מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין מבנים תת-תאיים בבלוטות הרוק של העכברים. זה מושג על ידי חשיפה כירורגית תחילה של בלוטות הרוק מבלי לפגוע בהן. בשלב השני, החיה המורדמת משותקת בשלב המיקרוסקופ.

לאחר מכן, בלוטות הרוק ממוקמות בקפידה כדי לא לפגוע בתפקודן בשלב האחרון. העכבר מיוצב עם מחזיק מותאם אישית כדי למזער כל חפצי תנועה עקב פעימות הלב או הנשימה של החיה. בסופו של דבר, ניתן לדמות את הדינמיקה של המבנים התת-תאיים על ידי מיקרוסקופיה תוך-חיונית.

לפני ההרדמה, שקלו את העכברים כדי לקבוע את המינון הנכון של חומר ההרדמה. לאחר מכן, יש לגרום להרדמה מוקדמת על ידי שאיפת פלואור. ברגע שבעלי החיים מחוסרי הכרה, יש לאשר טשטוש כל 15 דקות על ידי צביטה ולשמור את העכברים מתחת למנורת חום למשך הניתוח.

עקוב אחר טמפרטורת הגוף של בעלי החיים באמצעות מדחום בדיקה פי הטבעת. כעת גלחו את צוואר העכבר עם זוג קוצץ חשמלי, ולאחר מכן השתמשו בספוג גזה ספוג אתנול כדי לנגב את הצד הגחוני של הצוואר, ולייבש את עודפי האלכוהול עם מגבון קים. לאחר מכן, השתמש בזוג פינצטה מעוקלת עמומה כדי להרים פיסת עור קטנה בקצה הצד התחתון של שרירי המעסה ולבצע חתך קטן.

הכנס את המספריים לחתך, כוון את הקצוות כלפי מעלה לכיוון החלק התחתון של העור ופתח את הלהבים מספר פעמים עד שהעור נפרד מהרקמה הבסיסית. לאחר מכן מתחילים ליד בסיס בלוטות הרוק היכן שצינור העצב וכלי הדם מחברים את הבלוטה לשאר הגוף. השתמש במספריים כדי לחתוך רצועת עור משוחררת ברוחב שלושה מילימטר ובאורך 10 מילימטרים.

לאחר ניקוי אזור הפצע, הפתח המתקבל יהיה בצורת אליפסה וגודלו בערך שמונה על 12 מילימטרים. שתי בלוטות הרוק יהיו גלויות. השתמש במזרק כדי למרוח ג'ל צימוד אופטי באמצע החיתוך, ולאחר מכן השתמש בחתיכות טריות של גזה סטרילית כדי לנגב את הג'ל לכיוון החלק החיצוני של הפתח עד להסרת כל הדם והשיער הרופף.

כעת, השתמשו בזוג פינצטה מספר שבע כדי למצוא את קצה בלוטת הרוק הימנית, ותפסו את רקמת החיבור כמה מילימטרים מעל החלק העליון של הבלוטה. לאחר מכן קרע את רקמת החיבור סביב הבלוטה מבלי לפגוע בפרנכימה. לאחר חשיפת הבלוטה, הפרד בעדינות את רקמת החיבור מהבלוטה, ושטוף כל דימום במי מלח.

וודאו שכל רקמות החיבור מופרדות והבלוטה חשופה במלואה. לפני הבאת החיה למיקרוסקופ, הניחו חתיכת גזה עבה וחבילת חום על במת המיקרוסקופ, וכסו גם את החלק העליון של חבילת החום בחתיכת גזה דקה. הניחו תלוש כיסוי מעל מרכז הבמה.

לאחר מכן מקם את העכבר על צדו הימני על גבי הגזה, ואבטח את החיה עם פיסת נייר דבק בצד הגחון של כף הרגל הימנית הקדמית ותפר משי מחובר סביב החותכות. צרו מתח מסוים בין החוט לכפה והצמידו אותם לבמה. עם יותר נייר דבק, בלוטת הרוק צריכה לנוח באופן טבעי.

באמצע החלקת הכריכה. השתמש בטריזי פלסטיק המחוברים לשלב המיקרוסקופ כדי לייצב עוד יותר את ראש העכבר ובית החזה. לאחר מכן הניחו חתיכה קטנה של עדשות לניקוי רקמה מעל הבלוטה.

