Name: נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: למדו כיצד להעריך קבועי דיסוציאציה לאינטראקציות חלבון-ליגנד באמצעות דיפרנציאל סריקת פלואורימטריה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר ויעיל של אפיניות קשירה בכימיה אנליטית וביוכימית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק מ-BBSRC (מספר מענק BB/H019685/1 ו-BB/E527663/1) לאוניברסיטת אקסטר.

<ol><li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry%3A+experimental+design%2C+data+analysis%2C+and+probing+macromolecule%2Fligand+binding+and+kinetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li>
<li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetry+as+a+tool+for+understanding+biomolecular+interactions+and+an+aid+to+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design.</a> Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).</li>
<li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).</li>
<li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).</li>
<li>Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+protein+characterization+by+mass+spectrometry%2C+thermal+shift+%28ThermoFluor%29+assay%2C+and+multiangle+or+static+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering.</a> Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li>
<li>Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+optimize+the+purification+and+crystallization+of+PLP-dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).</li>
<li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability%2C+protein+crystallization%2C+and+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).</li>
<li>Davis, B. J., Erlanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+from+our+mistakes%3A+the+%27unknown+knowns%27+in+fragment+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening.</a> Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).</li>
<li>Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+hit+generation+and+structural+characterization+in+fragment-based+ligand+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery.</a> Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+fragment-based+approach+to+target+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions.</a> Chembiochem. 14, 332-342 (2013).</li>
<li>Cimmperman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+model+of+thermal+stabilization+and+destabilization+of+proteins+by+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands.</a> Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).</li>
<li>Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+stability+of+carbonic+anhydrase%3A+measurements+of+binding+affinity+and+stoichiometry+using+ThermoFluor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor.</a> Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).</li>
<li>Zubriene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nanomolar+dissociation+constants+by+titration+calorimetry+and+thermal+shift+assay+-+radicicol+binding+to+Hsp90+and+ethoxzolamide+binding+to+CAII%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII.</a> Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).</li>
<li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hill+equation+revisited%3A+uses+and+misuses%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11, 835-841 (1997).</li>
<li>Cuccui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Burkholderia+pseudomallei+K96243+capsular+polysaccharide+I+coding+region%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region.</a> Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).</li>
<li>DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Burkholderia+mallei+polysaccharide+gene+cluster+by+subtractive+hybridization+and+demonstration+that+the+encoded+capsule+is+an+essential+virulence+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant.</a> Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).</li>
<li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nat Struct Biol. 10, 980(2003).</li>
<li>Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+WcbI%2C+a+novel+polysaccharide+biosynthesis+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22IUCr+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme.</a> IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).</li>
<li>Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+differential+scanning+fluorimetry+based+high+throughput+screening+assay+for+the+discovery+of+affinity+binders+against+an+anthrax+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein.</a> J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).</li>
<li>Uniewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+measurement+of+protein+stability+changes+upon+binding+to+glycosaminoglycans%3A+a+screening+test+for+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity.</a> Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).</li>
<li>Wan, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+as+secondary+screening+platform+for+small+molecule+inhibitors+of+Bcl-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL.</a> Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).</li>
<li>Koropatkin, N. M., Holden, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li>
<li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם מה לחשוף.

