Name: הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: למדו כיצד להעריך את משך חיי הגלוטמט בקרומי אסטרוציטים באמצעות ניתוח deconvolution של זרמי transporter. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של סילוק גלוטמט בהיפוקמפוס העכבר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ תכנית מחקר עירונית (NS002986). AS כתב את כתב היד ויישם את ניתוח deconvolution. JSD פיתחה את הגרסה הראשונית של ניתוח deconvolution והגיב על הטקסט.

<ol><li>Ventura, R., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+relationships+between+hippocampal+synapses+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes.</a> J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).</li>
<li>Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+perisynaptic+astroglia+during+synaptogenesis+in+the+mature+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus.</a> Glia. 55, 13-23 (2007).</li>
<li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li>
<li>Herman, M. A., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glutamate+concentration+in+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice.</a> J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).</li>
<li>Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+independent+hippocampal+synapses+is+controlled+by+glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake.</a> Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).</li>
<li>Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+synapse+independence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An evaluation of synapse independence.</a> J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).</li>
<li>Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+glutamate+diffusion+in+the+hippocampus%3A+ultrastructural+constraints%2C+uptake%2C+and+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation.</a> J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).</li>
<li>Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+coupling+in+a+neuronal+glutamate+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flux coupling in a neuronal glutamate transporter.</a> Nature. 383, 634-637 (1038).</li>
<li>Eliasof, S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+cell+glutamate+transporter+is+coupled+to+an+anionic+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).</li>
<li>Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+fluxes+associated+with+excitatory+amino+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport.</a> Neuron. 15, 721-728 (1995).</li>
<li>Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+and+microscopic+properties+of+a+cloned+glutamate+transporter%2Fchloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel.</a> J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).</li>
<li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li>
<li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes%3A+transmitter+uptake+gets+faster+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).</li>
<li>Scimemi, A., Tian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transporters+regulate+glutamate+clearance%2C+NMDA+receptor+activation%2C+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).</li>
<li>Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+enhances+glutamate+uptake+via+glutamate+transporters+in+rat+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells.</a> Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).</li>
<li>Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+uptake+of+glutamate+and+aspartate+into+glial+cells+isolated+from+the+salamander+%28Ambystoma%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina.</a> J. Physiol. 436, 169-193 (1991).</li>
<li>Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+coupled+and+uncoupled+currents+during+glutamate+uptake+by+GLT-1+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters.</a> J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+does+not+overwhelm+transporters+on+hippocampal+astrocytes+during+high-frequency+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation.</a> J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).</li>
<li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li>
<li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li>
<li>Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid%CE%B21-42+slows+clearance+of+synaptically-released+glutamate+by+mislocalizing+astrocytic+GLT-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1.</a> J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד העניינים.

כאן אנו מתארים גישה ניסויית להשיג קלטות אלקטרו מהאסטרוציטים, פרוטוקול אנליטי לבודד את זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים ושיטה מתמטית כדי להפיק את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מזרמי טרנספורטר astrocytic. ההצלחה של הניתוח מסתמכת על היכולת להשיג הקלטות מהדק תיקון באיכות גבוהה מהאסטרוציטים ועל הדיוק של האלגוריתמים הולמים כדי לתאר את זרמי טרנספורטר. ניתוח deconvolution מסתמך על שתי ההנחות הבאות. (1) התהליכים מר...

