Name: שיטה לCulturing עוברי ג elegans תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: למדו פרוטוקול מתקדם לגידול תאים עובריים של C. elegans בתרבית in vitro. השיטה מאפשרת הבעה ספציפית של גנים בכל תא ושימוש בטכניקות אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

כוכביות (*) מצביעות על צעדים חדשים או שונה בהשוואה לכריסטנסן et al. 1 1. התקנת חומר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך תרבית תאים דורש כמויות גדולות של ביצים מבודדות ממבוגרים הרה. לגדול ג elegans על 8P צלחות אגר זרע עם NA22 (זמין באמצעות ג elegans הגנטי Consortium - CGC) חיידקים לבודד כמויות גדולות של ביצים. בלוחות אלה הסכום של peptone משמש הוא 8 פעמים את הסכום שמשמש בדרך כלל לצלחות NGM. ריכוז peptone גבוה יותר מקיים את הצמיחה של חיידקים NA22 יעילות רב יותר, אשר בניגוד לOP50, לגדול בשכבות עבות. </li></ol> 8P צלחות מתכון: להמס 3 גרם NaCl, 20 גרם bacto-peptone, 25 אגר גרם ב1 ליטר של מים סטריליים מזוקקים וחיטוי ל30 דקות. בואו מגניב הבינוני על 55 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף מיליליטר סטרילי מסונן-1 של כולסטרול (5 מ&quot;ג / מיליליטר בEtOH), 1 מיליליטר של 1 MgCl 2, 1 מיליליטר של 4 MgSO ו25 מיליליטר של חיץ KP (המניה של 500 מיליליטר: 5 גרם K 2 HPO 4, 30 גרמו KH 2 PO 4, pH 6.00). יוצקים בינוני אגר נוזל לתוך 10 סנטימטר צלחות פטרי (25 מיליליטר / צלחת). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת להפיץ את פני השטח של כל צלחת אגר peptone מועשר השלם עם 1 מיליליטר של NA22 E. לילה בתרבית חיידק בתקשורת 2XYT (16 גרם Tryptone, תמצית שמרי 10 גרם, 5 גרם NaCl ב1 ליטר של מים סטריליים, pH 7.0) ב 37 ° C. חיידקים אלה מהווים מקור מזון בשפע שיהווה שכבה עבה התומכת בצמיחה של כמויות גדולות של מבוגרים הרה. השאר צלחות seeded לילה בטמפרטורת חדר, כדי לאפשר צמיחה של החיידקים. התהליך יכול להיות מואץ על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 4-5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החיות מורעבות ל8P צלחות שנזרעו. שטוף חיות מצלחת NGM מורעבת באמצעות 5-6 מיליליטר של חיץ או מים M9 ולהוסיף 1-2 מיליליטר של השעיה זו לכל צלחת 8P. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר צמיחה והכפלה של בעלי החיים האנטil הצלחות מאוכלסות במפגש על ידי מבוגרים הרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הביצים הנדרשות להכנת ג elegans תאים עובריים, ממבוגרים הרה להולדת באמצעות 5-6 מיליליטר של תמיסת תמוגה. </li></ol> מתכון פתרון תמוגה 5 מיליליטר של אקונומיקה טריות, 1.25 מיליליטר של 10 N NaOH ו18.5 מיליליטר של סטרילי H 2 O. תערובת זו חייבת להיות מוכנה טרי לפני כל שימוש. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הביצים מבודדות ממבוגרים הרה להולדת באמצעות חיץ ביצה: </li></ol> מתכון חיץ ביצה 118 mM NaCl, 48 מ&quot;מ KCl, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 25 HEPES מ&quot;מ, 7.3 pH, mOsm 340 אוסמולריות. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קליפת הביצה שמקיפה את הביצים על ידי טיפול עם chitinase. Chitinase הוא אנזים עם הפעילות הגבוהה ביותר ב-pH חומצי 25. ממיסים chitinase (Sigma, לקטלג לא. C6137) בpH חיץ הביצה 6.5 בריכוז סופי של 2 מ&quot;ג / מיליליטר. אחסן את מניית chitinaseפתרון ב -20 מעלות צלזיוס ב 1 מיליליטר aliquots בצינורות חרוטי 15 מיליליטר סטרילי. ניתן לאחסן aliquots ב -20 ° C עד כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ג תאים בתרבית elegans על coverslips autoclaved (בקוטר מ&quot;מ 12) מכוסה בקטיני בוטנים. ממיסים קטיני בוטנים במים סטריליים (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר). פתרון לקטיני בוטנים לא צריכים להיות מסונן או autoclaved. זה גם לא צריך להיות מטופלים עם אור האולטרה סגול. חנות 2 