הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic
7 באוגוסט 2013
אנו מתארים שיטה אנליטית להעריך את החיים של גלוטמט בממברנות astrocytic מהקלטות אלקטרו של זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים.
המטרה הכללית של הניסוי היא להעריך את מהלך הזמן של פינוי גלוטמט מממברנות של אסטרוציטים בעקבות שחרורו מסינפסות מעוררות. השלב הראשון בתהליך זה הוא הקלטה של התרחשות הובלת גלוטמט המופעלת סינפטית מאסטרוציטים בחתכי מוח חדים (acute brain slices), בהיעדרו ובנוכחות של ריכוז תת-רווי של TBOA, אנטגוניסט רחב-ספקטרום לטרנספורטרים של גלוטמט. השלב השני הוא ניתוח ההקלטות כדי לבודד את זרמי הטרנספורטרים של גלוטמט המופעלים סינפטית מכל שאר מרכיבי התגובה המופעלה.
בשלב הבא, מוערך מהלך הזמן של הסינון על ידי ניתוח זרמי הנשא שנרשמו בנוכחות TBOA, תוך חיסור זרם הסינון מתוך התרחשות ההובלה שנרשמה בתנאים מבוקרים. כך מתקבל מהלך הזמן של פינוי גלוטמט מממברנות של אסטרוציטים. התוצאות מראות שבמרכז ההיפוקמפוס של העכבר, אסטרוציטים זקוקים רק למספר מילישניות כדי להסיר גלוטמט שהשתחרר סינפטית מהמרחב החוץ-תאי.
גישה זו מספקת כלי רגיש לזיהוי שינויים בקיבולת הספיגה של אסטרוציטים באזורי מוח שונים במהלך תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. היתרון המרכזי של גישה זו על פני שיטות אחרות המבוססות, למשל, על ניתוח דחיקה של אנטגוניסטים לקולטני גלוטמט המתנתקים במהירות מאינדיקטורים פלואורסצנטיים לגלוטמט או על סימולציות מ கணשב של תגובת דיפוזיה, הוא שהיא מספקת רזולוציה זמנית גבוהה וקריאה ניסיונית ישירה של פינוי גלוטמט מאסטרוציטים. שיטה זו מאפשרת לנו להבין את הדינמיקה המרחבית והזמנית של ההעברה הסינפטית במוח.
הדבר יכול לסייע לנו לפרש שינויים פתופיזיולוגיים ברמות הגלוטמט, בדיפוזיה ובספיגה העלולים להתרחש בהפרעות נוירולוגיות מסוימות, כגון מחלת אלצהיימר. התחילו את הפרוצדורה על ידי ביצוע חמישה חתכים במוח של עכבר שפוצץ באמצעות סכין מנתחים. ראשית, הסירו את הפקעות הריח ואת קליפת המוח הפרונטלית.
שנית, הסירו את המוח הקטן (cerebellum). לאחר מכן, הסירו את האונות הרקות (temporal lobes) השמאלית והימנית. לאחר מכן, הפרידו בין שתי המיספרות של המוח באמצעות חיתוך סגיטלי מרכזי.
בשלב הבא, הדביקו את המשטח הצדי של כל נתח מוח ללוח הבסיס הקר של ה-vibram. הצד הגבי (dorsal) של המוח צריך להיות פונה לעבר להב ה-Vibram, והצד הבטני (ventral) של המוח צריך להיות במגע עם בלוק האגר, הרחק מלהב ה-vibrato. לאחר מכן, קבעו את לוח הבסיס של ה-vibrato לתא הניתוח.
הגדירו את עובי הפרוסה ל-250 micrometers וכווןנו את רוחב הלהב לפני הפריסה. לאחר שהלהב עבר דרך הקורטקס וההיפוקמפוס, השתמשו בסקלפל כדי להפריד את הקורטקס וההיפוקמפוס מהמוח האמצעי. לאחר מכן, מקמו פרוסה בתא הטבילה בטמפרטורה של 34 degrees Celsius, לאחר השראת הפרוסות בטמפרטורה של 34 degrees Celsius למשך 30 דקות.
