נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את קבוע הדיסוציאציה עבור אינטראקציה של ליגנד חלבון. זה מושג על ידי הכנת תערובות של החלבון עם ריכוזים שונים של הליגנד יחד עם צבע אינדיקטורים. השלב השני הוא לחמם את הדגימות הללו תוך רישום הקרינה של המחוון כדי לנטר את התפתחות החלבון.

לאחר מכן, עקומות החלבון המתפתחות מומרים לסדרה של טמפרטורות התכה. השלב האחרון הוא להתאים את הנתונים הללו למודל מתאים להערכת קבוע הדיסוציאציה. בסופו של דבר, פלואורומטריית סריקה דיפרנציאלית משמשת להבנה טובה יותר של האינטראקציה של חלבון עם הליגנדים שלו.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו איזותרמית, טיטרציה, קלורימטריה ותהודה פלזמה על פני השטח הוא שניתן להשלים שיטה זו תוך מספר שעות באמצעות כמויות מתונות בלבד של דגימה במכשיר שכבר זמין ברוב המכונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכימיה של חלבונים, כגון הזיקה של ליגנדים לחלבונים והחוזק היחסי של אינטראקציות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שבחירת הדגימות לשימוש וניתוח הנתונים יכולים להיות קשים.

לפני שתתחיל בהליך זה, הכינו את הפתרונות הבאים. תערובת המכילה את הריאגנטים המפורטים בטבלה זו ומלאי של הליגנד המעניין בריכוז הגבוה ביותר הזמין, כמו גם שישה דילולים של פי עשרה מריכוז זה. אם ידוע קבוע דיסוציאציה משוער מנתונים קודמים, הכינו לפחות שני ריכוזים מעל ומתחת ל-kd.

טבלה לדוגמה מוצגת כאן. מכניסים 18 מיקרוליטר מהתערובת לכל אחת משמונה בארות. בצלחת A-Q-P-C-R, הוסף שני מיקרוליטר ממס לבאר הראשונה לכל אחת משבע הבארות הנותרות, הוסף שני מיקרוליטר מכל חבר בסדרת דילול הליגנד.

הנח אטם A-Q-P-C-R מעל הצלחת כדי להשיג אטימה טובה של הצלחת. הניחו מוליך ידני באמצע הצלחת, החליקו את החותם לצד אחד ואז חזרו על הפעולה על החצי השני של הצלחת. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 פעמים G למשך שתי דקות להסרת בועות אוויר.

לאחר מכן, הנח את הצלחת במכשיר QPCR שלב אחד. בחר באפשרות עקומת ההיתוך, מסנני הסלעים, ובחר את מהירות הרמפה המהירה. הפעל דנטורציה תרמית בסיום ריצת המכשירים.

לחץ על כפתור הניתוח במסך. שמור את קובץ התוצאות. פתח את תוכנת ההסטה התרמית של החלבון.

צור מחקר חדש בכרטיסיה מאפיינים. תן לו שם, ובכרטיסיה תנאים, פרט את הליגנדים. עבור ללשונית קבצי הניסוי וייבא את קובץ התוצאות שנשמר.

הגדר את התוכן של כל אחד מהם. ובכן עבור ללשונית הניתוח ולחץ על כפתור הניתוח כדי לנתח את התוצאות. בדוק שהחלבון בנוכחות ממס בלבד נותן תוצאה דומה לזו המוצגת באיור זה.

לאחר מכן, בחן את טמפרטורות ההיתוך שנצפו בתוצאות בכאב השכפול. ודא שזה מראה עלייה ברורה בטמפרטורת ההיתוך עם הגדלת ריכוז הליגנדים. נתונים אלה ישמשו כדי לספק ערך משוער עבור קבוע הדיסוציאציה כמתואר במאמר הנלווה.

פתרונות אלה נדרשים להליך לקביעת קבוע הדיסוציאציה, תערובת מאסטר כמפורט בטבלה זו ומלאי הליגנד ב-15 ריכוזים שונים, אשר ידוללו פי עשרה. בניסוי האחרון. באופן אידיאלי כלול ריכוזי ליגנד, לפחות שני סדרי גודל מעל ומתחת ל-kd המשוער, ומרכז את הריכוזים על ה-kd המשוער.

סדרת דילול לדוגמה מוצגת כאן. התמקדו בשבע מהנקודות בסדר גודל של ה-KD המשוער עם ארבע נקודות נוספות משני הצדדים. אם יש ברירה, כלול יותר נקודות בערכים רוויים.

הוסף 120 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל אחת משמונה הבארות בצלחת 96 בארות עם תחתית U כדי לשמש כמאגר לחלוקה נוחה של תערובת המאסטר. לאחר מכן השתמש בפיפטה של שמונה ערוצים כדי להוציא 18 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לעמודה אחת של צלחת PCR. חזור על חמש עמודות נוספות כדי לתת בסך הכל 48 בארות מלאות בתבנית שש על שמונה על הצלחת.

לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר מגבעולי הליגנד או הממס לכל אחת משמונה הבארות. בצלחת אחרת עם תחתית U של 96 בארות בעזרת פיפטה של שמונה ערוצים שאבו שני מיקרוליטרים של שמונה מלאי ליגנד או ממיסים שונים, והוסיפו אותם לעמודה אחת של צלחת ה-PCR שהתמלאה בתערובת המאסטר. חזור על הפעולה עם אותם שמונה מניות ליגנד או ממס.