fluorimetry סריקת ההפרש הוכיח את כוחה כשיטת חזקה ותכליתית לאפיון חלבונים, וזיהוי ligands חלבון הפוטנציאלי. ההצלחות המתועדות היטב בזירוז ייצוב חלבון, גילוי תרופות (במיוחד במעבדות פחות מימנו גם) והתגבשות 10,23-25 ​​עשו את זה בשיטה אטרקטיבית לסינון ראשוני של תרכובות. תרכובות הוסיפו לחלבונים מצביעות על עלייה ברורה במינון תלויה ב7,9 טמפרטורת התכה לכאורה. עם זאת, יש כבר כמה ניסיונות להשתמש בתוצאות מהניסויים אלה כדי לקבוע קבועים המחייבים לכאורה כדי לסייע בדירוג תרכובות לזיקה שלהם. כאן, אנו מציגים שיטה לקביעה באופן שיטתי קבוע דיסוציאציה לכאורה לחלבונים בנוכחות ליגנד. התוצאות שהוצגו כאן מראות כי DSF במהירות ובאופן עמיד יכול לספק הערכות של קבוע דיסוציאציה לשילוב חלבון ליגנד. ניתן להשפיע נתונים נצפו עם כלים זמינים מסחרי כדי לספק נחישות מהירה של ד K, ללא הצורך להניח הנחות באשר לערך הצפוי של פרמטרים. יש שיטת יתרון משמעותי על פני כמה בשיטות דומות של להיות חסכן בשני חלבונים וזמן הנדרשים. הניסוי המתואר כאן יצרוך 0.13 מ"ג חלבון לכל ניסוי (כ 0.4 מ"ג לניסויים חוזרים ונשנים בשלושה עותקים). זה משווה לטובה עם calorimetry טיטרציה בידוד התרמי (ITC), שבו ניסוי יחיד עם חלבון kDa 40 ממוצע יצרוך כמות דומה. הסט המלא של ניסויים הנדרשים לפרוטוקול זה היה לצרוך כ -4 שעות, כולל הכנה, לסט אחד של ניסויים. שוב, זו עשויה להיות משמעותי יותר מהר מאשר שיטות כגון ITC או תהודת plasmon פני השטח, אשר לעתים קרובות תוך עוצמה דורש אופטימיזציה ניכרת כדי להשיג נתונים הטובים ביותר. התוצאות שלנו מראות כי יש עדיין דרישה לבחון בזהירות את הנתונים הגולמיים, בכושר של נתונים אלה כדי לקבוע את טמפרטורת ההתכה, ואת ההתאמה של נתוני טמפרטורת התכה כדי לקבוע את קבוע דיסוציאציה. אתגר ראשון הוא הצורה של נתונים הגולמיים המופקים בהיתוך החלבון. בחלק מהמקרים, את הצורה לא להתקרב לזה שנצפה באיור 1 א. נושאים משותפים כוללים משמרות בטמפרטורה נמוכות על יגנד מחייבים, הקרינה רקע גבוהה, ומעברים מרובים יוצא דופן בטמפרטורה. משמרות טמפרטורה נמוכה נתפסות על כריכת מספר הליגנדים. לשיטה זו, הפרמטר הקריטי ביותר הוא השגיאה במדידת T מ ', בהשוואה לשינוי הטמפרטורה. נתונים בדרך כלל יכולים להיות מצוידים בצורה סבירה כאשר סטיית התקן של מדידות בשלושה עותקים לא תעלה על 10% שינוי טמפרטורת ההתכה בין חלבון מאוגד וכרוך באופן מלא. הניסיון שלנו הוא שבו זמני כגוןמשמרות erature רק 2 מעלות צלזיוס, זה יכול להיות מספיק עבור התאמת הנתונים, אם נקודות נתוני הפרט הן מאוד מדויקות. נושא שני הוא בצורה יוצאת דופן עקום. אלה נבדלים לעתים קרובות בין חלבון החופשי וטפסים ליגנד קשורים, כיגנד המחייב משפיע התגלגלות מצבים של החלבון. במקרים אלה, המשתמש חייב לשקול אם הנתונים ניתן להשתמש עם התחשבות הולמת במודלים שישמשו לקביעת טמפרטורת התכה וקבועה דיסוציאציה. בעיה נפוצה נוספת היא כי תוספת של cofactor לחלבון (לדוגמא, MgCl 2 בדוגמא שלנו עם hexokinase) נדרש כדי להשיג את הנתונים אמינות ביותר. הניסיון שלנו היה ששיקול דעת של כל הגורמים צפויים בניסוי בשלב של לקיחת קריאות ראשוניות היא חיונית להשגת התוצאות הטובות ביותר. יתר על כן, טיפולים תיאורטי חלופיים יכולים לחשוף תכונות של נתונים אלה 15,17. לבסוף, אין זה נדיר עבור חלבונים מסוימים שגontain מקורי נחשף אזורים הידרופובי להראות הקרינה רקע גבוהה. ישנם מספר פתרונות לבעיות אלה, שנסקרו בהרחבה במקומות אחרים 6,9. בפרט, המשתמש חייב לשקול אם להשתמש בולצמן או מודלים נגזרים (למשל, איור 4), ובמקרה של שימוש בנגזרים, אם חייב להיות מודל נמס מרובה. שתי השיטות למידול תרמית התגלגלות שונות שבשיטה בולצמן מתאימה את נתוני ניסוי למשוואת בולצמן, בהנחת צורת sigmoidal רגילה לעקומת התגלגלות. בניגוד לכך, השיטה הנגזרת לוקחת הנגזרת הראשונה של נתוני ניסוי בכל נקודה (פנל תחתון באיור 1 א), ורואה את טמפרטורת ההתכה להיות הנקודה נגזרת הראשון הגבוה ביותר. השיטה הנגזרת, בדרך כלל, חוזרת טמפרטורת התכה גבוהה יותר בכ 2 - 3 מעלות צלזיוס. רוב החלבונים יחזרו עקביים יותרתוצאה (כלומר, סטיית ההתקן של טמפרטורת ההתכה לניסויים בשלושה עותקים הוא נמוכה יותר) לאחת משתי השיטות. זה בדרך כלל בצורה אינטימית הקשורים לצורה המדויקת של חלבון התגלגלות עקומה, ויש צורך לקבוע את השיטה הטובה ביותר בכל מקרה ומקרה באופן אמפירי. איפה המודל הנגזר משמש, חשוב גם לקחת בחשבון אירועי היתוך מרובים. חלק מהנתונים מראים בבירור ראיות למעברים מרובים, ובמקרים אלה התוצאות צפויות להיות קל יותר לפרש אם אירועי היתוך המרובים אלה הם מודל. בהקשר של פרוטוקול זה, הוא לעתים קרובות את המקרה כי התוספת של ליגנד יכולה לגרום לחלבון לעבור מיש מעברי היתוך מרובים למעבר בודד (למשל, על ידי