יש להניח להם להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש בהם להקלטות אלקטרופיזיולוגיות בהליך זה, ולאחר מכן להעביר פרוסה לתא ההקלטה. יש לבחון את הפרוסה חזותית תחת תאורת נקודה או I-R-D-I-C. ניתן לזהות אסטרוציטים לפי גוף התא הקטן והגרעין הבולט שלהם לצורך סטימולציה סינפטית.
מקמו אלקטרודה ביפולרית מפלדת אל חלודה במרחק של כ-100 micrometers מהאסטרוציט שאתם מתכננים לבצע לו פאץ'. בצעו פאץ' לאסטרוציט והגיעו לתצורת תא שלם (whole cell configuration) על ידי הפעלת שאיבה עדינה מאוד. לאחר מכן, הדריגו בין גירויים בודדים לגירויים בזוגות מדי 10 עד 20 שניות, כדי לבודד את החלקים המהשכילים של התרחאות הובלה המופעלות סינפטית.
ראשית, חשבו ממוצע של לפחות 20 סריקות (sweeps) שהושגו באמצעות גירויים זוגיים בתנאי בקרה, ובנוכחות של 10 µM של TBOA, מעכב רחב-ספקטרום של נשאי גלוטמט. לאחר מכן, חשבו ממוצע של מספר זהה של סריקות שהושגו באמצעות גירויים בודדים בתנאי בקרה ובנוכחות של 10 µM TBOA; החסירו את עקומת הממוצע שהושגה בגירויים בודדים מעקומת הממוצע שהושגה בגירויים זוגיים. שלב זה מאפשר לבודד את ה-STO הגאומטרי ואת זרם האספירין (potassium current) המתמשך שהופעל על ידי הגירוי השני.
בשלב הבא, העבירו את העקבה הממוצעת שהתקבלה מגרויים בודדים ברווח זמן התואם למרווח ה-PUL שבו נעשה שימוש להעברת פולסים זוגיים, והפחיתו תגובה ממוצעת מוזזת בזמן שהתקבלה מגרויים בודדים מהתגובה הממוצעת לגירוי השני שהתקבלה קודם לכן. שלב זה מבודד חלק מועצם של זרם הנשא שגורר הגירוי השני. ברוב המקרים, שלב זה מסיר לחלוטין את זרם האשקום המתמשך.
במקרה זה, בידוד ה-FSTC הושלם וניתן להמשיך בניתוח הדקונבולוציה (deconvolution) ולהגיע למהלך הזמן של פינוי גלוטמט מאסטרוציטים. עם זאת, במקרים מסוימים, עדיין קיים זרם אשלגן קבוע קטן ויש צורך בניתוח נוסף. מדדו את האמפליטודה של זרם האשלגן הקבוע שנותר לאחר הביצוע.
הניתוח שתואר קודם לכן מנרמל את האמפליטודה של הפונקציה המונו-אקספוננציאלית לאמפליטודה של זרם האסס של האסנץ' של האשלגן, על ידי קביעת האמפליטודה של זרם האסנץ' של האשלגן שנמדד כ-a במשוואה זו. עם זאת, קבוע זמן העלייה מייצג את ערך העלייה הממוצע שהוערך בניסויים נפרדים שבהם בודד זרם אסנץ' של אשלגן. באופן פרמקולוגי, באמצעות ריכוז רווי גבוה של TBOA, מחסירים לאחר מכן את הפונקציה המונו-אקספוננציאלית שהתקבלה מה-FSTC ומזרם האסנץ' של האשלגן.
