Microfluidic תגובת Capture-חיי בן אשר על השבב כדי לשתק הפיך מולקולות קטנות או מבני Multi-רכיב עבור יישומי Biosensor

אנו מציגים שיטה לקיבוע מהיר, הפיך של מולקולות קטנות והרכבות nanoparticle פונקציונליות ללימודי Surface Plasmon התהודה (SPR), תוך שימוש רציף לכידת הכימיה cycloaddition bioorthogonal ונוגדן אנטיגן על השבב.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים אסטרטגיה מהירה וניתנת להכללה לשיתוק הפיך של מולקולות קטנות וננו-חלקיקים פונקציונליים על פני שבבי חיישנים. זה מושג על ידי קיבוע נוגדנים נגד GST על משטח חיישן. כשלב שני לכידת אנטיגן GST.

פונקציונליזציה עם קבוצות טרנס ציקלו, אוקטין או טטרה מספקת משטח תגובתי לתגובות מהדורת ציקלו עוקבות עם נגזרות טט סינוס של מולקולות קטנות או מצומדים של ציקלו אוקטן מגמת ננו-חלקיקים, אשר מתפקדים לאחר מכן עם נגזרות טט סינוס של מולקולות קטנות. לאחר מכן, המשטח הפונקציונלי עשוי לשמש לניתוח אינטראקציה עם יעד מסיס רצוי. בשלב האחרון, פני השטח מתחדשים, ומאפשרים תוצאות קשירה של מחזורי מהדורת ציקלו ללכידה עוקבים על תגובות ביולוגיות אורתוגונליות של ספינה משמרות את היכולת של מולקולות קטנות משותקות או למקם שני ננו-חלקיקים פונקציונליים לקיים אינטראקציה עם יעד FK BP 12 ולהמחיש כיצד גישה זו יכולה להרחיב את מגוון היישומים עבור SPR.

היתרון העיקרי של טכניקת מהדורת מחזור לכידה על השבב הוא שהיא מאפשרת הפיכה מהירה וגיוס של מולקולות קטנות עם שליטה על אוריינטציה וצפיפות גיוס I. בדרך כלל, ניתן לבצע את תהליך מהדורת מחזור הלכידה תוך דקות, ולהפחית משמעותית את זמני הכנת פני השטח, מה שמדגים את ההליך יהיה ג'ייסון סנדלר, סטודנט מהמעבדה שלנו להתחיל הליך זה בשמונה מיקרוליטר של תמיסת T-C-O-N-H-S של 50 מילי-מולרית ב-DMSO ל-100 מיקרוליטר של מיליגרם אחד לתמיסת GST ב-PBS. לאחר ניעור התערובת בטמפרטורת החדר למשך שעה, הסר את המגיב העודף באמצעות עמוד התפלה של ספין זבה.

לאחר מכן, הוסף שישה מיקרוליטר של תמיסת NHS Ester של 25 מילי-מולרית ב-DMF ל-75 מיקרוליטר של תמיסה של מיליגרם אחד למיליליטר של GST ב-PBS ונער את התערובת בטמפרטורת החדר לאחר שעה. מדללים את תערובת התגובה עם 25 מיקרוליטר PBS ומטהרים באמצעות עמוד התפלה ספין. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת T-C-O-N-H-S של 50 מילי-מולרית ל-150 מיקרוליטר של תמיסת ננו-חלקיקים נפלטת ונער את התערובת באותו אופן כמו קודם.

לאחר הערבוב, הסר את המגיב העודף על ידי סינון ג'ל באמצעות עמודת NAP 10. נרמז עם מאגר PBS. יש לאסוף את הרצועה הצבעונית המכילה את המוצר N-P-T-C-O.

העבירו את הדגימה המטוהרת לצינור צנטריפוגה המכיל מכשיר סינון צנטריפוגלי עם חתך משקל מולקולרי של 100,000. לאחר מכן רכז את הדגימה לנפח סופי של כ-150 מיקרוליטר לאחר צנטריפוגה. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת אנהידריד צינית מולרית 0.1 ב-DMSO לתמיסת N-P-T-C-O.

לאחר ניעור התערובת בטמפרטורת החדר למשך שעה, יש לטהר את מוצר ה-N-P-T-C-O באמצעות עמודת NAP 10 המתחמקת עם PBS באמצעות פלזמה עילית במכשיר תהודה, בחר אימוביליזציה על תאי זרימה אחד ושניים בתבנית אשף הקיבוע של AM. שנה את שיטת אמין להפעלת קבוצות קרבוקסיליות על פני השטח על ידי הזרקת תמיסה אחד לאחד של 0.4 EDC מולרי ו-0.1 NHS מולרי למשך 480 שניות. בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה, הגדר את הזרקת האתנולאמין כדי להרוות את האסטרים המופעלים הנותרים לזמן מגע 422 בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה.