ייצוב המשנה ביותר תרמית השבירה), או להיפך. היינו אפוא עו"ד שהנתונים הגולמיים נבחנים יחד לפני שוקל גישה אשר יהיה הטוב ביותר לשימוש. בעקבות מ 'odelling של טמפרטורות התכה בודדות, נושאים נוספים יכולים להתעורר בהתאמה אלה לדגמים שהוצגו בסעיף בפרוטוקול. זה הכרחי כדי לבחון היטב את ההתאמה למשוואה הקבועה דיסוציאציה באמצעות סולם לוגריתמים, כמו ניתוח זה לעתים קרובות מדגיש פערים בין הנתונים שנצפו והמודל (ה .g., איור 3). בעוד התוצאות שהתקבלו הן בדרך כלל חזקות, טיפול בפרשנות מציע את ההזדמנות כדי לחלץ תוצאות טובות יותר, והמשמעות ביותר, מן הנתונים. נושא מסוים שהועלה על ידי נתונים אלה הוא הפרשנות שצריכה להיות ממוקם על חלבונים שמראים cooperativity, או אירועים המחייבים מרובים, בDSF. יש לנו, עד היום, רק בתופעה זו, בחלבונים שצפויים להיות להם אירועים המחייבים ספציפיים מרובים (למשל, WcbM, חלבון שטוב ביותר homologue הוא multimer 26, ואשר משמש כmultimer על כרומטוגרפיה הדרת גודל [נתונים לאמוצג]). זה בכלל לא ברור שcooperativity השלילי שנצפה בdenaturation DSF מצביע על כך שאנזים סופו של דבר להראות cooperativity השלילי: ולא, זה עשוי להיות סימן למחייב מורכבים שחייבים להיחקר באופן יסודי יותר באמצעות מגוון רחב יותר של שיטות. אין זה מרמז לנו, עם זאת, כי מחקרים מקיפים יותר של חלבונים כאלה עשויים לזהות תופעות מעניינות. ערכי הנתונים עבור קבוע דיסוציאציה שימוש בשיטה זו הם בדרך כלל באותו סדר כמו אלה המסופקים על ידי שיטות אחרות, כגון calorimetry טיטרציה הבידוד התרמי ותהודה plasmon פני השטח. עם זאת, הערכים מוחלטים שנצפו גבוהים יותר בתדירות גבוהה יותר מאשר נצפה באמצעות שיטות אלה. זה לפחות בחלקו מעובדה שקבוע דיסוציאציה הוא ציין בטמפרטורת ההתכה של החלבון עם ליגנד. ד K זה גבוה בדרך כלל מזו בטמפרטורות פיסיולוגיות. Dissociation קבוע קשור לטמפרטורה של התגובה על ידי המשוואות: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg"> [1] <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg"> [2] (שבו θ c הוא ריכוז ההתייחסות הסטנדרטי, Δ r G הוא השינוי באנרגיה החופשי של גיבס של התגובה, R הוא קבוע גזים הטוחנות, Δ H הוא השינוי באנתלפיה בתגובה, וΔ S הוא שינוי אנטרופיה בתגובה .) תגובות עם קבועי דיסוציאציה בטווח המדידה של שיטה זו, בדרך כלל, יש לי G r Δ שלילי, ולכן ההשפעה של עלייה בטמפרטורה במשוואה [1] תהיה להגדיל את הניתוק מתמיד. שני מונחי Δ H וΔ S המהווים את האנרגיה החופשית של גיבס (משוואה [2]) הם temperaturדואר 27 תלויים, וההשפעה על קבוע דיסוציאציה יהיו תלוי בגודל ובסימן של תלות הטמפרטורה אלה, ובהכרח יהיו אינטראקציה תלויה. כתוצאה מכך, זה לא בלתי צפוי שקבועי דיסוציאציה נקבעו על ידי שיטה זו הם לעתים גדולים יותר מאלה שנקבעו על ידי שיטות הפועלות על RT. תלות בטמפרטורה גם היא, כמובן, אזהרה של שיטות רבות אחרות, שנוטים לספק את קבוע דיסוציאציה בטמפרטורות נמוכות מהטמפרטורה הפיזיולוגית. אזהרה נוספת של שיטת DSF היא שזה שיטה שכותרתו, בניגוד לITC. תווית הניאון משמשת (SYPRO Orange) היא הידרופובי, ולכן במקרים מסוימים יכולה להתחרות עם הכריכה של ליגנד הידרופובי לחלבונים. כתוצאה מכך, סביר להניח כי במקרים מסוימים, קבוע דיסוציאציה הושג יועלו באופן מלאכותי בשל תחרות עם התווית. עם זאת, לשם ההשוואה של הליגנדים מגוונים, (השימוש העיקרי שלDSF), ההבדלים צפויים להיות משמעותי מספיק כדי להשפיע על הדירוג של תרכובות על ידי זיקה. חסרון פוטנציאלי של שיטה זו הוא המגבלה של זיהוי שניתן להשיג. בעיקרון, זה לא אמור להיות אפשרי באופן מדויק למדידת ערך עבור ד K שאינו עולה על 50% מריכוז החלבון, ואפילו ערכים בטווח זה עשויים להיות דיוק מפוקפק. בעוד המגבלה של זיהוי בקצה הזה של הטווח ניתן להאריך מעט על ידי הפחתת הריכוזים של חלבון וצבע, הרגישות של המכשיר תהיה למנוע ירידה נוספת בריכוז חלבון. בדומה לכך, הקצה העליון של הרגישות שייקבע על ידי המסיסות של ליגנד. לקבלת אומדן מתמטי חזק לד K, חשוב ביותר לקבל נתונים עם 90% מהחלבון הנוכחי בצורה הנכנס ליגנד, אשר דורש ריכוז ליגנד להיות מקורבly עשר פעמים ד K (בהנחה שאין cooperativity). המגבלה של זיהוי ולכן תהיה בהכרח להיות עשירית מהמסיסות של ליגנד במאגר הרלוונטי. משמעות דבר היא כי גבולות זיהוי של השיטה ינועו בדרך כלל בין 1 מיקרומטר ובין 1 ו100 מ"מ, בהתאם לחלבון ויגנד. לסיכום, fluorimetry סריקת ההפרש הוא טכניקה תכליתית החלים על מגוון רחב של חלבונים. שימוש בשיטות שהוצגו כאן, זה אפשרי במהירות ובזול כדי לקבוע את הזיקה של חלבון לליגנד שונה. זה יש פוטנציאל גדול לשימוש בטיהור חלבונים וייצוב, הבהרת הפונקציה או ספציפי של אנזימים מmetagenomes, ובגילוי תרופות, במיוחד במעבדות קטנות.