aliquots מיליליטר ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני מלא תרבית תאים (500 מיליליטר) מכיל L-15 מדיום תרבות 500 מיליליטר מGibco, 50 מיליליטר בסרום שור עוברי (חום מומת), 7.7 סוכרוז גרם (mOsm 45), 5 מיליליטר של 100 U / ml פניצילין ושל 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (2%). הבינוני המלאה לאחר מכן מסונן באמצעות מסנן נקבובית 0.20 מיקרומטר. </li></ol> שים לב שיש לי חיץ הביצה ובינוני תרבות osmolarity של 340 ו345 mOsm בהתאמה. ואכן, בניגוד לתאי יונקים, ג יש תאי elegans osmolarity גבוה יחסיתשצריך להילקח בספירה בעת הכנת פתרונות שיבואו במגע ישיר עם קרום הפלזמה של התאים. המתכונים של חומרים כימיים אלה הותאמו להגיע osmolarity הרצוי, אשר נמדד באמצעות osmometer 1. אין זה הכרחי להשתמש osmometer אם המתכונים האלה אחריו בדיוק וטיפול משמש בהכנת חומרים כימיים אלה. עם זאת, יש להשתמש osmoter אם פתרונות אחרים צריכים להיות מוכנים, שמתכונים אינם מדווחים כאן או בכל אחד מהפרסומים המשתמשים בג elegans תאים בתרבית. 2. בידוד ביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ להתחיל עם לפחות ארבעה 8P צלחות כדי לאסוף מספיק ביצים ל12 בארות של תאים בתרבית (ב24 גם צלחות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל עם ההליך להפשיר צינור אחד של פתרון מניות לקטינים בוטנים. הנח coverslips autoclaved בתחתית הבארות בצלחת 24 היטב ולהוסיף 200 μl של קטיני בוטנים לcoverslips. דגירה עבור שעה 1 או until התאים מוכנים להיות מצופה. להסיר לחלוטין את קטיני בוטנים ולשטוף את הבארות פעם אחת עם 1 מיליליטר של מים autoclaved סטרילי. הסרה מלאה של קטיני הבוטנים מcoverslips היא חיונית למניעת clumping תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המבוגרים הרה להולדת את הצלחות אגר באמצעות מים autoclaved סטרילי. אסוף את ההשעיה לשני צינור 50 מיליליטר חרוטי סטרילי. השאר את הצינורות על קרח לתקופה של עד 5 דקות, כדי לאפשר למשקעים של התולעים בחלק התחתון של הצינורות (*). הסר את המים עם טפטפת פלסטיק העברה ולהחליף אותו עם מים סטריליים autoclaved טריים. גלולה תולעים על ידי צנטריפוגה בטבלה העליונה ב XG 200 (~ 1,200 סל&quot;ד) עבור 10 דקות (*). חזור על השלב אחרון זה לפחות 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התולעים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי וגלולתם ב XG 200 (~ 1,200 סל&quot;ד) עבור 10 דקות (*). אל תשתמש במהירות גבוהה יותר צנטריפוגה כדי למנוע איסוף החיידקים בחלק התחתון של הצינור גם כן. לפעמים אחרי centrifugations התולעים אינם pelleted לחלוטין. After כל לשטוף ולפני הסרת supernatant, למקם את הצינורות במשך 5 דקות על קרח. במצונן תולעי מים לזרז לחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים ומוסיף 5-6 מיליליטר של תמיסת תמוגה (ראה חומר להגדיר). רוק ההשעיה בעדינות במשך דקות 5-10 ולאחר מכן להתחיל ניטור תמוגה תולעת תחת סטראו כל דקות 2-3. ירידה של השעיה ניתן גם להציב על coverslip לבדיקה קלה יותר. זמן הדגירה משתנה בהתאם לטריות של אקונומיקה; לקנות בקבוקים קטנים של אקונומיקה ולפתוח בקבוק חדש בכל חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ~ 70-80% מתולעים lysed (10 דקות מתחילת הדגירה), לעצור את תגובת תמוגה ידי הוספת 9 מיליליטר של pH חיץ הביצה 7.3 (ראה חומר להגדיר). צנטריפוגה ההשעיה ב XG 200 (~ 1,200 סל&quot;ד) עבור 10 דקות. מכאן ואילך יש לי מבער בונזן ב, על הספסל כדי למנוע זיהום מחדש של הביצים (*) זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה העברה פלסטיק סטרילית ולשטוף את הכדור 3-4x עם חיץ ביצה עד הפתרון הוא ברור. הקפד לערבב היטב גלולה במאגר הביציות בכל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים מופרדות מפגרי בעלי החיים באמצעות 30% תמיסת סוכרוז. Resuspend את הכדור ב 2 מיליליטר של חיץ סטרילי ביצה ולהוסיף 2 מיליליטר של 60% תמיסת סוכרוז (המניה בחיץ סטרילי ביצה). מערבבים היטב וצנטריפוגות במשך 20 דקות ב XG 200 (~ 1,200 סל&quot;ד) (*). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את הצינורות מצנטריפוגות. הביצים צפות בחלק העליון של הפתרון. שימוש pipettor P1000 וטיפים סטריליים, להעביר את כל הביצים לתוך צינור חרוטי מיליליטר 15 סטרילי טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של חיץ סטרילי ביצה לצינור צנטריפוגות ב XG 200 (~ 1,200 סל&quot;ד) עבור 10 דקות. חזור על לשטוף 3 x. ודא הביצים resuspended לחלוטין בחיץ הביצה במהלך כל שטיפה. </li></ol> 3. דיסוציאציה תאים עוברי לנהל את השלבים הבאים של ההליך בתנאים סטריליים באמצעות זרימה למינרית. בעוד בעלי חייםשמלה על צלחות חיידקים, שטיפה והטיפול בפתרון תמוגה המכיל אקונומיקה צריכה לחסל את רוב אם לא כל החיידקים. וכך באמצעות ברדס למינרית בשלב זה של ההליך זה מונע זיהום חדש של ההשעיה הביצה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ביצי pelleted ב 1 מיליליטר של 2 מ&quot;ג / מיליליטר chitinase (המניה בpH ביצת חיץ 6.5 (*)) ולהעביר אותם לצינור סטרילי חדש 15 מיליליטר חרוטי. רוק הצינור ל10-30 דקות בטמפרטורת חדר. זמן הדגירה המדויק משתנה בהתאם לטריות של האנזים, ואת הטמפרטורה של החדר ולכן צריך להיות שנקבע לכל הכנה. מומלץ להתחיל מעקב הביצים תחת המיקרוסקופ תרבית תאים הפוך לאחר 10 דקות של דגירה. הערה: בניסיון שלנו, ה-pH הנמוך מגבירה את הפעילות האנזימטית chitinase. מסיבה זו אנו משתמשים חיץ ביצה בpH 6.5 לפזר chitinase (מתכון שדווח לעיל, שבו רמת חומציות מותאמת ל6.5 באמצעות NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ~ 80% מקליפות הביצים מתעכלים על ידיטיפול chitinase (איורים 1 AB), גלולה הביצים על ידי צנטריפוגה ב900 XG (~ 2,500 סל&quot;ד) במשך 3 דקות (*). שימוש pipettor P1000 וטיפים סטריליים, להסיר בזהירות את supernatant ולהוסיף 3 מיליליטר של L-15 בינוניים (*). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הביצים לתוך צלחת בקוטר 6 סנטימטר ובעדינות לנתק את התאים באמצעות מזרק סטרילי 10 מיליליטר מצויד במחט G 18. לפקח על מידת הניתוק על ידי הצבת ירידה של השעיה לתוך צלחת פטרי פלסטיק טרי ועל ידי הצגה מתחת למיקרוסקופ. לא לשאוב אוויר לתוך המזרק במהלך הליך זה, כדי למנוע תאים מזיקים. המשך הניתוק עד ~ 80% מהתאים הם ניתקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה באמצעות 5 מסנן Millipore מיקרומטר סטרילי. השעיות תא חייבת להיות מסוננות כדי להסיר גושי תא, ביצים לא מעוכלות וזחלים בקעו. סנן 4-5 מיליליטר נוסף של L-15 תקשורת טריות דרך המסנן כדי לשחזר את כל התאים. אל תשתמשו בכוח מופרז במהלך שלב הסינון כדי למנוע damaging המסנן ו / או התאים. </li></ol> 4. Culturing תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ניתקו על ידי צנטריפוגה ב900 XG (~ 2,500 סל&quot;ד) במשך 3 דקות (*). שימוש pipettor P1000 וטיפים סטרילי להסיר בזהירות את כל supernatant. Resuspend תאי pelleted במדיום L-15 מלא וצלחת 1 מיליליטר / היטב. כמות בינונית הוסיף תלויה במספר 8P צלחות בשימוש, נקודת המפגש של התולעים על הצלחות, והסוג של ניסויים שיבוצעו בתאים. צפיפות התאים ניתן לקבוע באמצעות hemocytometer. עבור הקלטות תיקון מהדק ציפוי צפיפות של ~ 230,000 תאים / 2 סנטימטר הוא אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את צלחת 24 בארות במכל פלסטיק פלסטיק המכיל מגבות נייר רטובות, כדי למנוע אידוי של מדיום לתרבות. אחסן את המכל בחממה humidified על 20 מעלות צלזיוס, אוויר הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הם בדרך כלל מוכנים לניסויים בתוך 24 שעות כאשר הבידול ומפורש מורפולוגייםיון של סמני ה-GFP הושלם. יכולים להישמר תאים בתרבית עד 2 שבועות, אבל הם בדרך כלל בריאים ביותר עד 7-9 ימים לאחר ציפוי. הבינוני צריך להיות מוחלף פעם ביום כדי לשמור על תאים בריאים. </li></ol>

