איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

פרוטוקול זה מאפשר מעקב יעיל של שושלת תאים וזהויות בעוברים חיים ובו זמנית מנתח מטומטמים מפורטים של תאים כגון אקסונים ודנדריטים בפיתוח נוירונים C.elegans. בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקאלית, מיקרוסקופיית תאורת מישורים סלקטיבית הפוכה בתצוגה כפולה או diSPIM מציעה אות גבוה יותר לרעש, רזולוציה מרחבית איזוטרופית יותר, ומתאימה יותר להדמיית vivo לטווח ארוך. התחל על ידי הוספת 500 microliters של 1%methylcellulose פתרון לתוך הדיכאון של שקופית מיקרוסקופ קעור.

באמצעות בורר חוט פלטינה, להעביר מבוגרים מצלחת בינונית צמיחה nematode לתוך פתרון M9 מתילקלולוז. השתמשו בטיפים המחודדים של 18 מחטי מזרק כדי לחתוך כל חיה רוחבית באמצע הגוף לפחות לעובר אחד עד ארבעה תאים. עם שופר שאפתן מוחזק בעדינות בין השיניים, לפני מילוי פיפטה microcapillary עם 10 עד 15 microliters של חיץ M9 בעדינות לשאוף כמה עוברים מן השקופית לתוך נימי.

מחלקים את העוברים למלבן המרכזי של המכסה של תא הדמיה מפלדה מלא במאגר M9 טרי. כוון בעדינות את העוברים אנכית כך שהציר הארוך של כל עובר יצב לציר הארוך של העטיפה. לאחר מכן מניחים את תא הדמיית הפלדה לתוך מחזיק הדגימה על הבמה של diSPIM.

כדי להכין את העוברים להדמיה, פתח את מנהל המיקרו והגדר את עוצמות הלייזר ל-179 מיקרו-וואט 0.5% שקילות עבור 488 ננומטר ו-79 מיקרו-וואט 0.25% שקילות עבור 561 ננומטר. הכיול בין התאמת תוכנה לפלט לייזר אמיתי חייב להיעשות מראש על מנת להגדיר את הטווח עבור מיקרו וואט ספציפי. בתפריט תוספים, בחר בקרת התקן והחיל diSPIM הדמיה מדעית כדי לפתוח את ההדמיה המדעית המיושמת כפולה תצוגה הפוכה חלון מיקרוסקופיית תאורת מישור סלקטיבית.

תחת הכרטיסיה רכישה, ודא שה הפרמטרים מוגדרים כמצוין. תחת הכרטיסיה פוקוס אוטומטי, הגדר את הפרמטרים כמצוין. שים לב כי ערוץ הפוקוס האוטומטי צריך לציין את ערוץ הפלואורסצנטיות הגרעינית לניסויי הקו המתוכננים.

סמן את תיבות הקרן והדף עבור נתיב A או B ולחץ על שידור חי כדי להתחיל ברכישת התמונה. ייפתח חלון תצוגה חיה. לאחר מכן צייר תיבה סביב העובר המעניין כדי לבחור את אזור ניתוח הפוקוס האוטומטי של העובר ולחץ על התחל רכישה כדי ליזום את לכידת התמונה הרב-מידית לטווח הארוך.

לצפייה בתמונה, עיבוד וניתוח שושלת תאים, לאחר הורדה וחילוץ של חבילת התוכנה, לחץ פעמיים על הקובץ CytoSHOW_app. jnlp כדי להתחיל להפעיל את CytoSHOW. תחת תפריט הקובץ, בחר מנהל מיקרו צג חדש ו- diSPIM כדי לאתר את תיקיית ערכת נתוני הבסיס שבה נשמרו תמונות מנהל המיקרו הגולמיות.

בחר כל תיקיית נקודת זמן ולחץ על פתח. חלונות ניווט רב-מידיים ייפתחו באופן אוטומטי הן עבור SPIM A והן עבור SPIM B.באמצעות כלי בחירת המצולע, לחץ ממש מחוץ לקצוות האחוריים, האחוריים, הגביים והפינטריים של העובר המעניין כדי ליצור תבנית עניבת פרפר מעל העובר הן בתצוגות SPIM A והן בתצוגות SPIM B ולחץ על diSPIM. יישר את הערוצים הירוקים והרדומיים עבור כל זרוע SPIM ולחץ שוב על diSPIM.

