מיפוי אתר הקישור של Aptamer על ATP שימוש microscale Thermophoresis

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאפיין אינטראקציות של מולקולות קטנות של אפטמר DNA, כולל מיפוי אתר קשירה, באמצעות תרמופורזיס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על פרמטרי קשירה בסיסיים של אינטראקציות מולקולריות. היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא שהיא אינה תלויה בגודל השותף לאינטראקציה, ומאפשרת לקבל נתוני בקרת איכות של אינטראקציות מאתגרות בין אפטמרים למולקולות קטנות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות מולקולות קטנות של אפטמר, ניתן ליישם אותה גם על אינטראקציות מולקולריות אחרות כגון אינטראקציות תרופה-מטרה או אנטיגן/נוגדנים. כדי להתחיל בהליך, הכינו תמיסת מלאי של 100 מיקרומולר של אפטמר ה-DNA DH25.42 המסומן Cy5 במים מזוקקים. לאחר מכן, יש לדלל את תמיסת מלאי האפטמר ל-200 ננו-מולרית עם מאגר קשירה.

דגרו על תמיסת העבודה של האפטמר למשך שתי דקות בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס. מצננים את התמיסה לטמפרטורת החדר על קרח. לאחר מכן, סמן והגדר צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר עם כריכה נמוכה לדילול סדרתי של 16 שלבים של הליגנד לבדיקה.

פיפטה 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של 10 מילי-מולרית של ליגנד ומאגר מחייב לתוך צינור 1. פיפטה 10 מיקרוליטר של מאגר קשירה לצינורות 2 עד 16. לאחר מכן העבירו 10 מיקרוליטר ציר ליגנד מצינור 1 לצינור 2 וערבבו היטב עם הפיפטה.

מעבירים 10 מיקרוליטר מהתערובת המדוללת לצינור 3 ומערבבים היטב. המשך את הדילול הסדרתי בדרך זו, תקן את השפעות דילול המאגר במידת הצורך, והשליך את 10 המיקרוליטרים העודפים מצינור 16 בסיום. הוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת העבודה של האפטמר לכל דילול וערבב היטב עם הפיפטה.

דגרו את הדגימות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן משוך כל תערובת לנימים סטנדרטיים נקיים, הקפד לגעת רק בנימים בקצוות. הנח את הנימים במחזיק המגש בסדר ריכוז יורד.

הפעל את מכשיר ה-MST ופתח את תוכנת בקרת המכשיר. אפשר בקרת טמפרטורה ידנית והגדר את טמפרטורת המכשיר ל-25 מעלות צלזיוס. לאחר שהמכשיר נמצא בטמפרטורה הנכונה, הכנס את מגש הנימים.

הגדר את ערוץ ה-LED לאדום עבור Cy5 המסומן aptamer. הגדר את מתח ה-LED כדי להשיג אות פלואורסצנטי של 500 יחידות. לאחר מכן בצע סריקה נימית כדי להשיג את מיקומי הנימים ולבדוק את איכות הדגימה.

אם הפסגות המתקבלות הן בצורת U או שטוחות, הכינו דגימות חדשות בנימים מקודדים כדי למזער את השפעות ההדבקה. בתוכנת מכשיר MST, מלא את ריכוז הליגנד וסוג הדילול עבור הנימים הראשונים. לחץ וגרור כדי למלא את הריכוזים והדילולים עבור הנימים הנותרים.

הזן את ריכוז האפטמר בתערובת הסופית. ודא ששיטת הניסוי מוגדרת לזהות פלואורסצנטיות למשך חמש שניות, הקלט את ה-MST למשך 30 שניות ולאחר מכן הקלט את הקרינה למשך חמש שניות לאחר כיבוי הלייזר. הגדר את עוצמת הלייזר ל-20%הגדר את נתיב הקובץ ושמור את קובץ הניסוי.

לאחר מכן התחל את מדידת MST. השג לפחות שלוש מדידות בדרך זו. כדי להתחיל בניתוח נתונים, פתח את תוכנת הניתוח MST וטען את קובץ הניסוי.

בחר MST עבור סוג הניתוח. תוכנת הניתוח מאפשרת להשוות חזרות טכניות כאשר כל המדידות היו של אותה קבוצת נימים. ניתן להוסיף לניתוח גם חזרות ביולוגיות מקבוצה אחרת של נימים.

לחץ על לחצן המידע מתחת למדידה הראשונה. בדוק את עקבות ה-MST לאיתור בליטות או קוצים המצביעים על השפעות צבירה או משקעים. לאחר מכן בדוק את הסריקה הנימים ואת שכבת הצורה הנימים לאיתור פסגות שטוחות או בצורת U המצביעות על השפעות הדבקה או ספיגה.

מכיוון שאגרגטים והשפעות ספיגה ניתנים לזיהוי מהיר ב-MST, השיטה מאפשרת אופטימיזציה מהירה ומהירה של המערך הטכני כדי להבטיח איכות נתונים אופטימלית. בדוק אם יש השפעות של כיבוי או שיפור פלואורסצנטי תלוי ליגנד בסריקת הנימים והפלואורסצנציה הראשונית. בדוק את שינוי הקרינה לאורך זמן לאיתור סימנים של הלבנת תמונות או שיפור תמונה.

לאחר אימות איכות הנתונים, עבור למצב תגובת המינון. בחר את הגדרת ניתוח המומחה באסטרטגיית ההערכה של T Jump MST. לאחר מכן בחר את מודל הגבעה להתאמת עקומה כדי לחשב אוטומטית את פרמטרי הכריכה.

בתפריט השוואת תוצאות, בחר סוג נורמליזציה. ייצא את הנתונים המנורמלים כגיליון אלקטרוני או כקובץ PDF. בהליך זה, נעשה שימוש ב-MST כדי לחקור את אינטראקציות הקישור של אפטמר DNA גדיל יחיד עם מבחר של ליגנדים של מולקולות קטנות.

עקומות ה-MST התאימו למשוואת הגבעה ונקבעו ערכי הריכוז האפקטיבי החצי מקסימלי. בחמש מדידות חוזרות ביולוגיות בלתי תלויות של האפטמר עם ATP, אינטראקציית האפטמר ATP הראתה משרעת קשירה שלילית של 6 עד 13 יחידות, וערך EC50 ממוצע של כ-52.3 מיקרומולר. הנתונים עבור כל ליגנד נורמלו לחלק המולקולות הקשורות ולאחר מכן הושוו.

ערכי EC50 עבור ADP, AMP ו-SAM בהשוואה ל-ATP מצביעים על כך שלמספר קבוצות הפוספט יש לכל היותר השפעה מינורית על התנהגות קשירת האפטמר. הסרת קבוצת ההידרוקסל רובו C2 הראתה גם השפעה מינורית בלבד על זיקת קשירת האפטמר. האפטמר לא נקשר בהיעדר קבוצת זיווג או אם קבוצת הזיווג שונתה לגואנין.

האפטמר אכן נקשר לאדנין בלבד, מה שמצביע עוד יותר על כך שקבוצת האדנין היא אתר הקישור העיקרי של האפטמר. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה לספק מידע חיוני על פרמטרי כריכה בסיסיים תוך דקות עד שעות אם היא מבוצעת כראוי.