. התוצאות המתקבלות מראות כי גרייה של נויטרופילים באמצעות האינטגרינים שלהם מובילה לעלייה בריכוז הגרעיני של גורם השעתוק NF kappa B. מסלולי איתות המובילים להפעלת גורם הגרעין נחקרים בדרך כלל באמצעות בדיקות גן דגלי (reporter gene assays) או בדיקות העברה אלקטרופורטית (electrophoretic mobility shift assays) בתאים ראשוניים.

לעיתים קרובות שיטות אלו אינן מתאימות. ציטומטריה של זרימה מאפשרת זיהוי וכמיות מהירים של חלבונים גרעיניים בגרעינים מבודדים. התחילו עם 10 milliliters של דם שנאסף טרי ממתנדבים מבוגרים בריאים.

טפטפו באמצעות פיפט שני מיליליטר של תמיסת 6% dextrin T 500 לתוך מבחנת צנטריפוגה קונית של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיליליטר של דם, ערבבו על ידי היפוך המבחנה פעמיים או שלוש פעמים, והמתינו 45 דקות לשקיעת כדוריות הדם האדומות בכוח הכבידה בתוך מבחנת צנטריפוגה קונית נקייה של 15 מיליליטר. העבירו חמישה מיליליטר ל-FI fial pack.

אספו את הפלזמה העשירה בלויקוציטים שנוצרה מעל הכדוריות האדומות ששקעו. העבירו אותה בזהירות כשכבה מעל ה-fial pack ליצירת שני פאזות, וסבבו בצנטריפוגה ב-516 Gs למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ושברו את משקע התאים על ידי הקשה של המבחנה נגד המעמד.

לאחר מכן, השביה מחדש את התאים ב-10 milliliters של PBS קר. העבר את תגססת התאים למבחנת צנטריפוגה קונית של 50 milliliters וסבב בצנטריפוגה ב-290 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. פצח את משקע התאים כפי שבוצע קודם לכן והוסף 10 milliliters של תמיסה היפוטונית קרה כדי להמיס את הכדוריות האדומות.

ערבבו על ידי סיבוב עדין של המבחנה למשך דקה אחת בדיוק. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של תערובת תמיסה היפרוטונית קרה ושמרו על קרח. כעת ספרו את התאים לאחר שקיעת הנויטרופילים על ידי סנטריפוגציה.

אנו מרחפים את ה-PMN בריכוז של 10⁷ תאים למ"ל. שמרו את התאים על קרח ב-PBS קר. העבירו מנות (aliquots) של 100 µL מתליון ה-PMN למבחנות Eppendorf בנפח 1.5 מ"ל.

לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן המונוקלונלי המתאים בריכוז של 10 micrograms per milliliter והדגירו על קרח למשך 15 דקות. לשטיפת התאים, הוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר, סובבו בצנטריפוגה ושאבו את העלייה.

כדי להסיר נוגדנים שאינם קשוריים, השהו שוב את ה-PMN השטופים באותו נפח ראשוני של PBS חמים המכיל 60 micrograms per milliliter של go anti muse IgG; הדגרירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 1 עד 20 דקות, בהתאם לגורם הגרעיני הנבדק. כעת הוסיפו 1 milliliter של PBS קר. לאחר שקיעת התאים על ידי סרכוז (centrifugation), הסירו את הסנאט והקפיאו את משקועי התאים באופן מיידי באמבט של קרח יבש ואתנול. עבור כל דגימה, הוציאו את המבחנה מאמבט הקרח היבש והאתנול, נגבו אותה וסביבו.

השעה את משקעי ה-PMN הקפואים ב-100 µL של תמיסה היפוטונית קרה. הנח את כל הדגימות על קרח כדי לנטר את שלמות הגרעינים. צבע מנת עלייה של תגלי הגרעינים ב-trypan blue.

