שיטה לCulturing עוברי ג elegans תאים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפריד ולתרבית תאים אלגנטיים במבחנה, עובריים. זה מושג על ידי גידול כמויות גדולות של חיות קבר. הביצים הבאות מבודדות ממבוגרים.

לאחר מכן מטפלים בביצים בצ'יטינאז כדי להמיס את קליפת הביצה. לבסוף, התאים מנותקים ידנית ומצופים לתרבות. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות ביטוי של סמנים ספציפיים לתא באמצעות טכניקות אימונופלואורסצנטיות, מיקרוסקופיה, אלקטרופיזיולוגיה והדמיית סידן.

הדגמה של ההליך תהיה rel ti, מעבדה פוסט-דוקטורנטית. לאחר טיפוח לפחות ארבע צלחות של אלגנטיות ים לשלב המבוגרים של GR והכנת מדיה ופתרונות לפי פרוטוקול הטקסט. התחל בבידוד הביציות על ידי הוצאת שפופרת של תמיסת מלאי לקטין בוטנים שהוכנה בעבר.

מניחים פתקי כיסוי חיטוי בבארות של צלחת 24 בארות ומוסיפים 200 מיקרוליטר לקטין בוטנים לכל החלקת כיסוי לדגור למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את התמיסה והשתמשו במים סטריליים לשטיפת הבארות. לאחר הסרת כל עקבות לקטין בוטנים כדי למנוע גוש תאים.

לאחר מכן בעזרת מי חיטוי סטריליים, שטפו את מבוגרים ה- GR מלוחות האגר ואספו את המתלה בשני צינורות חרוטיים סטריליים של 50 מיליליטר. הניחו את הצינורות על קרח למשך עד חמש דקות כדי לאפשר לתולעים להתיישב לתחתית בעזרת פיפטת העברה, הסר את המים והחלף אותם בצנטריפוגת מים טרייה וסטרילית. התולעים ב -200 גרם למשך 10 דקות.

לאחר הכביסה האחרונה, החייאה, השעו את התולעים במים סטריליים טריים והעבירו אותן לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר לפני שמסתובבים שוב ב -200 גרם למשך 10 דקות. אם התולעים אינן גלוליות לחלוטין, הניחו את הצינור על קרח למשך חמש דקות. לאחר שהתולעים התייצבו לחלוטין, הסר את המים והוסף חמישה עד שישה מיליליטר של תמיסת ליזה.

לאחר מכן נדנד בעדינות את המתלה למשך חמש עד 10 דקות וכל שתיים-שלוש דקות, הנח טיפת מתלה על החלקת כיסוי ובדוק אם יש ליזה תחת מיקרוסקופ סטריאו. כאשר 72-80% מהתולעים עוברות ליזה, עצרו את תגובת הליזיס על ידי הוספת תשעה מיליליטר של מאגר ביצים לפני הסיבוב מנקודה זו והלאה, הדליקו מבער בונסן והשאירו אותו דולק כדי למנוע זיהום חוזר של הביצים, הסירו בזהירות את הסופרנטנט והשתמשו במאגר ביצים כדי לשטוף היטב את הגלולה שלוש עד ארבע פעמים עד שהתמיסה צלולה. לאחר מכן, לאחר הסרת הסופרנטנט הסופי כדי להפריד את הביצים מהרסוס פגרי בעלי החיים, השעו את הגלולה בשני מיליליטר של מאגר ביצים סטרילי והוסיפו שני מיליליטר של 60% סוכרוז במאגר הביצים.

מערבבים היטב את הביצים בתמיסה לפני הצנטריפוגה למשך 20 דקות. בטמפרטורה של 200 גרם, הסר בזהירות את הצינורות מהצנטריפוגה. הביצים יצופו בחלק העליון של התמיסה.

לכן, השתמש בצינור ובקצות מיליליטר סטרילי כדי להעביר את הביצים לצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר. השתמש במאגר ביצים סטרילי כדי לשטוף את הביצים שלוש פעמים תוך כדי עבודה מתחת למכסה המנוע הלמינר. כדי להימנע מהכנסת זיהום חיידקי, החייאה, השעו את הביצים הגלוליות במיליליטר אחד של שני מיליגרם למיליליטר קינאז והעבירו אותן לצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר.