כל החלבונים יהיו לאגד, עם זיקות שונות, למגוון רחב של מולקולות אחרות מיונים פשוטים למקרומולקולות הגדולה אחרת. במקרים רבים, חלבונים נקשרים לשותפי מולקולה קטנים, כחלק מהתפקוד התקין שלהם (למשל, קינאז מחייב ATP). אינטראקציות אחרות עשויות להיות קשורות לתפקוד, אך בניסוי שימושי כמו כלים (לדוגמא, מולקולות קטנות שמייצבות חלבונים כדי לשפר את הצלחת גיבוש, או לסייע בשמירה על חלבונים בפתרון); בעוד מולקולות קטנות אשר נקלטות על ידי אתרים פעילים ואתרי allosteric של חלבונים יכול לשמש כמעכבים, וכך לווסת את הפעילות של אנזימים. יש מגוון רחב של טכניקות שיכולים לשמש כדי לקבוע את הזיקה של חלבונים למולקולות שותף. calorimetry טיטרציה בידוד התרמי 1 נתפס נרחב כמו &quot;תקן זהב&quot;, כפי שהוא מספק מידע עשיר על תגובות, הוא תווית חופשית, והגביל הזדמנויות לrtifacts של הניסוי. עם זאת, למרות השיפורים אחרונים ברגישות של המכשור והאוטומציה של הגדרה ניסיונית, זה עדיין יקר יחסית במונחים של דרישות חלבון, יש במקרה הטוב תפוקה נמוכה עד בינוני, ומתאים ביותר לאינטראקציות עם בינוני עד זיקות גבוהות (10 ננומטר לד K 100 מיקרומטר) 2. שיטות תווית אחרות ללא תשלום, כגון תהודת plasmon פני השטח או הצעת אינטרפרומטריה 3 bilayer תפוקה גבוהה יותר, והשיג הרגישות לזיהוי מולקולות קטנות יותר נמוכות כמו 100 Da. עם זאת, מכשירי תפוקה גבוהים לשיטות אלה הם יחסית יקרים, מוצדקים רק בו יהיו תפוקה מתמשכת של פרויקטים רלוונטיים, ולכן הם עלולים להיות בלתי נגישים לרבים מעבדות אקדמיות. fluorimetry ההפרש הסריקה (DSF, או thermofluor) תואר לראשונה בשנת 2001 4 כשיטה לגילוי סמים. בmetho זהד, חלבונים מודגרת עם צבע פלואורסצנטי (צבעים תחילה נפטלין-sulfonic שמשו), המשנה הקרינה שלה על כריכה לאזורים הידרופובי של החלבונים. מדגם חלבון צבען הוא מחומם ואז, והקרינה במעקב כחום עולה. התגלגלות של החלבון, וחשיפה של חלקים ההידרופובי של החלבון, מולידה דפוס אופייני בקרינה כפונקציה של הטמפרטורה (איור 1 א). הניסוי יכול להתבצע בכמויות קטנות בכל מכשיר PCR כמו מסחרי, וכן בניסוי אחד, מספר גדול של דגימות ניתן לבדוק בו זמנית (בדרך כלל 48, 96 או 384 דגימות, בהתאם לדגם המכשיר). בדרך כלל ניתן לבצע ניסויים ברחבי שעה, מתן האפשרות לניתוח תפוקה הגבוה של הדגימות 5. שיפורים נוספים למתודולוגיה שראו אימוץ של צבעים עם תכונות ספקטרליות טובות יותר 6,7 </sup&gt;, כלים גנריים לניתוח נתונים, והציעו פרוטוקולים לסינון ראשוני 8,9. מגוון רחב של יישומים של השיטה הורחב, עם דגש מיוחד על קביעת תנאים אופטימליים לעריכה ולאחסון של חלבונים 10, ועל זיהוי שותפים המחייבים פוטנציאל לסייע התגבשות 11. התפוקה גבוהה יחסית של השיטה, עלות נמוכה יחסית בחלבון (~ 2 מיקרוגרם לתגובה), והתחולה ללימוד מולקולות מחייבות חלשות הפכה DSF כלי רב ערך עבור עיצוב סמים בר מבוסס, במיוחד בהקשר אקדמי 12-14. למרות היישום הרחב של DSF לחקר אינטראקציות חלבון ליגנד, כמה מחקרים שתיארו את נחישות של קבועי דיסוציאציה ממחקרים אלה. עם זאת, אלה נוטים לייצר משוואות מפורטות המתארות את התגלגלות של החלבון, עם פרמטרים רבים שצריכה להיות מצוידת לנתונים דלילים או בחלק דואר המקריםstimated 7,15-17. שיטות אלה הן רלוונטיים במיוחד במקרים מאתגרים, כגון תרכובות בחוזקה מחייבות, או חלבונים בו מוצגות מעברים יוצאות דופן. עם זאת, למעבדות רבות, ניתוחים מפורטים אלה הם מסורבלים מדי לשימוש שיגרתי. לפיכך, אנו מציעים טיפולים אלטרנטיביים לתרחישים שונים, ולהדגים כיצד אלה יכולים לשמש כדי להתאים נתונים כתוצאה מאינטראקציות חלבון ליגנד שונות. השיטה שלנו משתמשת במכשיר StepOne qPCR, שלתוכנת ניתוח הנתונים העידו זמינה; בעוד זו מאיצה את ניתוח הנתונים, תוצאות ממכשירים אחרים יכולות להיות מעובד בשיטות שפורסמו בעבר 9, ואת אותו הניתוח במורד הזרם יכול להתבצע.

