מיפוי אתר הקישור של Aptamer על ATP שימוש microscale Thermophoresis
7 בינואר 2017
MicroScale Thermophoresis (MST) היא טכנולוגיה רגישה לאפיון אינטראקציות aptamer-מטרה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול MST לאפיון אינטראקציות בין אפטמר למולקולות קטנות.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאפיין אינטראקציות של מולקולות קטנות של אפטמר DNA, כולל מיפוי אתר קשירה, באמצעות תרמופורזיס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על פרמטרי קשירה בסיסיים של אינטראקציות מולקולריות. היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא שהיא אינה תלויה בגודל השותף לאינטראקציה, ומאפשרת לקבל נתוני בקרת איכות של אינטראקציות מאתגרות בין אפטמרים למולקולות קטנות.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות מולקולות קטנות של אפטמר, ניתן ליישם אותה גם על אינטראקציות מולקולריות אחרות כגון אינטראקציות תרופה-מטרה או אנטיגן/נוגדנים. כדי להתחיל בהליך, הכינו תמיסת מלאי של 100 מיקרומולר של אפטמר ה-DNA DH25.42 המסומן Cy5 במים מזוקקים. לאחר מכן, יש לדלל את תמיסת מלאי האפטמר ל-200 ננו-מולרית עם מאגר קשירה.
דגרו על תמיסת העבודה של האפטמר למשך שתי דקות בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס. מצננים את התמיסה לטמפרטורת החדר על קרח. לאחר מכן, סמן והגדר צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר עם כריכה נמוכה לדילול סדרתי של 16 שלבים של הליגנד לבדיקה.
פיפטה 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של 10 מילי-מולרית של ליגנד ומאגר מחייב לתוך צינור 1. פיפטה 10 מיקרוליטר של מאגר קשירה לצינורות 2 עד 16. לאחר מכן העבירו 10 מיקרוליטר ציר ליגנד מצינור 1 לצינור 2 וערבבו היטב עם הפיפטה.
מעבירים 10 מיקרוליטר מהתערובת המדוללת לצינור 3 ומערבבים היטב. המשך את הדילול הסדרתי בדרך זו, תקן את השפעות דילול המאגר במידת הצורך, והשליך את 10 המיקרוליטרים העודפים מצינור 16 בסיום. הוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת העבודה של האפטמר לכל דילול וערבב היטב עם הפיפטה.
דגרו את הדגימות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן משוך כל תערובת לנימים סטנדרטיים נקיים, הקפד לגעת רק בנימים בקצוות. הנח את הנימים במחזיק המגש בסדר ריכוז יורד.
הפעל את מכשיר ה-MST ופתח את תוכנת בקרת המכשיר. אפשר בקרת טמפרטורה ידנית והגדר את טמפרטורת המכשיר ל-25 מעלות צלזיוס. לאחר שהמכשיר נמצא בטמפרטורה הנכונה, הכנס את מגש הנימים.
הגדר את ערוץ ה-LED לאדום עבור Cy5 המסומן aptamer. הגדר את מתח ה-LED כדי להשיג אות פלואורסצנטי של 500 יחידות. לאחר מכן בצע סריקה נימית כדי להשיג את מיקומי הנימים ולבדוק את איכות הדגימה.
אם הפסגות המתקבלות הן בצורת U או שטוחות, הכינו דגימות חדשות בנימים מקודדים כדי למזער את השפעות ההדבקה. בתוכנת מכשיר MST, מלא את ריכוז הליגנד וסוג הדילול עבור הנימים הראשונים. לחץ וגרור כדי למלא את הריכוזים והדילולים עבור הנימים הנותרים.
הזן את ריכוז האפטמר בתערובת הסופית. ודא ששיטת הניסוי מוגדרת לזהות פלואורסצנטיות למשך חמש שניות, הקלט את ה-MST למשך 30 שניות ולאחר מכן הקלט את הקרינה למשך חמש שניות לאחר כיבוי הלייזר. הגדר את עוצמת הלייזר ל-20%הגדר את נתיב הקובץ ושמור את קובץ הניסוי.
לאחר מכן התחל את מדידת MST. השג לפחות שלוש מדידות בדרך זו. כדי להתחיל בניתוח נתונים, פתח את תוכנת הניתוח MST וטען את קובץ הניסוי.
בחר MST עבור סוג הניתוח. תוכנת הניתוח מאפשרת להשוות חזרות טכניות כאשר כל המדידות היו של אותה קבוצת נימים. ניתן להוסיף לניתוח גם חזרות ביולוגיות מקבוצה אחרת של נימים.