סי אלגנס הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לפענוח המסלולים הגנטיים מעורבים בפיתוח, התנהגות והזדקנות. הנוחות שלה נובעת בעיקר מההקלות שבה ניתן להשפיע מבחינה גנטית וממחזור החיים הקצר שלה. למרות הנוחות שלה, ג יש elegans מגבלותיו. ג תאי elegans הם זעירים ומוגבל בתוך ציפורן בלחץ המגבילה את היישום של שיטות הדורשות גישה ישירה לתאים, כגון טכניקות אלקטרו ותרופתיות, או בידוד של סוגי תאים ספציפיים, כגון פרופיל ביטוי גנים על ידי ניתוח microarray. ג</em...

elegans Caenorhabditis (סי אלגנס) הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לחקירת הבסיסים המולקולריים של תפקוד תאי, התמיינות, והתנהגות. בעוד הגנום, חילוף החומרים ומסלולי biosynthetic דומים לבעלי חוליות &quot;, העקיבות הגנטיות והמולקולרית שלו הן הרבה יותר גדולות 2. בין יתרונותיה לגודלה ואנטומיה פשוטה, המחזור המהיר שלה חיים (3 ימים ב25 מעלות צלזיוס), תוחלת חיים קצרה (2 שבועות) ומספר רב של צאצאים (&gt; 200) הם. בשל אופי hermaphroditic ומחזור חיים קצר, מניפולציות מולקולריות וגנטיות הן פשוט בג elegans, הכולל את הדור של בעלי חיים מהונדסים 3,4 והיישום של טכניקות עקומות למטה גן כגון התערבות RNA 5. ג גוף elegans וקליפת ביצה הם שקופים. לכן ניתן דמיינו תאים בקלות בשני המבוגרים והעובר באמצעות מיקרוסקופ רגיל. ב40 השנים האחרונות, ג elegans </em&gt; הקהילה יצרה משאבים רב ערך עבור ג מחקר elegans כולל אוסף גדול של מוטציות, knockouts וtransgenics, תיאור מפורט של האנטומיה ופיתוח 6,7, כולל השחזור המלא של מערכת העצבים 8, ולחלוטין הגנום רצף אשר מבואר וזמין לכל הקהילה גם ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com).</a> למרות יתרונות הרבים, חלקם גישות ניסיוניות כבר מאתגרות בג elegans. אלה כוללים את אלה שדורשים נגישות לקרום הפלזמה של התאים והבידוד של רקמות או סוגי תאים. ואכן C. רקמות elegans מוגבלות בתוך השלד שלה בלחץ ההידרוסטטי, שאינו מתעכל בקלות על ידי טיפול או בדטרגנטים האנזימטית. בסופו של 1990 מרים גודמן וג&#39;נט ריצ&#39;מונד חלוץ שיטות עבור קלטות אלקטרו של ג elegansנוירונים ותאי שריר באתר 9,10. בעוד שיטות אלו נתנו לנו תובנות חשובות עצבי ותפקוד שרירים in vivo, הם מאתגרים ותפוקה נמוכה. שיטות אלטרנטיביים ללמוד את תפקוד תא in vivo שפותחו, בעיקר בעיקר בסידן ההדמיה vivo באמצעות חיישני סידן מקודד גנטי כגון GCamP וCameleon 11-13. שיטות אלה אף, אינן מאפשרים שימוש בכלים תרופתיים משום שהם חלים על בעלי חי חיים בשלמותה. הניסיון הראשון בג culturing תאי elegans במבחנה בקנה מידה גדולה נעשו על ידי לרד בלום במהלך תקופת ההכנה של עבודת הדוקטורט שלו 14. למרבה הצער, קשיים עם הידבקות לקויה של התאים למצע, התמיינות תאים עני והישרדות מנעו את הקמתו של הפרוטוקול בתחילת כשיטת תרבית תאים חזקה. בשנת 1995 אדגר ועמיתיו פרסמו נוהלכדי לחקור את חלוקת תא והמורפוגנזה ידי בידוד והתרבות של C אחד. elegans עוברי 15. תאים עובריים שהושגו על ידי עיכול של קליפות הביצים עם שילוב של טיפול אנזימטי וניתוק ידני, המשיכו להתרבות, לייצר עד ~ 500 תאים 15. בהמשך לכך, ליונג ועמיתים לעבודה בתרבית מספר קטן של לסטומרים ללמוד המורפוגנזה מעיים. הם הראו כי במבחנה blastomere E המבודדת אחד המיוצר בתאי מעיים מקוטבים שיצרו מבנה מקביל ללומן מעיים על ידי אינטראקציה אחד עם השני דרך צמתים adherens פסגת 16. Buechner ועמיתיו גם דיווחו בשיטה דומה לC culturing. elegans תאים עובריים במבחנה 17. בהתבסס על עבודה מוקדמת זו, כריסטנסן ועמיתיו פיתחו פרוטוקול חזק עבור culturing C העוברי. elegans תאים במבחנה 1. הםהראה כי C המבודד. elegans תאים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים ולשמור על התכונות שיש להם in vivo, כולל הביטוי של סמנים ספציפיים בתא. כמה טכניקות שמאתגרות in vivo, יכולות להיות מיושמות על ג המבודד elegans תאים עובריים. אלה כוללים 1,18 19 אלקטרו, הדמיה וטכניקות immunochemical 20,21, כמו גם בידוד של סוגי תאים ספציפיים על ידי Cell-Activated פלורסנט מיון (FACS) לבניית ספריות cDNA תא ספציפי 22,23. ניתן ליישם טכניקות ג&#39;ין מציאה כגון התערבות RNA (RNAi) בג בתרבית elegans תאי 1 ושיטת תיוג מטבולי רומן באמצעות Azido סוכר ככלי לגילוי גליקופרוטאין פותחו לאחרונה במבחנת ג בתרבית תאי elegans 24. לסיכום, שיטת תרבית תאים מרחיבה את מערך oטכניקות ו שיכול להיות מיושמות על ג דגם elegans במאמץ לפענח את תפקוד גן בהקשר של האורגניזם חי. אנו מתארים כאן את הפרוטוקול לculturing ג elegans תאים עובריים במבחנה, המבוססת במידה רבה על הפרוטוקול שתואר לראשונה על ידי כריסטיאנסן ו1 עמיתים לעבודה.