האסטרוציטים הם אחד מסוגי התאים הנפוצים ביותר במוח עם מורפולוגיה בצורת כוכב ובליטות בממברנה עדינות שמרחיבות לאורך neuropil ולהגיע 1,2 קשרים סינפטיים השכן. קרום התא של האסטרוציטים הוא ארוז בצפיפות עם מולקולות טרנספורטר גלוטמט 3. בתנאים פיסיולוגיים, מובילי גלוטמט במהירות לאגד גלוטמט בצד החוץ התאי של הממברנה ולהעביר אותו אל הציטופלסמה התא. בעשותם כך, מובילי לשמור על ריכוז הבסיס הנמוך של גלוטמט ב4 השטח תאי. מובילי גלוטמט בתהליכי astrocytic משובחים סמוכים לגירוי הסינפסות ממוקמים באופן אידיאלי כדי לאגד גלוטמט שוחרר במהלך אירועים סינפטיים כפי שהוא מפזר ממרווח הסינפטי. בעשותם כך, מובילי גם להגביל גלישת גלוטמט כיוון ו- פרי אזורים נוסף סינפטי ועל הסינפסות שכנות, צמצום הפער המרחבי של אות מעוררתים במוח 5-7. גלוטמט תחבורה היא תהליך electrogenic stoichiometrically מצמידים את התנועה של 3 Na + ו + 1 H לאורך השיפוע אלקטרוכימי שלהם וללוחמה בהובלה של 1 K + 8. התחבורה גלוטמט קשורה (אבל לא stoichiometrically מצמידים) מוליכות anionic חדירים לSCN - (thiocyanate)&gt; מס &#39;3 - (ניטראט) ≈ CLO 4 - (פרכלורט)&gt; אני -&gt; Br -&gt; Cl -&gt; F -, לא לCH 3 SO 3 - (מתאן sulfonate) ו-C 6 H 11 O 7 - (גלוקונאט) 9-11. שני הזרמים (stoichiometric ולא stoichiometric) ניתן להקליט על ידי קבלת הקלטות תיקון-מהדק כל התא מהאסטרוציטים, שזוהו תחת תאורת Dodt או התערבות ההפרש לעומת זאת אינפרא אדום (IR-DIC) חזותי בacutדואר פרוסות מוח 12. מרכיב stoichiometric של הנוכחי קשורים לתחבורת גלוטמט על פני הקרום יכול להיות מבודד באמצעות CH 3 SO 3 -, או ג 6 11 7 O H - פתרונות תאיים מבוסס ויכול להיות עורר על ידי גלוטמט פלאש משחררות רפרוף על האסטרוציטים 13,14, או על ידי הפעלת שחרור גלוטמט מהסינפסות שכנות, או חשמלי 12 או עם שליטה ממוקדת optogenetic. מהלך הזמן של רכיב stoichiometric של נוכחי טרנספורטר מעוצב על ידי חיים שלמים של פרופיל ריכוז הגלוטמט בממברנות astrocytic (אישור גלוטמט כלומר), קינטיקה של מובילי גלוטמט, את מאפייני הקרום הפסיביים של האסטרוציטים, ובמהלך הגירויים הסינפטי, על ידי סינכרוניזציה של שחרור גלוטמט פני סינפסות הופעלה 13. כאן אנו מתארים בפירוט מלא: (1) appr ניסיוניתאוח לבודד את מרכיב stoichiometric של זרמי טרנספורטר גלוטמט מהקלטות תיקון-מהדק כל התא מהאסטרוציטים באמצעות פרוסות בהיפוקמפוס חריפות עכבר כהכנה ניסיונית דוגמה, (2) גישה אנליטית לגזור את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מהקלטות אלה 13, 14. שיטות אלה יכולים לשמש כדי להקליט ולנתח זרמי טרנספורטר גלוטמט מהאסטרוציטים בכל אזור של מערכת העצבים המרכזית.

<table><tbody><tr><td>CGP52432</td><td>Tocris</td><td>1246</td><td></td></tr><tr><td>(R,S)-CPP</td><td>Tocris</td><td>173</td><td></td></tr><tr><td>DPCPX</td><td>Tocris</td><td>439</td><td></td></tr><tr><td>LY341495 מלח דיסודיום</td><td>Tocris</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>MSOP</td><td>Tocris</td><td>803</td><td></td></tr><tr><td>NBQX מלח דיסודיום</td><td>Tocris</td><td>1044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-TBOA</td><td>Tocis</td><td>1223</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>MNI-L-glutamate</td><td>Tocris</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודות מטריקס</td> אופציונליות <td>חברת פרדריק האר</td><td>MX21AES(JD3)</td><td></td></tr> <tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td> World <td>Precision Instruments</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>דו-שלבי זכוכית מיקרו-פיפטה חולץ</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 דבק מיידי</td><td>טד פלה</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Xe lamp</td><td>Rapp אופטואלקטרוני</td><td>פלאש מיק</td><td></td></tr><tr><td>איגור פרו 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח deconvolution של זרמי transporter astrocytic