<table><tbody><tr><td>שלבמכשיר PCR אחד בזמן אמת</td> Life <td>Technologies</td><td>4376357</td><td>DSF ניתן לבצע עם מכשירים רבים אחרים. למכשיר StepOne יש תוכנה נוחה מאוד לניתוח נתונים.</td></tr><tr><td>תוכנת שינוי תרמי חלבון v1.0</td><td>Life Technologies</td><td>4466037</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp צלחות אופטיות מהירות 48 בארות&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375816</td><td></td></tr><tr><td>סרט איטום אופטי&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375323</td><td>Bio-rad חלק מס' 223-9444 הוא ספק חלופי</td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות עם תחתית U</td><td>Fisher</td><td>11521943</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S6650</td><td>עבור ספק נפח קטן יותר, השתמש בחלק סיגמא מס' S5692</td></tr><tr><td>SPSS סטטיסטיקה גרסה 20</td><td>IBM</td><td></td><td>חבילות סטטיסטיקה אחרות יספקו פונקציונליות דומה</td></tr><tr><td>GraphPad פריזמה 6.02</td><td>GraphPad</td><td></td><td>חבילות סטטיסטיקה אחרות יספקו פונקציונליות דומה</td></tr><tr><td>מוליך יד (PA1)</td><td>3M</td><td>75-3454-4264-6</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase מ- Saccharomyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>פישר מדעי</td><td>10141520</td><td></td></tr></tbody></table>