אם תרחיף הגרעינים מכיל תאים שלמים רבים או פסולת, עדיף להשליך את הדגימה ולהתחיל את הפרוצדורה עם דגימה אחרת. לאחר השקעת הגרעינים באמצעות סרכז, יש להסיר את הנוזל העליון בזהירות רבה, ולאחר מכן לקבע את הגרעינים ב-100 microliters של תמיסת Paraform aldehyde קרה בריכוז 4% ולהדגיר את הגרעינים על קרח. לאחר השקעת הגרעינים, הסר בזהירות את הנוזל העליון והוסף 100 microliters של בופר חדירות (permeation buffer) קר, והדגר את הדגימות על קרח למשך 10 דקות.

לאחר מכן, קצרו את הגרעינים המאובדים על ידי סרטיפוגציה. בשלב זה, משקעי הגרעינים אינם נצמדים היטב לתחתית המבחנה. מומלץ לבצע סרטיפוגציה נוספת.

במידה והמשקע משתחרר, כדי לחסום אתרי קישור לא ספציפיים, נתלה את הגרעינים ב-500 microliters של 4% fetal bovine serum קר ב-PBS ונדגיר על קרח למשך 20 דקות. נשקיע את הגרעינים באמצעות סנטריפוגציה, ולאחר מכן נתלה מחדש את הגרעינים ב-100 microliters של PBS קר המכיל 4% FBS ו-2.5 micrograms per milliliter של הנוגדן המונוקלונלי נגד הגורם הגרעיני הרלוונטי. נדגיר את הדגימות על קרח למשך 20 דקות. לאחר שטיפת הדגימות פעמיים עם 500 microliters של PBS קר עם 4% FBS, נתלה את הגרעינים ב-100 microliters של PBS קר המכיל 4% FBS ו-10 micrograms milliliter של הנוגדן המשני המתאים המסומן ב-FZ; נדגיר על קרח למשך 20 דקות. לאחר שתי שטיפות, נתלה מחדש את הגרעינים ב-400 microliters של 4% Paraldehyde קר ב-PBS.

נתחו את הגרעינים המסומנים אימונולוגית באמצעות ציטומטר זרימה, כגון FacsScan או מכשיר דומה. התאימו את הגדרות הרכישה: FSC בסולם לוגריתמי ב-10⁻¹, SSC בסולם לוגריתמי ב-196, ובצעו gate לגרעינים בגרף scatter plot. רכשו נתונים מ-10,000 גרעינים לכל דגימה.

לאחר מכן, נתח את הפלואורסצנציה של גרעינים שנצבעו ב-fitsy באמצעות ערוץ ה-FL one, המוגדר במقياس לוגריתמי ב-400. שיטה זו לטיהור PMN מספקת בדרך כלל נויטרופילים שאינם מעוררים ברמת טוהר הגבוהה מ-95% מגרעיני PMN המבודדים בנבחרים גבוהים; גרעינים מבודדים ניתנים לזיהוי קל כאוכלוסייה נפרדת מ-PMN שלמים בציטומטר זרימה באמצעות תרשים פיזור (dot plot) לאחר גירוי. על ידי קישור צולב של beta one integrins, חלבון NF kappa B מתורגם לגרעין, ועלייה זו ב-NF kappa B הגרעיני מזוהה כעלייה בעוצמת הפלואורסצנציה.

בדומה לכך, גרייה של PMN באמצעות קשירה צולבת של אינטגרינים מסוג beta two מעוררת גם היא הפעלה של NF kappa B, כפי שמעידה עלייה בفلורסצנציה. רגישותה של שיטה זו מאפשרת זיהוי של שינויים קטנים ברמות הגורם הגרעיני, כפי שעולה מהעובדה שאינטגרינים מסוג beta one, הנקשרים לחלבוני מטריקס חוץ-תאיים כגון פיברונקטין, מעוררים הפעלה חזקה יותר של NF kappa B מאשר אינטגרינים מסוג beta two, הנקשרים למולקולות היצמדות בתאים אחרים. שיטה זו מציעה גמישות רבה מכיוון שניתן להשתמש במגוון רחב של פלואורוכרומים ומכיוון שהיא מאפשרת הכנת גרעינים מסוגים שונים של תאים; השתמשו בגישה פשוטה וכלכלית זו למחקרי העברה של אותות הכוללים שינויים ברמות חלבון בגרעין של סוגי תאים מגוונים.