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

הצפיפות הגבוהה ביותר של מובילי גלוטמט במוח נמצאת בהאסטרוציטים. כמה מובילי גלוטמט התנועה של גלוטמט על פני הקרום עם שיתוף ההובלה של 3 Na + ו 1 + H ונגד התחבורה של K + 1. יכול להיות במעקב הנוכחי stoichiometric הנוצרים בתהליך ההובלה עם הקלטות תיקון-מהדק כל התא מתאים כוכביים. כמובן הזמן הנוכחי נרשם מעוצב על ידי את מהלך הזמן של פרופיל גלוטמט הריכוז כדי שהאסטרוציטים חשופים, קינטיקה של מובילי גלוטמט, ואת מאפייני electrotonic הפסיביים של קרומי astrocytic. כאן אנו מתארים את השיטות הניסיוניות ואנליטי, שניתן להשתמש כדי להקליט זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים ולבודד את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מכל הגורמים האחרים המעצבים את צורת הגל של זרמי טרנספורטר astrocytic. השיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש כדי להעריך את החיים oF פלאש ברח מכלוב וsynaptically-שוחרר גלוטמט בממברנות astrocytic בכל אזור במערכת העצבים המרכזית בבריאות ובחוליים.

ההצלחה של הגישה אנליטית שתוארה כאן באופן ביקורתי תלויה בהשגת הקלטות אלקטרו באיכות גבוהה של זרמי טרנספורטר מהאסטרוציטים בכל אזור של מערכת העצבים המרכזית. בחתכי היפוקמפוס עכבר חריפים, האסטרוציטים ניתן לזהות בקלות תחת Dodt תאורה או IR-DIC בגלל הגוף שלהם תאים הקטן (O מיקרומטר = 10) וגרעין בולט (איור 1). המורפולוגיה בצורת כוכב הייחודית שלהם יכולה להיות מוערכת עם epifluorescence, confocal, או מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים, בעת הוספת fluorophore כמו אלכסה 594 (50 מיק...

אנו מתארים שיטה אנליטית להעריך את החיים של גלוטמט בממברנות astrocytic מהקלטות אלקטרו של זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים.