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת fluorimetry

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

מגוון רחב של שיטות זמינים כעת לקביעת הניתוק המתמיד בין חלבון ואינטראקציה מולקולות קטנות. עם זאת, רוב אלה דורשים גישה לציוד מומחה, ולעתים קרובות דורש מידה מסוימת של מומחיות להקים ביעילות ניסויים אמינות ולנתח נתונים. fluorimetry סריקת ההפרש (DSF) נמצא בשימוש יותר ויותר כשיטת חזקה לסינון ראשוני של חלבונים לאינטראקצית מולקולות קטנות, או לזיהוי שותפים פיסיולוגיים או לגילוי להיט. טכניקה זו יש יתרון בכך שהיא דורשת רק מכונה PCR מתאימה לPCR כמותי, וכל כך מתאימה מכשור זמין ברוב המוסדות; מגוון מצוין של פרוטוקולים זמינים כבר; ויש תקדימים חזקים בספרות לשימושים מרובים של השיטה. העבודה האחרונה הציעה מספר דרכי חישוב קבועי דיסוציאציה מנתוני DSF, אבל אלה הם מבחינה מתמטית תובעניים. כאן, אנו DEMonstrate שיטה להערכת קבועי דיסוציאציה מכמות מתונה של נתונים ניסיוניים DSF. בדרך כלל יכולים להיות שנאספו נתונים אלה וניתחו בתוך יום אחד. אנו מדגימים כיצד שונים מודלים יכולים לשמש כדי להתאים את הנתונים שנאספו מאירועים המחייבים פשוטים, ובו אתרי קישור או עצמאיים מחייב שיתופיים נוכחים. לבסוף, אנו מציגים דוגמא לניתוח נתונים במקרה שבו מודלים סטנדרטיים אינם חלים. שיטות אלו מאוירות עם נתונים שנאספו על חלבוני שליטה זמינים מסחרי, ושני חלבונים מתכנית המחקר שלנו. בסך הכל, השיטה שלנו מספקת דרך פשוטה לחוקרים כדי לקבל תובנה נוספת לתוך אינטראקציות חלבון ליגנד באמצעות DSF במהירות.