המשמרות יופעלו בכל חלונות המיקום האחרים. לאחר מכן, לחץ על diSPIM והתמזג כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח של אמצעי אחסון גולמיים של נתיך diSPIM ולהגדיר את הפרמטרים כפי שצוין. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על כן וציין את ספריית הפלט שבה יש לשמור את הקבצים המעובדים לפני שתלחץ על אישור. בחלון התצוגה המקדימה, הזז את פס הגלילה לנקודת זמן שתיים מהחלון והזז את מחוון z עד שהתצוגה תוצג ישירות לאורך הציר הארוך של העובר.

הזז את פס הגלילה T אחורה לנקודת הזמן הראשונה בחלון התצוגה המקדימה ולהשתמש בכלי בחירת הקו כדי לצייר קו מהגרעין העגול ביותר בגחון דרך המישור של לוחות המטה-פאס של תא AB. לחצו על לחצן התצוגה המקדימה של diSPIM כדי לשמור את ההתאמות העדינות בכיוון של עוצמת הקול עם התמונה בתצוגה מקדימה. הגדר את פסי הגלילה של חלונות צג diSPIM לנקודות זמן ההתחלה והסיום של טווח התמונות המלא לעיבוד.

לאחר מכן לחץ על אישור. לניתוח שושלת תאים יעיל ומדויק, חיוני להשיג כיוון ADL מדויק של נפחי הנתונים לפני עיבוד ליל הכוכבים. כדי לפתוח את סדרת מעקב שושלת סטארי לילה ב AceTree, לפתוח את הקובץ AceTree מותאם אישית שסופקו ובחר לפתוח קובץ להגדיר כדי לאתר את ספריית הפלט שצוין קודם לכן. פתח את תיקיית המשנה של הנתיך עבור העובר המעניין ובחר את הקובץ הערוך.

לאחר מכן לחץ על פתח והמשך עם הפריט החזותי והעריכה של שושלת היוחסין כפי שתואר קודם לכן. פרוטוקולים ממוטבים אינם גורמים לפוטוטוקסיות הניתנת לגילוי לעוברים כפי שהוערכה על ידי זמן הבקיעה והעיתוי הקשור לאבני דרך התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול זה כפי שהודגם, התאים הבלתי מזוהים בחלבון פלואורסצנטי ירוק מהוסס זה המבטאים זן נמטודה נקבעו כך שיתאימו לנוירונים מוטוריים, לתא התעלה הפרשתי ולשני תאי שריר.

הנוירונים שזוהו עוצבו בצורה אלכסית כבר לפני 360 דקות לאחר ההפריה עם הציר התאי הארוך יותר המייצג את הציר הבא עבור נויריט יציבה. מ 385 עד 410 דקות לאחר ההפריה, נויריטס RMDD המורחבת כ שישה מיקרומטרים לפני גופי התא. מ 415 עד 445 דקות לאחר ההפריה, שני neurites המורחבת הגבית לתוך ומסביב טבעת העצבים המשוערת.

בממוצע, כל נויריט RMDD הרחיב כ 11 מיקרומטרים מגוף התא לפני עמידה סינכרונית עמיתו contralateral בשיא הטבעת. יחד, נתונים אלה מראים כי תכונות התפתחותיות עצביות עבור תאים הניתנים לזיהוי יחיד מסוגלים להיבדק, להשוות ולכרות באמצעות פרוטוקול משולב זה. חשוב לזכור לכוון את העוברים אנכית כך שהציר הארוך של כל עובר יצב לציר הארוך של העטיפה.

באמצעות פרוטוקול זה, התחלנו לחקור את מערכת העצבים העוברית המתהווה מכל הזוויות. לדוגמה, במהלך לידת תאים, הגירה והתבראות, היווצרות נוירית, תולדה ופציקולציה.