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

המטרה הכללית של הניסוי היא להעריך את מהלך הזמן של פינוי גלוטמט מממברנות של אסטרוציטים בעקבות שחרורו מסינפסות מעוררות. השלב הראשון בתהליך זה הוא הקלטה של התרחשות הובלת גלוטמט המופעלת סינפטית מאסטרוציטים בחתכי מוח חדים (acute brain slices), בהיעדרו ובנוכחות של ריכוז תת-רווי של TBOA, אנטגוניסט רחב-ספקטרום לטרנספורטרים של גלוטמט. השלב השני הוא ניתוח ההקלטות כדי לבודד את זרמי הטרנספורטרים של גלוטמט המופעלים סינפטית מכל שאר מרכיבי התגובה המופעלה.בשלב הבא, מוערך מהלך הזמן של הסינון על ידי ניתוח זרמי הנשא שנרשמו בנוכחות TBOA, תוך חיסור זרם הסינון מתוך התרחשות ההובלה שנרשמה בתנאים מבוקרים. כך מתקבל מהלך הזמן של פינוי גלוטמט מממברנות של אסטרוציטים. התוצאות מראות שבמרכז ההיפוקמפוס של העכבר, אסטרוציטים זקוקים רק למספר מילישניות כדי להסיר גלוטמט שהשתחרר סינפטית מהמרחב החוץ-תאי.גישה זו מספקת כלי רגיש לזיהוי שינויים בקיבולת הספיגה של אסטרוציטים באזורי מוח שונים במהלך תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. היתרון המרכזי של גישה זו על פני שיטות אחרות המבוססות, למשל, על ניתוח דחיקה של אנטגוניסטים לקולטני גלוטמט המתנתקים במהירות מאינדיקטורים פלואורסצנטיים לגלוטמט או על סימולציות מ கணשב של תגובת דיפוזיה, הוא שהיא מספקת רזולוציה זמנית גבוהה וקריאה ניסיונית ישירה של פינוי גלוטמט מאסטרוציטים. שיטה זו מאפשרת לנו להבין את הדינמיקה המרחבית והזמנית של ההעברה הסינפטית במוח.הדבר יכול לסייע לנו לפרש שינויים פתופיזיולוגיים ברמות הגלוטמט, בדיפוזיה ובספיגה העלולים להתרחש בהפרעות נוירולוגיות מסוימות, כגון מחלת אלצהיימר. התחילו את הפרוצדורה על ידי ביצוע חמישה חתכים במוח של עכבר שפוצץ באמצעות סכין מנתחים. ראשית, הסירו את הפקעות הריח ואת קליפת המוח הפרונטלית.שנית, הסירו את המוח הקטן (cerebellum). לאחר מכן, הסירו את האונות הרקות (temporal lobes) השמאלית והימנית. לאחר מכן, הפרידו בין שתי המיספרות של המוח באמצעות חיתוך סגיטלי מרכזי.בשלב הבא, הדביקו את המשטח הצדי של כל נתח מוח ללוח הבסיס הקר של ה-vibram. הצד הגבי (dorsal) של המוח צריך להיות פונה לעבר להב ה-Vibram, והצד הבטני (ventral) של המוח צריך להיות במגע עם בלוק האגר, הרחק מלהב ה-vibrato. לאחר מכן, קבעו את לוח הבסיס של ה-vibrato לתא הניתוח.הגדירו את עובי הפרוסה ל-250 micrometers וכווןנו את רוחב הלהב לפני הפריסה. לאחר שהלהב עבר דרך הקורטקס וההיפוקמפוס, השתמשו בסקלפל כדי להפריד את הקורטקס וההיפוקמפוס מהמוח האמצעי. לאחר מכן, מקמו פרוסה בתא הטבילה בטמפרטורה של 34 degrees Celsius, לאחר השראת הפרוסות בטמפרטורה של 34 degrees Celsius למשך 30 דקות.יש להניח להם להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש בהם להקלטות אלקטרופיזיולוגיות בהליך זה, ולאחר מכן להעביר פרוסה לתא ההקלטה. יש לבחון את הפרוסה חזותית תחת תאורת נקודה או I-R-D-I-C. ניתן לזהות אסטרוציטים לפי גוף התא הקטן והגרעין הבולט שלהם לצורך סטימולציה סינפטית.מקמו אלקטרודה ביפולרית מפלדת אל חלודה במרחק של כ-100 micrometers מהאסטרוציט שאתם מתכננים לבצע לו פאץ'. בצעו פאץ' לאסטרוציט והגיעו לתצורת תא שלם (whole cell configuration) על ידי הפעלת שאיבה עדינה מאוד. לאחר מכן, הדריגו בין גירויים בודדים לגירויים בזוגות מדי 10 עד 20 שניות, כדי לבודד את החלקים המהשכילים של התרחאות הובלה המופעלות סינפטית.