פלואורימטריית סריקה דיפרנציאלית היא שיטה בשימוש נרחב לסינון ספריות של מולקולות קטנות לאינטראקציות עם חלבונים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להרחבת ניתוחים אלה כדי לספק אומדן של קבוע הדיסוציאציה בין מולקולה קטנה לשותף החלבון שלה.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את קבוע הדיסוציאציה עבור אינטראקציה של ליגנד חלבון. זה מושג על ידי הכנת תערובות של החלבון עם ריכוזים שונים של הליגנד יחד עם צבע אינדיקטורים. השלב השני הוא לחמם את הדגימות הללו תוך רישום הקרינה של המחוון כדי לנטר את התפתחות החלבון.לאחר מכן, עקומות החלבון המתפתחות מומרים לסדרה של טמפרטורות התכה. השלב האחרון הוא להתאים את הנתונים הללו למודל מתאים להערכת קבוע הדיסוציאציה. בסופו של דבר, פלואורומטריית סריקה דיפרנציאלית משמשת להבנה טובה יותר של האינטראקציה של חלבון עם הליגנדים שלו.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו איזותרמית, טיטרציה, קלורימטריה ותהודה פלזמה על פני השטח הוא שניתן להשלים שיטה זו תוך מספר שעות באמצעות כמויות מתונות בלבד של דגימה במכשיר שכבר זמין ברוב המכונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכימיה של חלבונים, כגון הזיקה של ליגנדים לחלבונים והחוזק היחסי של אינטראקציות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שבחירת הדגימות לשימוש וניתוח הנתונים יכולים להיות קשים.לפני שתתחיל בהליך זה, הכינו את הפתרונות הבאים. תערובת המכילה את הריאגנטים המפורטים בטבלה זו ומלאי של הליגנד המעניין בריכוז הגבוה ביותר הזמין, כמו גם שישה דילולים של פי עשרה מריכוז זה. אם ידוע קבוע דיסוציאציה משוער מנתונים קודמים, הכינו לפחות שני ריכוזים מעל ומתחת ל-kd.טבלה לדוגמה מוצגת כאן. מכניסים 18 מיקרוליטר מהתערובת לכל אחת משמונה בארות. בצלחת A-Q-P-C-R, הוסף שני מיקרוליטר ממס לבאר הראשונה לכל אחת משבע הבארות הנותרות, הוסף שני מיקרוליטר מכל חבר בסדרת דילול הליגנד.הנח אטם A-Q-P-C-R מעל הצלחת כדי להשיג אטימה טובה של הצלחת. הניחו מוליך ידני באמצע הצלחת, החליקו את החותם לצד אחד ואז חזרו על הפעולה על החצי השני של הצלחת. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 פעמים G למשך שתי דקות להסרת בועות אוויר.לאחר מכן, הנח את הצלחת במכשיר QPCR שלב אחד. בחר באפשרות עקומת ההיתוך, מסנני הסלעים, ובחר את מהירות הרמפה המהירה. הפעל דנטורציה תרמית בסיום ריצת המכשירים.לחץ על כפתור הניתוח במסך. שמור את קובץ התוצאות. פתח את תוכנת ההסטה התרמית של החלבון.צור מחקר חדש בכרטיסיה מאפיינים. תן לו שם, ובכרטיסיה תנאים, פרט את הליגנדים. עבור ללשונית קבצי הניסוי וייבא את קובץ התוצאות שנשמר.הגדר את התוכן של כל אחד מהם. ובכן עבור ללשונית הניתוח ולחץ על כפתור הניתוח כדי לנתח את התוצאות. בדוק שהחלבון בנוכחות ממס בלבד נותן תוצאה דומה לזו המוצגת באיור זה.לאחר מכן, בחן את טמפרטורות ההיתוך שנצפו בתוצאות בכאב השכפול. ודא שזה מראה עלייה ברורה בטמפרטורת ההיתוך עם הגדלת ריכוז הליגנדים. נתונים אלה ישמשו כדי לספק ערך משוער עבור קבוע הדיסוציאציה כמתואר במאמר הנלווה.פתרונות אלה נדרשים להליך לקביעת קבוע הדיסוציאציה, תערובת מאסטר כמפורט בטבלה זו ומלאי הליגנד ב-15 ריכוזים שונים, אשר ידוללו פי עשרה. בניסוי האחרון. באופן אידיאלי כלול ריכוזי ליגנד, לפחות שני סדרי גודל מעל ומתחת ל-kd המשוער, ומרכז את הריכוזים על ה-kd המשוער.סדרת דילול לדוגמה מוצגת כאן. התמקדו בשבע מהנקודות בסדר גודל של ה-KD המשוער עם ארבע נקודות נוספות משני הצדדים. אם יש ברירה, כלול יותר נקודות בערכים רוויים.הוסף 120 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל אחת משמונה הבארות בצלחת 96 בארות עם תחתית U כדי לשמש כמאגר לחלוקה נוחה של תערובת המאסטר. לאחר מכן השתמש בפיפטה של שמונה ערוצים כדי להוציא 18 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לעמודה אחת של צלחת PCR. חזור על חמש עמודות נוספות כדי לתת בסך הכל 48 בארות מלאות בתבנית שש על שמונה על הצלחת.לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר מגבעולי הליגנד או הממס לכל אחת משמונה הבארות. בצלחת אחרת עם תחתית U של 96 בארות בעזרת פיפטה של שמונה ערוצים שאבו שני מיקרוליטרים של שמונה מלאי ליגנד או ממיסים שונים, והוסיפו אותם לעמודה אחת של צלחת ה-PCR שהתמלאה בתערובת המאסטר. חזור על הפעולה עם אותם שמונה מניות ליגנד או ממס.עבור שתי עמודות נוספות, שאפו שני מיקרוליטרים מתוך שמונת מלאי הליגנד או הממס הנותרים, והוסיפו אותם לעמודה רביעית בצלחת. חזור על כך לשני טורים נוספים. זה ייתן דגימות משולשות עבור כל 16 דגימות הליגנד והממס.הנח אטם A-Q-P-C-R מעל הצלחת. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 פעמים G למשך שתי דקות. הנח את הצלחת במכשיר ה-QPCR והפעל דנטורציה תרמית באמצעות הפרמטרים שצוינו קודם לכן בסיום הפעלת המכשיר.לחץ על כפתור הניתוח במסך. שמור את קובץ התוצאות. פתח את תוכנת ההסטה התרמית של החלבון.צור מחקר חדש בכרטיסיה מאפיינים. תן לזה שם ובכרטיסייה תנאים, פרט את הליגנדים. עבור ללשונית קבצי הניסוי, ייבא את קובץ התוצאות השמור והגדר את התוכן של כל אחד מהם.ובכן, עבור ללשונית הניתוח ולחץ על כפתור הניתוח. בחר בכרטיסייה שכפולים מהתפריט בצד שמאל של המסך כדי להציג את התוצאות. כמשולש.העריכו את מהימנות הנתונים על סמך מידת ההידוק של המשולשות. האם המשולש צריך להראות יכולת שחזור גרועה. בחן את הנתונים הגולמיים מקרוב.נתח את הנתונים הן בשיטת הבולטמן והן בשיטת הנגזרת. כדי להעריך את טמפרטורת ההיתוך, בחר בכרטיסיית תוצאות השכפול ובתרשים תוצאות השכפול, החלף את העלילה לפי כפתור בין נגזרת tm, boltzmann ו-TM. בחר בשיטה המעניקה יכולת שחזור גדולה יותר עבור הדגימה.עבור דגימות המציגות מעברים מרובים, כמעט תמיד עדיף להשתמש בשיטת הנגזרת במצב התכה מרובה. ייצא את התוצאות להמשך חקירה באמצעות Excel באמצעות הכרטיסיה ייצוא. התחל ניתוח זה על ידי יצירת טבלה באקסל של ריכוזי הליגנד וטמפרטורת ההיתוך.פתח את תוכנת המנסרה GraphPad וצור טבלת XY. הזן את הנתונים באמצעות העמודה X עבור ריכוזי הליגנד והעמודה Y עבור תוצאות טמפרטורת ההיתוך. בכרטיסיה ניתוח, בחר באפשרות התאמת עקומת רגרסיה לא ליניארית.כדי להזין את המודל הנכון, בחר חדש וצור משוואה חדשה. הכנס את המשוואה המתאימה ככריכת ליגנד אתר יחיד. בחר את התיבה כללים עבור ערכים התחלתיים והזן כללים עבור ערכים התחלתיים.הגבל את הפרמטר P כקבוע השווה להזנת הריכוז הסופי של החלבון. בחר ניתוח כדי לבצע את הניתוח, ניתוח נוסף כדי להתאים נתונים למודל שיתופי או כדי להתאים נתונים לעקומות. הצגת שינויים בינאריים בטמפרטורת ההיתוך מתוארים בטקסט הפרוטוקול הנלווה.שיטה זו שימשה למדידת האינטראקציה של הקסוקינאז עם גלוקוז. מסך ראשוני מצביע על KD סביר בין 0.2 ל -1.7 מילימולר. התוצאות של מסך גדול יותר מראות התאמה טובה למודל לאירוע קשירה בודד עם KD של 1.2 פלוס מינוס 0.1 מילימולר, ה-HETO SQUA L transferase WCBM המשוער מראה שינוי תרמי חזק בקישור ל-GTP.מסך ראשוני הציע KD של 200 עד 500 מיקרומולר. ניסוי מפורט מצביע על KD לכאורה של 120 פלוס מינוס 20 מיקרומולר. עם זאת, כאשר משתמשים בסולם לוגריתמי עבור ציר X, יש פער משמעותי בין המודל לניתוח הנתונים של אותם נתונים כאשר מודל שיתופי מראה התאמה מצוינת לנתונים, מה שמרמז על כך ש-WCBM הוא אנטי-שיתופי בקישור שלו ל-GTPA תוצאה יוצאת דופן למדי נצפית עם התמ"ג המשוער 60, אוקסי בטא די מנו, יור שתיים או, ACE WCBI.ללא ליגנד, ובריכוזי ליגנד גבוהים, נצפתה דפוס התכה חד-פאזי פשוט. עם זאת, בריכוזי ליגנד ביניים, נצפות שתי שיאי התכה נפרדים. המעבר בין שתי קבוצות הפסגות תלוי במינון על פני כל טווח הריכוזים של מודלים של ההיתוך הדו-פאזי.כסכום של חלק מהליגנד, תוצאות ליגנד חופשיות וגבוהות נותנות התאמה טובה לנתונים. התאמה זו משופרת על ידי אקסטרפולציה של התוצאה שנצפתה עבור ריכוז ליגנד גבוה לתפוסה מלאה. הנתונים שהתקבלו עבור שיעור ה-WCBI הקשור לליגנד מראים התאמה מצוינת למודל קשירה פשוט.עם KD של 58 פלוס מינוס שני מיקרומולר לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע או חמש שעות, כולל חזרות אם היא מבוצעת כראוי בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פלואורסצנטיות ורידים טיפטופ וקלורימטריית טיטרציה איזותרמית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו תלות בטמפרטורה וגיאומטריית STA. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע אומדן עבור קבוע הדיסוציאציה של אינטראקציה באמצעות שפעת סריקה דיפרנציאלית.