לחץ על לחצן המידע מתחת למדידה הראשונה. בדוק את עקבות ה-MST לאיתור בליטות או קוצים המצביעים על השפעות צבירה או משקעים. לאחר מכן בדוק את הסריקה הנימים ואת שכבת הצורה הנימים לאיתור פסגות שטוחות או בצורת U המצביעות על השפעות הדבקה או ספיגה.
מכיוון שאגרגטים והשפעות ספיגה ניתנים לזיהוי מהיר ב-MST, השיטה מאפשרת אופטימיזציה מהירה ומהירה של המערך הטכני כדי להבטיח איכות נתונים אופטימלית. בדוק אם יש השפעות של כיבוי או שיפור פלואורסצנטי תלוי ליגנד בסריקת הנימים והפלואורסצנציה הראשונית. בדוק את שינוי הקרינה לאורך זמן לאיתור סימנים של הלבנת תמונות או שיפור תמונה.
לאחר אימות איכות הנתונים, עבור למצב תגובת המינון. בחר את הגדרת ניתוח המומחה באסטרטגיית ההערכה של T Jump MST. לאחר מכן בחר את מודל הגבעה להתאמת עקומה כדי לחשב אוטומטית את פרמטרי הכריכה.
בתפריט השוואת תוצאות, בחר סוג נורמליזציה. ייצא את הנתונים המנורמלים כגיליון אלקטרוני או כקובץ PDF. בהליך זה, נעשה שימוש ב-MST כדי לחקור את אינטראקציות הקישור של אפטמר DNA גדיל יחיד עם מבחר של ליגנדים של מולקולות קטנות.
עקומות ה-MST התאימו למשוואת הגבעה ונקבעו ערכי הריכוז האפקטיבי החצי מקסימלי. בחמש מדידות חוזרות ביולוגיות בלתי תלויות של האפטמר עם ATP, אינטראקציית האפטמר ATP הראתה משרעת קשירה שלילית של 6 עד 13 יחידות, וערך EC50 ממוצע של כ-52.3 מיקרומולר. הנתונים עבור כל ליגנד נורמלו לחלק המולקולות הקשורות ולאחר מכן הושוו.
ערכי EC50 עבור ADP, AMP ו-SAM בהשוואה ל-ATP מצביעים על כך שלמספר קבוצות הפוספט יש לכל היותר השפעה מינורית על התנהגות קשירת האפטמר. הסרת קבוצת ההידרוקסל רובו C2 הראתה גם השפעה מינורית בלבד על זיקת קשירת האפטמר. האפטמר לא נקשר בהיעדר קבוצת זיווג או אם קבוצת הזיווג שונתה לגואנין.
האפטמר אכן נקשר לאדנין בלבד, מה שמצביע עוד יותר על כך שקבוצת האדנין היא אתר הקישור העיקרי של האפטמר. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה לספק מידע חיוני על פרמטרי כריכה בסיסיים תוך דקות עד שעות אם היא מבוצעת כראוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לאפיון אינטראקציות בין אפטמרי DNA למולקולות קטנות באמצעות תרמופורזה בקנה מידה מיקרוסקופי (MicroScale Thermophoresis - MST). שיטת ה-MST מאפשרת קביעה כמותית של פרמטרי קישור כגון זיקה (affinity), סטוכיומטריה ותרמודינמיקה בתמיסה, ללא תלות בגודלם של השותפים לאינטראקציה. המחקר מדגים את היישום של MST למיפוי אתר הקישור של אפטמר DNA ל-ATP ולמולקולות קשורות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- כימיה ביופיזית
- ביולוגיה מולקולרית
- ביוכימיה אנליטית
רקע
- הבנת אינטראקציות מולקולריות היא חיונית הן למחקר בסיסי והן למחקר יישומי.
- MST היא טכניקה רגישה המודדת תנועה מולקולרית במדרגי טמפרטורה כדי להעריך אירועי קישור.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות מוגבלות על ידי הגודל או אופיים של השותפים לקישור; MST מתגברת על מגבלות אלה.
- אפטמרים של DNA הם אוליגונוקלאוטידים קצרים בעלי גדיל בודד שיכולים להיקשר למולקולות קטנות בסגוליות גבוהה.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול לאפיון אינטראקציות בין אפטמר למולקולה קטנה באמצעות MST.
- הדגמת הרגישות והורסטיליות של MST לחקר אינטראקציות מולקולריות מאתגרות.
- מיפוי אתר הקישור של ה-DNA aptamer מסוג DH25.42 ל-ATP ולתרכובות קשורות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסות של ליגנדים ואפטמר DNA המסומן ב-Cy5.
- דילול סדרתי של ליגנדים וערבובם עם תמיסת העבודה של האפטמר.
- אינקובציה והטענת דגימות לתוך קפילרות לצורך אנליזת MST.