נדנד את הצינור למשך 10 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר, תלוי בטריות האנזים כאשר כ -80% מקליפות הביצה מתעכלות. צנטריפוגה את הביצים בחום של 900 גרם למשך שלוש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט בזהירות, הוסיפו שלושה מיליליטר של L 15 בינוני, העבירו את הביצים לצלחת בקוטר שישה סנטימטרים והתחילו בפירוק ידני באמצעות מזרק סטרילי של 10 מיליליטר עם מחט בגודל 18.

כדי לפקח על מידת הדיסוציאציה, הניחו טיפת תרחיף לתוך צלחת פטרי טרייה וצפו במיקרוסקופ. המשך עד שכ-80% מהתאים מנותקים. כדי להסיר גושי תאים, ביצים לא מעוכלות וזחלים שבקעו, סנן בעדינות את התרחיף דרך מסנן של חמישה מיקרון והעביר ארבעה עד חמישה מיליליטר נוספים של מדיום L 15 דרך המסנן כדי לשחזר את התאים לתרבית התאים.

לאחר צנטריפוגה של המסנן ב-900 גרם למשך שלוש דקות, החייאת התאים במדיום L 15 שלם שיחקה מיליליטר אחד לבאר ואחסנה צלחות בתא אטום לח ב-20 מעלות צלזיוס באוויר הסביבה. על מנת להבדיל תאי אלגן עובריים מבודדים חייבים להיצמד למצע. תהליך ההתמיינות מתחיל כשעתיים-שלוש לאחר הציפוי ונמשך כ-24 שעות.

המאפיינים המורפולוגיים במבחנה דומים להפליא לאלה in vivo. לדוגמה, כפי שמוצג כאן, נוירוני מגע LM ו-PLM מפתחים רק שני תהליכים עצביים כאשר אחד מהם ארוך יותר מהשני כפי שהם עושים in vivo. זה מצביע על כך שלפחות חלק מהמנגנונים המולקולריים המניעים התמיינות בתאי אלגן הם אוטונומיים של התאים ולכן ניתן לסכם אותם.

ניתן להבחין גם בסמני חלבון במבחנה ושינויים לאחר תרגום שהם ספציפיים לתא במבחנה. לדוגמה, אלפא טובולין הוא נוירונים שבעים רק במגע באלגן הים כפי שמוצג כאן בתהליכי מבחנה של נוירוני מגע מכתימים עם נוגדן מורם כנגד אלפא טובולין שבע. ובנוסף, כפי שניתן לראות בפאנל זה, נוירוני מגע מתורבתים מבטאים את הערוץ המוטנטי הרעיל MEC four D, הגורם למוות של נוירוני מגע in vivo.

נוירונים המבטאים GFP שהוכנו מזן MEC Four DPE 4G FP קיימים בתחילה בתרבית, אך לאחר מכן מתנוונים. עם זאת, בדיוק כמו in vivo, ניתן להציל את התאים ממוות על ידי טיפול ב-IDE ובדנטרולן כפי שמוצג כאן. טכניקות מהדק טלאי משמשות לחקר תעלות אשלגן אוניק, אוניק, לא סלקטיביות ותלויות בטרנספורטר דופמין בתאים מתורבתים של אלגן ים.

בגלל גודלו הקטן של התא, פיפטות זכוכית חייבות להיות בעלות קצה קטן ולאחר מכן חרוט רחב כדי לקזז את התנגדות הקלט המוגברת. בנוסף, הצלחה גדולה יותר מושגת על ידי הפעלת דחף מתח גבוה על כתם הממברנה מתחת לקצה הפיפטה לעומת השגת גישה לתא שלם באמצעות יניקה שעלולה לפגוע בתא. באיור זה כדי לחקור את תפקידן של תעלות סידן מגודרות מתח, ION 4 משמש לחלחל את הממברנה ולכיול נוירוני מגע המבטאים זיקית YC שתי נקודה 12 להדמיית סידן בהיעדר או נוכחות של סידן.

בנוסף, נקבע כי ריכוז הסידן החופשי הממוצע בנוירוני מגע הוא 200 ננו-טוחנת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ותרבות מבחנה. ראו אלגנטיות, תאים עובריים.