ראשית, חשבו ממוצע של לפחות 20 סריקות (sweeps) שהושגו באמצעות גירויים זוגיים בתנאי בקרה, ובנוכחות של 10 µM של TBOA, מעכב רחב-ספקטרום של נשאי גלוטמט. לאחר מכן, חשבו ממוצע של מספר זהה של סריקות שהושגו באמצעות גירויים בודדים בתנאי בקרה ובנוכחות של 10 µM TBOA; החסירו את עקומת הממוצע שהושגה בגירויים בודדים מעקומת הממוצע שהושגה בגירויים זוגיים. שלב זה מאפשר לבודד את ה-STO הגאומטרי ואת זרם האספירין (potassium current) המתמשך שהופעל על ידי הגירוי השני.בשלב הבא, העבירו את העקבה הממוצעת שהתקבלה מגרויים בודדים ברווח זמן התואם למרווח ה-PUL שבו נעשה שימוש להעברת פולסים זוגיים, והפחיתו תגובה ממוצעת מוזזת בזמן שהתקבלה מגרויים בודדים מהתגובה הממוצעת לגירוי השני שהתקבלה קודם לכן. שלב זה מבודד חלק מועצם של זרם הנשא שגורר הגירוי השני. ברוב המקרים, שלב זה מסיר לחלוטין את זרם האשקום המתמשך.במקרה זה, בידוד ה-FSTC הושלם וניתן להמשיך בניתוח הדקונבולוציה (deconvolution) ולהגיע למהלך הזמן של פינוי גלוטמט מאסטרוציטים. עם זאת, במקרים מסוימים, עדיין קיים זרם אשלגן קבוע קטן ויש צורך בניתוח נוסף. מדדו את האמפליטודה של זרם האשלגן הקבוע שנותר לאחר הביצוע.הניתוח שתואר קודם לכן מנרמל את האמפליטודה של הפונקציה המונו-אקספוננציאלית לאמפליטודה של זרם האסס של האסנץ' של האשלגן, על ידי קביעת האמפליטודה של זרם האסנץ' של האשלגן שנמדד כ-a במשוואה זו. עם זאת, קבוע זמן העלייה מייצג את ערך העלייה הממוצע שהוערך בניסויים נפרדים שבהם בודד זרם אסנץ' של אשלגן. באופן פרמקולוגי, באמצעות ריכוז רווי גבוה של TBOA, מחסירים לאחר מכן את הפונקציה המונו-אקספוננציאלית שהתקבלה מה-FSTC ומזרם האסנץ' של האשלגן.להשלמת בידוד ה-FSTC. כדי לבודד את הופעת ההובלה המופעלת על ידי פלאש. חשבו ממוצע של לפחות 20 סריקות שהתקבלו כאשר נתיב האור פתוח בתנאי בקרה וב-10 micromolar TBOA, ולאחר מכן חשבו ממוצע של אותו מספר סריקות שהתקבלו כאשר נתיב האור סגור בתנאי בקרה וב-10 micromolar TBOA. החסירו את העקבה הממוצעת שהתקבלה כאשר נתיב האור חסום מהעקבה הממוצעת שהתקבלה כאשר נתיב האור פתוח.שלב זה מאפשר להסיר את ארטיפקט הגירוי ולבודד את ה-FTCs. בשלב זה, התאימו את זרם ההובלה, בין אם FSTC או FTC, שהוקלט בתנאי בקרה וב-10 µM TBOA, והתאימו אותם לפונקציה מרובת-מעריכים; צרו פונקציה בעלייה מיידית הדועכת באופן מונו-מעריכי על פי פונקציה זו, ושמתארת בצורה הטובה ביותר את שלב הדעיכה של זרם המוביל שהוקלט ב-10 µM TBOA. לאחר מכן, גזרו את הפונקציה המונו-מעריכית מההתאמה של זרם המוביל שהוקלט ב-10 µM TBOA כדי להפיק את המסנן. לאחר מכן, גזרו את המסנן מההתאמה של זרם המוביל בתנאי בקרה.כדי לקבל הערכה כמותית של מהלך הזמן הכולל של פינוי הגלוטמט, חשב את ה-OID של צורת הגל. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שאירועי ההובלה נרשמו תחת תנאים ניסיוניים שבהם המסנן פועל במשטר ליניארי ומכניס עיוותים ליניאריים בלבד להובלה. ניתן לוודא זאת על ידי בדיקת מניפולציות המשנות את גודל זרם ההובלה.אין לשנות את מסלול החתמה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בהקלטות מאסטרוציטים כדי להפיק מידע על גלוטמט, דיפוזיה וספיגה במוח.