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת האנאיזוטרופיה הפלואורסצנטית כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבון תסמונת שוואכמן-יהלום (SBDS) המתויג פלואורופור לבין גורם התארכות דמוי 1 GTPase (EFL1). על דגירה של חלבוני SBDS עם ריכוזים הולכים וגדלים של EFL1, נצפתה עלייה מתמדת באנאיזוטרופיה, מה שמצביע על אינטראקציה מוצלחת בין שני החלבונים.

זיהוי מבוסס אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית של אינטראקציות חלבון-חלבון

סרטון זה מדגים קלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית — טכניקה לחקר האינטראקציה בין ביומולקולה לליגנד. הקישור של אפטמר DNA וליגנד תרמולבילי נחקר על ידי החלת מחזורי חימום וקירור חוזרים ונשנים על הדגימה וקבלת סריקות לאנליזה תרמודינמית.

סריקה דיפרנציאלית קלורימטריה לחקר DNA Aptamer-Thermolabile Ligand אינטראקציה

הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כדי לחקור אינטראקציות של קומפלקס קטליטי עם התחום בטרמינל C-המעכב של ε.

Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

אינטראקציות חלבון הן בלב של התפקוד של תא. טכניקות קלוריות ספקטרוסקופיות משמשות בדרך כלל כדי לאפיין אותם. כאן אנו מתארים אנאיזוטרופיה הקרינה ככלי לחקור את האינטראקציה בין החלבון מוטציה של תסמונת שווקמן-יהלום (SBDS) לבין הגורם דמוי התארכות 1 GTPase (EFL1).

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

כאן אנו מציגים bilayer שומנים בדם בהקשר של פלטפורמת microfluidic ללמוד אינטראקציות חלבון- phosphoinositide בשיטה ללא תווית המבוססת על אפנון pH.

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

הפעולה הרדיאלית הרדיאלית של Ligand Assay (DRaCALA) יכולה לשמש לזיהוי חלבונים קטנים מחייבים ליגנד של אורגניזם באמצעות ספריית ORFeome.

זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)

ניטור שינויים בטמפרטורת ההיתוך של חלבון יעד (כלומר,בדיקת משמרות תרמית, TSA) היא שיטה יעילה לבדיקת ספריות שברים של כמה מאות תרכובות. אנו מציגים פרוטוקול TSA המיישם פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית בסיוע רובוטיקה (nano-DSF) לניטור פלואורסצנטיות טריפטופן מהותית ופיזור גב אור להקרנת שברים.

פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

פרוטוקול זה מדגיש את עקרונות יישומים מעשיים של שלב והפרעה ניגודיות דיפרנציאלי (DIC)...

שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית

למדו כיצד להעריך קבועי דיסוציאציה לאינטראקציות חלבון-ליגנד באמצעות דיפרנציאל סריקת פלואורימטריה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר ויעיל של אפיניות קשירה בכימיה אנליטית וביוכימית.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

גלה סרטונים נוספים