הרחיבו מעט את הבלוטה והניחו מחזיק מותאם אישית מעל הבלוטה. ואז בחוזקה, חבר את המייצב לבמה עם מהדק מתכת ומסקינטייפ. מכסים את החיה בגזה וכרית חום ומנטרים את טמפרטורת הבלוטות החשופות בעזרת מדחום גמיש המצויד בבדיקה תרמית מיד לאחר ייצוב החיה, השתמש בתאורת אפי פלואורסצנטית כדי להתמקד על פני הבלוטה.

להעריך את זרימת הדם בנימים ואת המורפולוגיה הכללית של הרקמה. כדי לעורר את הגן GFP, השתמש בלייזר של 488 ננומטר. הגדר את שיא ההספק ל-0.5 מילי-וואט כדי למנוע פוטו-הלבנה לחלבון העגבניות הטנדם.

השתמש בלייזר של 561 ננומטר, והגדר את שיא ההספק למיליוואט אחד. כעת העריכו את יציבות הרקמה על ידי סריקה מוקדמת של האזור הנבחר. אם התכשיר אינו יציב, התאם את החיה בהתאם כדי למצוא את מישור המוקד המתאים.

במצב טרום. הזיזו בהדרגה את המטרה לכיוון החלקת הכיסוי עד שמבני האסאר, גרגירי ההפרשה וקרום הפלזמה נראים בבירור. לאחר מכן כדי לדמות את הדינמיקה של גרגירי ההפרשה, השתמש במהירות סריקה של 0.5 עד שתי שניות למסגרת ו-256 על 256 פיקסלים בקנה מידה מרחבי של 0.2 מיקרומטר לפיקסל.

על מנת לדמיין בצורה אופטימלית את הגרגירים ואת קרום הפלזמה, הגדר את העובי האופטי בין 0.9 ל -1.2 מיקרומטר. לאחר מכן, הקלט תמונה של שדה הראייה שתשמש כנקודת התייחסות. לבסוף, לעורר אקסוציטוזיס על ידי הזרקה תת עורית של 0.1 מיליגרם לק"ג של איזופרוטרנול ותמיסת מלח שהוכנו טריים.

דקה לאחר ההזרקה. היתוך של גרגירי ההפרשה עם קרום הפלזמה יתגלה על ידי עלייה בקרינה של GFP סביב הגרגירים ודיפוזיה של פפטיד העגבניות הטנדם לתוך הממברנות המגבילות שלהם. בעכבר העגבניות GFPM, האסינין מופיעים כמבנים מובחנים בבירור המבטאים GFP ציטוזולי ופפטיד עגבניות טנדם ממוקד ממברנה כפי שמצוין על ידי הקווים השבורים.

באסין אסר בודד תאי אסר מתוחמים על ידי פפטיד העגבניות הטנדם כפי שמצוין על ידי החצים. GFP מזוהה גם בגרעינים הנראים בבירור בתוך תאי ה-aser. GFP ציטוזולי המצוין על ידי ראש החץ אינו נכלל בגרגירי ההפרשה המופיעים כשלפוחיות עגולות כהות בקוטר של כ-1 עד 1.5 מיקרומטר.

כדי לדמיין אירועים אקזופיטיים, מוצג אזור מייצג של קרום הפלזמה המועשר בגרגירי הפרשה כפי שמצוין על ידי הכוכבית לאחר הזרקת האיזופרוטרנול. ניתן להבחין בעלייה ברמות הקרינה של GFP המסומנת על ידי החצים הירוקים סביב חלק מגרגירי ההפרשה הנמצאים בסמיכות לקרום הפלזמה. בנוסף, לאחר היתוך עם קרום הפלזמה, פפטיד העגבניות הטנדם מתפזר לתוך הממברנות המגבילות של גרגירי ההפרשה כפי שמודגש על ידי החצים האדומים.

לאחר 30 עד 40 שניות, גרגירי המזכירה קורסים בהדרגה והממברנות המגבילות שלהם משולבות בקרום הפלזמה האפיקלי. הגישה המוצגת כאן מייצגת פריצת דרך משמעותית בביולוגיה של התא מכיוון שהיא מאפשרת הדמיה של הדינמיקה של תהליך סחר ממברנה ספציפי בעכברים חיים.