deriving-time-course-glutamate-clearance-with-deconvolution-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים כיצד למדוד ליד קרום והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי בתרבית בתוך האסטרוציטים באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופיה epifluorescence.

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

ההכנה של פרוסות חריפות מוח מhippocampi המבודד, כמו גם את ההקלטות אלקטרו סימולטני של האסטרוציטים ונוירונים...

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

סרטון זה מדגים הערכת שחרור ופינוי גלוטמט בסינפסות קורטיקוסטריאליות בודדות בפרוסת מוח של עכבר. גירוי חשמלי מאפשר שחרור גלוטמט בסינפסה. הגלוטמט המשתחרר משנה את הפלואורסצנטיות של חלבון החיישן, אשר דועכת עם הזמן, מה שמעיד על יעילות שחרור וסילוק.

ניתוח שחרור ופינוי גלוטמט בסינפסה של נוירון יחיד בפרוסת מוח של עכבר

כאן אנו מתארים עיבוד של פרוטוקולים המשמשים כדי לגרום פלסטיות homeostatic בנוירונים לחקר הפלסטיות של קולטני G-חלבון בשילוב astrocytic. לאחרונה משמש כדי לבחון שינויים בקבוצת astrocytic אני mGluRs בעכברים לנוער, ניתן ליישם השיטה למדידת קנה מידה של GPCRs astrocytic השונות, ברקמות של עכברים בוגרים באתרו וin vivo, ולקבל הערכה טובה יותר של הרגישות של קולטני astrocytic לשינויים בפעילות עצבית.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

כאן, אנו מתארים את ההתקנה, תוכנת ניווט, וניתוח נתונים עבור שיטה מרחבית מדויקת ובזמן של מדידת טוניק ושינויי גלוטמט תאי פאזית in vivo באמצעות מערכי microelectrode enzyme-linked (MEA).

באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי Enzyme למדוד טוניק ו phasic גלוטמט בעכברי מודל אלצהיימר

שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את האיזון בין שחרור גלוטמט לבין הסיווג ב corticostriatal glutamatergic בודד בפרוסות חריפה מעכברים למבוגרים. פרוטוקול זה משתמש חיישן פלורסנט iGluu עבור זיהוי גלוטמט, מצלמה scmos עבור רכישת אותות והתקן עבור תאורה לייזר מוקד.

בודד סינפסה אינדיקטורים של גלוטמט שחרור ספיגה בפרוסות המוח חריפה מעכברים נורמלי הנטינגטון

כאן אנו מתארים בשיטת הדמיה לחיות מחוץ לתמונה כדי להמחיש הובלה תאיים של אורגלים וסחר של חלבונים קרום פלזמה ב astrocytes מורטין. פרוטוקול זה מציג גם מתודולוגיה לניתוח תמונה כדי לקבוע מסלולים להובלת מטענים וקינטיקה.

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

פרוטוקול זה מספק שיטה משולבת הכוללת העברת ויראלית, השתלת אופטרודה, השראה פוטותרומבוטית, רישום סימולטני של פעילות אסטרוציטים ונוירונים, וגירוי אופטוגנטי של אסטרוציטים. שיטה משולבת זו שואפת לספק חקירה מקבילה של מערכת היחסים בין האסטרוציטים לנוירון בשלבים החריפים ועד הכרוניים של שבץ איסכמי.

שיטה משולבת למידול שבץ פוטוטרומבוטי ורישום אופטרודה ב-vivo של פעילות נוירונית ואסטרוציטית בעכברים מתנהגים

מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול electroporate ברחם לבין קליפת המוח להיפוקמפוס ב E14.5 בעכברים. כמו כן, אנו מראים כי מדובר בשיטה בעלת ערך ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

למדו כיצד להעריך את משך חיי הגלוטמט בקרומי אסטרוציטים באמצעות ניתוח deconvolution של זרמי transporter. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של סילוק גלוטמט בהיפוקמפוס העכבר.

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

גלה סרטונים נוספים