- מדידת תנועה תרמופורטית באמצעות מכשור ותוכנת MST.
- ניתוח נתונים הכולל התאמת עקומות באמצעות משוואת Hill ונורמליזציה של נתוני קישור.
תוצאות עיקריות
- שיטת MST כימתה בהצלחה את זיקת הכשור בין האפטמר של ה-DNA ל-ATP, והניבה EC50 ממוצע של כ-52.3 μM.
- משרעת הכשור נעה בין 6 ל-13 יחידות לאורך חזרות ביולוגיות.
- ניתוח השוואתי עם ADP, AMP ו-SAM הצביע על כך שמספר קבוצות הפוספט בעל השפעה מינימלית על הכשור.
- האפטמר נקשר באופן ספציפי לאדנין, מה שמאשר את האדנין כאתר הכשור העיקרי.
מסקנות
- MST היא שיטה חסונה ורגישה לאפיון אינטראקציות בין אפטמרים למולקולות קטנות.
- הטכניקה מאפשרת אופטימיזציה ובקרת איכות מהירות של תנאי הניסוי.
- ניתן להחיל את MST באופן נרחב לחקר אינטראקציות מולקולריות מגוונות מעבר לאפטמרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי כמותי של אתרי קישור בין אפטמרים למולקולות קטנות באמצעות MicroScale Thermophoresis (MST) נותן מענה לצורך קריטי בתיקוף מדויק של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. הרגישות של MST והעובדה שהיא אינה תלויה בגודל המולקולרי מאפשרות אפיון חסון של אינטראקציות מאתגרות, ובכך תומכות בביטחון חיזוי בנקודות הכרעה מרכזיות בתיק הפיתוח. יכולת זו משפרת את מהימנות הנתונים של אינטראקציות מולקולריות לצורך סריקות המשך וזיהוי מובילים (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר כימות ישיר של זיקת קישור וספציפיות עבור אינטראקציות בין אפטמר למטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מיפוי אתרי קישור מדויקים והבהרת הזיהוי המולקולרי.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות עבור ישויות מולקולריות חדשות או מאתגרות.
- מספק משוב מהיר על פרמטרי קישור לצורך קבלת החלטות בנוגע לתעדוף תיקי הפיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פלטים כמותיים מתוקשפים לצורך סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה.
- מכין מערכות ביולוגיות חסונות לתהליכי סריקת תרכובות אמינים.
- מאפשר סקילביליות ושימוש חוזר בפלטפורמה על ידי תמיכה בתנאי דגימה ובאפרים מגוונים.
- מבטיח נתונים באיכות גבוהה להערכת תרכובות באמצעות זיהוי מהיר של ארטיפקטים של אגרגציה או ספיגה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מבצע התאמה בין נתונים של אינטראקציות מולקולריות לבין מערכות רלוונטיות למחלה כאשר נעשה שימוש באפטמרים ככלים תרגומיים.
- שומר על רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני על ידי אספקת מדדי קישור עקביים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות נתוני אינטראקציה כמותיים וניתנים לשחזור.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מיפוי אתרי קישור מבוסס MST משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם, דרך פיתוח בדיקות ועד למחקר פרה-קליני, ובכך מאפשר זרימה רציפה של נתונים וקבלת החלטות.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים באמצעות כימות אינטראקציות בין אפטמר לליגנד.
- סריקה: מציעה תוצאי בדיקה כמותיים וניתנים לשחזור להכנה לסריקות המשך.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות של EC50 ואמפליטודת קישור לצורך השוואת תנאים מולקולריים ואופטימיזציה של פרוטוקולים.
- מחקר תרגומי: תומכת בהתאמת סממנים ביולוגיים ובהמשכיות פרה-קלינית כאשר נעשה שימוש באפטמרים במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת את ה-MST כפלטפורמה רב-שימוש למחקרי אינטראקציות מולקולריות מגוונים מעבר לפרויקט בודד.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, הניתנים לשחזור וברי-הגדלה לצורך ניתוח אינטראקציות מולקולריות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתוני קישור באיכות גבוהה בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של מועמדים המותאמים לסיכון על בסיס מדדי אינטראקציה חסונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהקמת בדיקות ביופיזיקליות ובפירוש נתונים.
- נדרשת גישה למכשור MST ולתוכנה אנליטית תואמת.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת דגימות ובקרת איכות של נתונים.
- עשוי לדרוש התאמה של פרוטוקולים עבור מערכות שונות של aptamer או ליגנד.
- יש לזהות ולצמצם במהירות תופעות של אגרגציה של דגימות או ארטיפקטים של ספיחה כדי להשיג תוצאות אופטימליות.