להשלמת בידוד ה-FSTC. כדי לבודד את הופעת ההובלה המופעלת על ידי פלאש. חשבו ממוצע של לפחות 20 סריקות שהתקבלו כאשר נתיב האור פתוח בתנאי בקרה וב-10 micromolar TBOA, ולאחר מכן חשבו ממוצע של אותו מספר סריקות שהתקבלו כאשר נתיב האור סגור בתנאי בקרה וב-10 micromolar TBOA. החסירו את העקבה הממוצעת שהתקבלה כאשר נתיב האור חסום מהעקבה הממוצעת שהתקבלה כאשר נתיב האור פתוח.
שלב זה מאפשר להסיר את ארטיפקט הגירוי ולבודד את ה-FTCs. בשלב זה, התאימו את זרם ההובלה, בין אם FSTC או FTC, שהוקלט בתנאי בקרה וב-10 µM TBOA, והתאימו אותם לפונקציה מרובת-מעריכים; צרו פונקציה בעלייה מיידית הדועכת באופן מונו-מעריכי על פי פונקציה זו, ושמתארת בצורה הטובה ביותר את שלב הדעיכה של זרם המוביל שהוקלט ב-10 µM TBOA. לאחר מכן, גזרו את הפונקציה המונו-מעריכית מההתאמה של זרם המוביל שהוקלט ב-10 µM TBOA כדי להפיק את המסנן. לאחר מכן, גזרו את המסנן מההתאמה של זרם המוביל בתנאי בקרה.
כדי לקבל הערכה כמותית של מהלך הזמן הכולל של פינוי הגלוטמט, חשב את ה-OID של צורת הגל. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שאירועי ההובלה נרשמו תחת תנאים ניסיוניים שבהם המסנן פועל במשטר ליניארי ומכניס עיוותים ליניאריים בלבד להובלה. ניתן לוודא זאת על ידי בדיקת מניפולציות המשנות את גודל זרם ההובלה.
אין לשנות את מסלול החתמה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בהקלטות מאסטרוציטים כדי להפיק מידע על גלוטמט, דיפוזיה וספיגה במוח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה אנליטית להערכת זמן החיים של גלוטמט בממברנות של אסטרוציטים באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים. המיקוד הוא בהבנת פינוי הגלוטמט מאסטרוציטים בעקבות שחרור סינפטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- הובלת גלוטמט
רקע
- גלוטמט הוא מוליך עצבי מרכזי במוח.
- אסטרוציטים ממלאים תפקיד קריטי בפינוי גלוטמט מהמרווח הסינפטי.
- הבנת הדינמיקה של גלוטמט חיונית להשגת תובנות לגבי התפקוד הסינפטי.
- טכניקות אלקטרופיזיולוגיות יכולות לספק מידע מפורט על פעילות הנשאים.
מטרת המחקר
- להערכת מהלך הזמן של פינוי גלוטמט מממברנות של אסטרוציטים.
- לניתוח ההשפעות של אנטגוניסטים של נשאי גלוטמט על זרמי הנשאים.
- לספק תובנות לגבי היעילות של סלקת גלוטמט בהיפוקמפוס של עכבר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקלטה של הובלת גלוטמט המופעלת סינפטית בחתכים מוחיים חריפים.
- שימוש ב-TBOA, אנטגוניסט רחב-ספקטרום של נשאי גלוטמט, להערכת פעילות הנשאים.
- בידוד זרמי הנשאים מרכיבים אחרים של התגובה המושרה.
- הערכת מהלך הזמן של המסנן באמצעות ניתוח זרמי הנשאים.
תוצאות עיקריות
- אסטרוציטים בהיפוקמפוס של עכבר יכולים לפנות גלוטמט ששוחרר סינפטית בתוך מילישניות.
- נוכחות של TBOA משפיעה באופן משמעותי על מדידת זרמי הנשאים.
- השיטה מספקת הערכה מהימנה של זמן החיים של גלוטמט בממברנות אסטרוציטיות.
- התוצאות תורמות להבנת הדינמיקה של גלוטמט במרחב החוץ-תאי.
מסקנות
- המחקר מדגים בהצלחה שיטה להערכת פינוי גלוטמט.
