שיטה לCulturing עוברי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע דיסוציאציה ותרבית in vitro של תאים עובריים של *C. elegans*. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול של כמויות גדולות של בעלי החיים. לאחר מכן, מבודדים ביצי מהפרטים הבוגרים.

לאחר מכן, מטפלים בביצים בכיטינאז כדי להמיס את קליפת הביצה. לבסוף, התאים מופרדים ידנית ונזרעים לתרבית. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות ביטוי של סמנים ספציפיים לתאים באמצעות אימונופלואורסצנציה, מיקרוסקופיה, אלקטרופיזיולוגיה וטכניקות של דימות סידן.

הדגמת הפרוצדורה תבוצע על ידי פוסט-דוקטורנט במעבדה. לאחר גידול של לפחות ארבעה צלחות של sea elegance לשלב הבגרות GR והכנת מצעים ותמיסות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, התחילו בבידוד הביצים על ידי הכנת מבחנה של תמיסת סטוק של לקטין בוטנים שהוכנה מראש.

הניחו כיסויי זכוכית (cover slips) שעברו עיקור באוטוקלאב לבארות של פלטה בעלת 24 בארות, והוסיפו 200 µL של לקטין בוטנים לכל כיסוי זכוכית; הדגירו למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאבו את התמיסה והשתמשו במים סטריליים לשטיפת הבארות, כדי להסיר את כל שאריות הלקטין של הבוטנים ולמנוע התקבצות תאים.

לאחר מכן, באמצעות מים סטריליים שעברו אוטוקלאב, שטפו את בוגרי ה-GR ממעטה האגר ואספו את התוךים לשתי מבחנות קוניות סטריליות של 50 milliliter. הניחו את המבחנות על קרח למשך עד חמש דקות כדי לאפשר לתולעים לשקוע לתחתית. באמצעות פיפט העברה, הסירו את המים והחליפו אותם במים סטריליים טריים שעברו אוטוקלאב. צנטריפוגו את התולעים ב-200 G למשך 10 דקות.

לאחר השטיפה האחרונה, השעו את התולעים במים סטריליים טריים והעבירו אותן לפרועת קונית סטרילית של 15 מיליליטר לפני צנטריפוגה חוזרת ב-200 G למשך 10 דקות. אם התולעים לא שקעו לחלוטין למשקע, הניחו את הפרועת על קרח למשך חמש דקות. לאחר שהתולעים שקעו לחלוטין, הסירו את המים והוסיפו חמישה עד שישה מיליליטרים של תמיסת ליזיס.

לאחר מכן, נערערו בעדינות את התוךה למשך חמש עד 10 דקות, ובכל שתי עד שלוש דקות, הניחו טיפה מהתוךה על זכוכית כיסוי ובדקו את התהליך תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שהתרחשה ליזיס. כאשר 72-80% מהתולעים עברו ליזיס, עצרו את תגובת הליזיס על ידי הוספה של תשעה מיליליטר של egg buffer. לפני הצנטריפוגה מהשלב הזה ואילך, הדליקו מבער בנזן והשאירו אותו דולק כדי למנוע זיהום חוזר של הביצים; הסירו בזהירות את העליון (supernatant) והשתמשו ב-egg buffer כדי לשטוף את המשקע ביסודיות שלוש עד ארבע פעמים, עד שהתמיסה תהיה צלולה. לאחר מכן, לאחר הסרת העליון האחרון כדי להפריד את הביצים משאריות גופות בעלי החיים, השעיקו את המשקע בשני מיליליטר של sterile egg buffer והוסיפו שני מיליליטר של 60% sucrose ב-egg buffer.

ערבבו היטב את הביצים בתמיסה לפני הצנטריפוגה למשך 20 דקות. ב-200 G, הוציאו בזהירות את המבחנות מהצנטריפוגה. הביצים יצופו בחלק העליון של התמיסה.

לכן, השתמשו בפיפט ובטיפים סטריליים של 1 millilitre כדי להעביר את הביצים למבחנה קונית סטרילית נקייה של 15 millilitre. השתמשו בבופר ביצים סטרילי כדי לשטוף את הביצים שלוש פעמים בעבודה תחת מabilis זרימה למינרית. כדי למנוע זיהום חיידקי, השהו את משקע הביצים ב-1 millilitre של kinase בריכוז 2 mg/mL והעבירו אותן למבחנה קונית נקייה של 15 millilitre.