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-382</td><td></td></tr><tr><td>Difco אגר מגורען</td><td>VWR בינלאומי בע"מ</td><td>90000-784</td><td></td></tr><tr><td>בקטו טריפטון</td><td>VWR אינטרנשיונל בע"מ</td><td>90000-284</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים בקטו</td><td>VWR אינטרנשיונל בע"מ</td><td>90000-724</td><td></td></tr><tr><td>L-15 נוזלי L-15 בינוני (1x) של לייבוביץ</td><td></td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Invitrogen</td><td>16140-063</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>כיטינאז מ-Streptomyces Griseus</td><td>Sigma</td><td>C6137-25UN</td><td></td></tr><tr><td>NA22 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis המרכז</td><td></td><td></td>לגנטיקה</tr><tr><td>לקטין בוטנים</td><td>סיגמא</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>57903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>67528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס (2-אמין&#8211; thylether), N,N',N'- חומצה טטרחוצית (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>57653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<תת>2</תת></td><td>סיגמא</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזוקק אוטוקלאב H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>101-1000 &mu; l טיפים לפיפט כחול בוגר</td><td>ארה"ב Scentific</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפט מעוקר עטוף בנפרד</td><td>ארה"ב Scentific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>נפח משתנה ארגונומי (100-1000 &mu; l) פיפטור עם מפלט קצה</td><td>VWR International Inc.</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>עזר פיפט נייד, דראמונד</td><td>VWR אינטרנשיונל בע"מ.</td><td>53498-103</td><td></td></tr><tr><td>העברת פיפט פלסטיק סטרילי</td><td>VWR International Inc.</td><td>14670-114</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל שפופרת חרוטית </td><td>ארה"ב Scentific</td><td>1475-1611</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל שפופרת חרוטית</td><td>ארה"ב Scentific</td><td>1500-1811</td><td></td></tr><tr><td>סטרילית 18 מד מחטים</td><td>בקטון, דיקינסון ושות'.</td><td></td><td></td>305196</tr><tr><td>מזרקים סטריליים 10 מ"ל</td><td>בקטון, דיקינסון ושות'</td><td></td><td></td>305482</tr><tr><td>מסנני מזרק פלסטיק קורנינג 0,20 &mu; m גודל נקבוביות </td><td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr><tr><td>Acrodic 25 מ"מ מסנן מזרק w/5 &mu; m versapor ממברנה</td><td>VWR אינטרנשיונל בע"מ.</td><td>28144-095</td><td></td></tr><tr><td>60x15 מ"מ צלחת פטרי סטרילית</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-548</td><td></td></tr><tr><td>100x15 מ"מ צלחת פטרי סטרילית</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-912</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית בקוטר 12 מ"מ</td><td>VWR International Inc.</td><td>48300-560</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים שקופות 24 תחתית שטוחה היטב עם מכסה </td><td>תומס מדעי</td><td>6902A09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5- מלקחיים </td><td>עדינים כלים מדעיים עדינים</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5702</td><td>Eppendorf</td><td>022629883</td><td></td></tr><tr><td>מכסה מנוע</td><td></td><td></td><td></td>זרימה למינארי</tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך עם x10 מטרה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td></td><td></td><td></td> לח אוויר סביבתי</tr></tbody></table>