- הממצאים מדגישים את התגובה המהירה של אסטרוציטים בספיגת גלוטמט.
- למחקר זה יש השלכות על הבנת התמסורת הסינפטית והנוירופיזיולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה ברזולוציה זמנית גבוהה של קינטיקת פינוי הגלוטמט מממברנות אסטרוציטיות, ובכך מספקת קריאה כמותית של תפקוד הנשאים ברקמה טבעית. על ידי בידוד מהלך הזמן של הסרת הגלוטמט באופן בלתי תלוי בקינטיקת הרצפטורים או בארטיפקטים של דיפוזיה, היא מהווה כלי להפחתת סיכונים מכניסטיים לצורך תיקוף מטרות במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בהערכת קיבולת הספיגה האסטרוציטית כסמן ביולוגי או כמטרה טיפולית במצבים הכוללים הפרעה בוויסות הגלוטמט.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקוד נשאי גלוטמט כמטרה טיפולית בהפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירודגנרטיביות.
- ערך תפעולי: מספק קריאה אלקטרופיזיולוגית ישירה להפחתת סיכונים בהשערות הנוגעות למנגנוני ספיגה של אסטרוציטים.
סקר ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדדי פינוי כמותיים בעלי רזולוציית זמן המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות ולסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: תומך בפיתוח של סמנים ביולוגיים שניתן לשחזר עבור פעילות של נשאי גלוטמט במערכות רלוונטיות למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין קינטיקת פינוי הגלוטמט האסטרוציטית לבין דינמיקת התמסורת הסינפטית במודלים של מחלות.
- ערך תפעולי: מקל על תיקוף רב-תחומי של מעורבות המטרה (target engagement) במחקרים פרה-קליניים של הומאוסטזיס של גלוטמט.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי (discovery continuum) על ידי מתן אפשרות לתיקוף מטרה באמצעות הערכה תפקודית של נשאי גלוטמט, מתן מידע לזיהוי מולקולות מובילות (lead identification) באמצעות מודולציה של קינטיקת הספיגה, ותמיכה בהערכה פרה-קלינית של פינוי גלוטמט הרלוונטי למחלה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקוד נשאי אסטרוציטים והבהרת מסלולים באיתות גלוטמט.
- סריקה: מספק מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של זרם הנשא לצורך הערכת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מהלכי זמן של פינוי המופקים מדקונבולוציה כפלט אנליטי להשוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין יעילות הספיגה באסטרוציטים לבין המשכיות התפקוד הסינפטי במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית ניתנת לשימוש חוזר להערכת קינטיקת נשאים באזורי מוח שונים ובמצבי מחלה שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי בידוד קינטיקת פינוי הגלוטמט מגורמים מבלבלים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות בידוד פרמקולוגי מבוקר ואנליזת דקונבולוציה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בוויסות מטרות אסטרוציטיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של תוכניות המכוונות למשאיות גלוטמט, בהתבסס על נתוני ספיגה תפקודיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, בהכנת פרוסות מוח טריות ובטכניקות של בידוד פרמקולוגי.
- תלוי במערכות patch-clamp, בגירויים ובמערכות פרפוזיה להגשת TBOA ולגירוי סינפטי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי גירוי, ריכוזי תרופות ופרמטרי דקונבולוציה (deconvolution).
- התאמה בין מערכות מודל שונות מחייבת תיקוף של ביטוי הנשאים ובריאות הפרוסות באזורי מוח שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בהנחות של מסנן ליניארי ובידוד קפדני של זרמי הנשאים ממוביליות (conductances) חופפות.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:15
Slice Preparation
3:54
Astrocyte Identification and Recordings
4:46
Isolation of the Facilitated Portion of Synaptically-activated Transporter Currents
7:15
Isolation of Flash-activated Transporter Currents
8:58
Conclusion
7:58
Results: Deconvolution Analysis