עבור שתי עמודות נוספות, שאפו שני מיקרוליטרים מתוך שמונת מלאי הליגנד או הממס הנותרים, והוסיפו אותם לעמודה רביעית בצלחת. חזור על כך לשני טורים נוספים. זה ייתן דגימות משולשות עבור כל 16 דגימות הליגנד והממס.

הנח אטם A-Q-P-C-R מעל הצלחת. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 פעמים G למשך שתי דקות. הנח את הצלחת במכשיר ה-QPCR והפעל דנטורציה תרמית באמצעות הפרמטרים שצוינו קודם לכן בסיום הפעלת המכשיר.

לחץ על כפתור הניתוח במסך. שמור את קובץ התוצאות. פתח את תוכנת ההסטה התרמית של החלבון.

צור מחקר חדש בכרטיסיה מאפיינים. תן לזה שם ובכרטיסייה תנאים, פרט את הליגנדים. עבור ללשונית קבצי הניסוי, ייבא את קובץ התוצאות השמור והגדר את התוכן של כל אחד מהם.

ובכן, עבור ללשונית הניתוח ולחץ על כפתור הניתוח. בחר בכרטיסייה שכפולים מהתפריט בצד שמאל של המסך כדי להציג את התוצאות. כמשולש.

העריכו את מהימנות הנתונים על סמך מידת ההידוק של המשולשות. האם המשולש צריך להראות יכולת שחזור גרועה. בחן את הנתונים הגולמיים מקרוב.

נתח את הנתונים הן בשיטת הבולטמן והן בשיטת הנגזרת. כדי להעריך את טמפרטורת ההיתוך, בחר בכרטיסיית תוצאות השכפול ובתרשים תוצאות השכפול, החלף את העלילה לפי כפתור בין נגזרת tm, boltzmann ו-TM. בחר בשיטה המעניקה יכולת שחזור גדולה יותר עבור הדגימה.

עבור דגימות המציגות מעברים מרובים, כמעט תמיד עדיף להשתמש בשיטת הנגזרת במצב התכה מרובה. ייצא את התוצאות להמשך חקירה באמצעות Excel באמצעות הכרטיסיה ייצוא. התחל ניתוח זה על ידי יצירת טבלה באקסל של ריכוזי הליגנד וטמפרטורת ההיתוך.

פתח את תוכנת המנסרה GraphPad וצור טבלת XY. הזן את הנתונים באמצעות העמודה X עבור ריכוזי הליגנד והעמודה Y עבור תוצאות טמפרטורת ההיתוך. בכרטיסיה ניתוח, בחר באפשרות התאמת עקומת רגרסיה לא ליניארית.

כדי להזין את המודל הנכון, בחר חדש וצור משוואה חדשה. הכנס את המשוואה המתאימה ככריכת ליגנד אתר יחיד. בחר את התיבה כללים עבור ערכים התחלתיים והזן כללים עבור ערכים התחלתיים.

הגבל את הפרמטר P כקבוע השווה להזנת הריכוז הסופי של החלבון. בחר ניתוח כדי לבצע את הניתוח, ניתוח נוסף כדי להתאים נתונים למודל שיתופי או כדי להתאים נתונים לעקומות. הצגת שינויים בינאריים בטמפרטורת ההיתוך מתוארים בטקסט הפרוטוקול הנלווה.

שיטה זו שימשה למדידת האינטראקציה של הקסוקינאז עם גלוקוז. מסך ראשוני מצביע על KD סביר בין 0.2 ל -1.7 מילימולר. התוצאות של מסך גדול יותר מראות התאמה טובה למודל לאירוע קשירה בודד עם KD של 1.2 פלוס מינוס 0.1 מילימולר, ה-HETO SQUA L transferase WCBM המשוער מראה שינוי תרמי חזק בקישור ל-GTP.

מסך ראשוני הציע KD של 200 עד 500 מיקרומולר. ניסוי מפורט מצביע על KD לכאורה של 120 פלוס מינוס 20 מיקרומולר. עם זאת, כאשר משתמשים בסולם לוגריתמי עבור ציר X, יש פער משמעותי בין המודל לניתוח הנתונים של אותם נתונים כאשר מודל שיתופי מראה התאמה מצוינת לנתונים, מה שמרמז על כך ש-WCBM הוא אנטי-שיתופי בקישור שלו ל-GTPA תוצאה יוצאת דופן למדי נצפית עם התמ"ג המשוער 60, אוקסי בטא די מנו, יור שתיים או, ACE WCBI.

ללא ליגנד, ובריכוזי ליגנד גבוהים, נצפתה דפוס התכה חד-פאזי פשוט. עם זאת, בריכוזי ליגנד ביניים, נצפות שתי שיאי התכה נפרדים. המעבר בין שתי קבוצות הפסגות תלוי במינון על פני כל טווח הריכוזים של מודלים של ההיתוך הדו-פאזי.

כסכום של חלק מהליגנד, תוצאות ליגנד חופשיות וגבוהות נותנות התאמה טובה לנתונים. התאמה זו משופרת על ידי אקסטרפולציה של התוצאה שנצפתה עבור ריכוז ליגנד גבוה לתפוסה מלאה. הנתונים שהתקבלו עבור שיעור ה-WCBI הקשור לליגנד מראים התאמה מצוינת למודל קשירה פשוט.

עם KD של 58 פלוס מינוס שני מיקרומולר לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע או חמש שעות, כולל חזרות אם היא מבוצעת כראוי בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פלואורסצנטיות ורידים טיפטופ וקלורימטריית טיטרציה איזותרמית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו תלות בטמפרטורה וגיאומטריית STA. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע אומדן עבור קבוע הדיסוציאציה של אינטראקציה באמצעות שפעת סריקה דיפרנציאלית.