שיטה לculturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

סי אלגנס הוא מערכת מודל רבת עוצמה, שבו טכניקות גנטיות ומולקולריים הן ישימות בקלות. עד לאחרונה אם כי, טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים ובידוד של תאים מסוגים מסוימים, לא יכולים להיות מיושמות בג elegans. מגבלה זו הייתה בשל העובדה שרקמות מוגבלות בתוך ציפורן בלחץ שאינו מתעכל בקלות על ידי טיפול עם אנזימים ו / או חומרי ניקוי. בהתבסס על עבודה חלוצה מוקדם על ידי לרד בלום, כריסטנסן ועמיתים 1 פיתח שיטה חזקה לculturing ג elegans תאים עובריים בקנה מידה גדולה. ביצים מבודדות ממבוגרים הרה להולדת על ידי טיפול עם אקונומיקה / NaOH ולאחר מכן טופלו בchitinase כדי להסיר את קליפות הביצים. לאחר מכן תאים עובריים הם ניתקו על ידי pipetting הידני ומצופים על זכוכית מכוסה מצע בתקשורת מועשר בסרום. בתוך 24 שעות של תאי בידוד מתחיל להבחין על ידי שינוי מורפולוגיה ועל ידי הבעת marke תאים הספציפיrs. ג elegans תאים בתרבית בשיטה זו לשרוד עד 2 שבועות במבחנה והיה בשימוש במשך אלקטרו, immunochemical, והדמיה מנתח, כמו גם שהם כבר מסודרים ומשמשים לאפיון microarray.

C. elegans תאים בתרבית להבדיל ותא מפורש סמנים ספציפיים כריסטנסן ועמיתים באמצעות מכתים trypan הכחול הוכיחו כי&gt; 99% ג העוברי תאי elegans לשרוד את הליך הבידוד. ביום 9 ו22 לאחר ציפוי, 85% ו65% בהתאמה עדיין בחיים 1. ג העוברי המבודד תאי elegans חייבים לדבוק במצע על מנת לבדל. תאים שאינם מצליחים לדבוק גושי צורה ולא ברור אם הם ישרדו. התמיינות של התאים מתחילה 2-3 שעות...