נער את המבחנה בתנועת נדנדה במשך 10 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר, בהתאם למידת הטריות של האנזים, עד שמעריכים כי כ-80% מקליפות הביצים התעכלו. סבב את הביצים בצנטריפוגה ב-900 G למשך שלוש דקות. לאחר הסרה זהירה של הנוזל העליון (supernatant), הוסף שלושה מיליליטרים של מצע L 15, העבר את הביצים לפיתה בקוטר שישה סנטימטרים והתחל בדיסוציאציה ידנית באמצעות מזרק סטרילי של 10 מיליליטר עם מחט במידה 18.

כדי לנטר את מידת הדיסוציאציה, יש להניח טיפה מהסספנסיה בתוך צלחת פטרי נקייה ולבחון אותה תחת מיקרוסקופ. יש להמשיך בתהליך עד שכש-80% מהתאים יעברו דיסוציאציה. כדי להסיר גושי תאים, ביצים שלא עוכלו ולרובה שנבקעה, יש לסנן בעדינות את הסספנסיה דרך מסנן של חמישה מיקרון ולהעביר ארבעה עד חמישה מיליליטרים נוספים של מצע L 15 דרך המסנן כדי לשחזר את התאים לצורך תרבית תאים.

לאחר צנטריפוגה של התסנין ב-900 G למשך שלוש דקות, השעו שוב את התאים במצע L 15 מלא, בנפח של מילליטר אחד לכל באר, ואחסנו את הפלטות בתא אטום ולח בטמפרטורה של 20 °C באוויר הסביבה. על תאי עובר מבודדים להיצמד למצע כדי להבדיל. תהליך הבידול מתחיל כשעתיים עד שלוש שעות לאחר הזריעה ונמשך כ-24 שעות.

המאפיינים המורפולוגיים in vitro דומים להפליא לאלו in vivo. לדוגמה, כפי שמוצג כאן, נוירונים מסוג LM ו-PLM מפתחים רק שני שלוחות עצביות, כאשר אחת ארוכה מהשנייה, בדיוק כפי שהם עושים in vivo. דבר זה מרמז כי לפחות חלק מהמנגנונים המולקולריים המניעים את הדיפרנציאציה בתאי elegan הם אוטונומיים לתא, ולכן ניתן לשחזר אותם.

ניתן להבחין ב-in vitro גם בסמני חלבון ובמודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות הספציפיים לתאים. לדוגמה, alpha tubulin עם אצטילציה מופיע רק בנוירוני מגע בתולעי sea elgan, כפי שמוצג כאן: שלוחות של נוירוני מגע ב-in vitro נצבעות באמצעות נוגדן שהופק נגד alpha tubulin מאצטיל. בנוסף, כפי שניתן לראות בלוח זה, נוירוני מגע בתרבית מבטאים את התעלה המוטנטית הרעילה MEC four D, אשר גורמת למותם של נוירוני מגע ב-in vivo.

נוירונים המבטאים GFP שהוכנו מזן MEC four DPE 4G FP נוכחים בתחילה בתרבית, אך לאחר מכן ניווניים. עם זאת, בדיוק כפי שקורה in vivo, ניתן להציל את התאים מהמוות באמצעות טיפול ב-IDE וב-dantrolene, כפי שמוצג כאן. טכניקות של patch clamp משמשות לחקר תעלות קליום, תעלות לא סלקטיביות ותעלות תלויות-נשא דופמין בתאים מתרביות של sea elgan.

בשל גודל התא הקטן, על פיפטות זכוכית להיות בעלות קצה צר ולאחריו חרוט רחב כדי לפצות על התנגדות הכניסה המוגברת. בנוסף, מושג סיכוי גבוה יותר להצלחה על ידי הפעלת דחף של מתח גבוה על פיסת הממברנה הנמצאת תחת קצה הפיפטה, לעומת השגת גישה לתא כולו באמצעות יניקה שעלולה לפגוע בתא. באיור זה, כדי לחקור את תפקידם של תעלות סידן תלויות-מתח, נעשה שימוש ב-ION four כדי להחדיר חומר לממברנה וכדי לכייל נוירוני מגע המבטאים chameleon YC 2.12 לצורך דימוי סידן בהיעדרו או בנוכחותו של סידן.

בנוסף, נקבע כי ריכוז הסידן החופשי הממוצע בנוירונים של מגע הוא 200 nanomolar. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן הבידוד והתרבית in vitro של תאים עובריים של elegans.