אנו מתארים כאן פרוטוקול מתוקן לתרבות בקנה מידה גדולה של ג העוברי elegans תאים. עוברי ג elegans תאים בתרבית במבחנה באמצעות שיטה זו, מופיעים כדי לבדל ולשחזר את הביטוי של גנים באופן ספציפי בתא. טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מרקמות האחרות יכולות להיות מיושמות על ג elegans תאים בתרבית.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע דיסוציאציה ותרבית in vitro של תאים עובריים של *C. elegans*. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול של כמויות גדולות של בעלי החיים. לאחר מכן, מבודדים ביצי מהפרטים הבוגרים.לאחר מכן, מטפלים בביצים בכיטינאז כדי להמיס את קליפת הביצה. לבסוף, התאים מופרדים ידנית ונזרעים לתרבית. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות ביטוי של סמנים ספציפיים לתאים באמצעות אימונופלואורסצנציה, מיקרוסקופיה, אלקטרופיזיולוגיה וטכניקות של דימות סידן.הדגמת הפרוצדורה תבוצע על ידי פוסט-דוקטורנט במעבדה. לאחר גידול של לפחות ארבעה צלחות של sea elegance לשלב הבגרות GR והכנת מצעים ותמיסות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, התחילו בבידוד הביצים על ידי הכנת מבחנה של תמיסת סטוק של לקטין בוטנים שהוכנה מראש.הניחו כיסויי זכוכית (cover slips) שעברו עיקור באוטוקלאב לבארות של פלטה בעלת 24 בארות, והוסיפו 200 µL של לקטין בוטנים לכל כיסוי זכוכית; הדגירו למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאבו את התמיסה והשתמשו במים סטריליים לשטיפת הבארות, כדי להסיר את כל שאריות הלקטין של הבוטנים ולמנוע התקבצות תאים.לאחר מכן, באמצעות מים סטריליים שעברו אוטוקלאב, שטפו את בוגרי ה-GR ממעטה האגר ואספו את התוךים לשתי מבחנות קוניות סטריליות של 50 milliliter. הניחו את המבחנות על קרח למשך עד חמש דקות כדי לאפשר לתולעים לשקוע לתחתית.

a-method-for-culturing-embryonic-c-elegans-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה שלמים תרבות העובר מאפשר לנו עכבר התרבות עוברי...

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה...

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

סרטון זה מציג שיטה לבידוד ותרבית סטרילית של תאי C. elegans עובריים  במבחנה.

עיכול אנזימטי ודיסוציאציה ידנית: שיטה להכנת עוברים מסוג C. elegans לתרבית תאים

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

כאן אנו מפרטים פרוטוקולים שתוכננו במיוחד לניטור פגמים מורפוגניים המתרחשים בשלבים מוקדמים ומאוחרים של התארכות עוברית של הנמטודה Caenorhabditis elegans. בסופו של דבר, פרוטוקולים אלה נועדו לזהות גנים המווסתים את השלבים הללו ולאפיין את הדרישות הדיפרנציאליות שלהם לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

הפרוטוקול מתאר תכנון שבבים מיקרופלואידיים פשוטים ומתודולוגיית מיקרו-פבריקציה המשמשת לגידול C. elegans בנוכחות אספקת מזון רציפה למשך עד 36 שעות. מכשיר הגדילה וההדמיה מאפשר גם הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה לסירוגין של תהליכים תאיים ותת-תאיים במהלך הפיתוח במשך מספר ימים.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית נמטודות בודדות על מדיה מוצקה למעקב אחר פרמטרים פיזיולוגיים לכל החיים וכימות פלואורסצנטי. מערכת תרבית זו כוללת מחסום חומצה פלמיטית סביב בארות תולעים בודדות כדי למנוע מבעלי חיים לברוח, ומאפשרת שימוש בהתערבויות מרתיעות, כולל חיידקים פתוגניים וגורמי עקה כימיים.

תרבות ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans בודדים על מדיה מוצקה לניטור פלואורסצנטי אורכי והתערבויות מרתיעות

למדו פרוטוקול מתקדם לגידול תאים עובריים של C. elegans בתרבית in vitro. השיטה מאפשרת הבעה ספציפית של גנים בכל תא ושימוש בטכניקות אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה.

שיטה לCulturing עוברי

גלה סרטונים נוספים