הזן את שם הליגנד אנטי GST והגדר להזרקה לזמן מגע של 420 שניות בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה. לאחר מכן, הניחו את בקבוקוני התמיסה שהוכנו בעבר במדף המגיב השני. הקפד להתאים את המיקומים לרשימת התוכן לאחר הקצאת שם הקובץ והיעד שבו יישמרו הנתונים.

התחל את הקיבוע. ערוך את אשף הקיבוע כדי להזריק רק 20 מיקרוגרם למיליליטר של תמיסת ליגנד GST למשך 420 שניות בחמישה מיקרוליטר לדקה מעל תא זרימת הייחוס הראשון. הנח את הבקבוקונים המכילים G-S-T-T-C-O-A שהוכנו בעבר תמיסת TERAZ olaine 10 מיקרו-טוחנת ואת תמיסת ההתחדשות במדף ריאגנט שני.

בחר את שיטת ההפעלה הידנית, הגדר את קצב הזרימה לחמישה מיקרוליטר לדקה ואת נתיב הזרימה לתא הזרימה השני. הזרקו את תמיסת G-S-T-T-C-O למשך 420 שניות ואחריה את תמיסת הלמין Teraz Benz למשך 600 שניות. לאחר מכן, חידש את פני השטח עם שתי זריקות 32 של תמיסת התחדשות.

לאחר הנחת בקבוקוני ה-GST TERAZ ZINE, N-P-T-C-O, teraz Belamine ותמיסת התחדשות במדף ריאגנט שני, בחר את שיטת ההפעלה הידנית של המכשיר, ולאחר מכן הגדר את קצב הזרימה לחמישה מיקרוליטר לדקה ואת נתיב הזרימה לתא הזרימה השני. הזרקו תמיסה של GST Tetra zine למשך 60 שניות, ואחריה תמיסה של N-P-T-C-O למשך 60 שניות. לבסוף, הזריק תמיסה של טטרס בלמין למשך 60 שניות.

בסיום, חדש את המשטח באותו אופן כמו קודם. לאחר מכן, בחר שיטה חדשה והזן את הפרמטרים הכלליים, הכוללים איסוף נתונים, זיהוי קצב, תא דגימה, טמפרטורה, יחידות ריכוז והגדרות מאגר. בחלונית שלבי הבדיקה, צרו שלב חדש ותנו לו דוגמה.

לאחר מכן הגדר את המטרה וחבר הגדרות מבוססות לדגימה בחלונית סוגי המחזורים, צור שלב מחזור חדש והוסף את הפקודות הבאות. לכידת התחדשות מדגם אחד והתחדשות שנייה. בחר את פקודת הלכידה והזן G-S-T-T-C-O כליגנד.

ציין 120 שניות כזמן המגע, חמישה מיקרוליטר לדקה כקצב הזרימה. והגדר את נתיב הזרימה לשני. לאחר מכן בחר את פקודת הדגימה והזן זמן מגע 182, זמן דיסוציאציה 62, קצב זרימה של 30 מיקרוליטר לדקה והגדר את נתיב הזרימה לשניהם.

לאחר מכן, בחר בפקודת היצירה אחת והזן את פתרון ההתחדשות. תן שם לזמן מגע 32 ב-30 מיקרוליטר לדקה והגדר את נתיב הזרימה לשני. חזור על אותו הליך להתחדשות.

שתי פקודות בחר הגדר, הפעל והגדר את נתיב הזרימה לשני מקף אחד. בחר הבא ומלא את רשימת הדגימות בתמיסת האנליט טטרה בלמין וסדרת ריכוזים של 1.5 עד 20 מיקרומולר בדילול אחד עד שניים. לאחר מכן בחר ליד לוח מיקום המתלה.

לאחר הנחת בקבוקוני התמיסה במדף ריאגנט שני, הנח את סדרת הדילול. בצלחת 96 בארות. הקפד להתאים את המיקומים לרשימת התוכן.

שמור את תבנית השיטה והתחל את בדיקת הכריכה. נניח לאחר שנבחרו שיטה חדשה והפרמטרים הכלליים, צור ותן שם לדגימת הלכידה ושלבי היצירה בחלונית שלבי הבדיקה. לאחר מכן, בחר את המטרה המתאימה וחבר את הגדרות הבסיס.

לאחר מכן בחר את החלונית סוגי מחזורים וצור שלושה שלבי מחזור. לכידה, דגימה והתחדשות. הכנס את פקודת הלכידה פעמיים תחת מחזור הלכידה.

היכנס ללוח הלכידה האחד. בחר את פתרון הלכידה כמשתנה. לאחר מכן הגדר את זמן המגע ל-300 שניות בקצב זרימה של חמישה מיקרוליטר לדקה והגדר את נתיב הזרימה לשני בלוח הלכידה השני.

בחר את פתרון הלכידה כמשתנה. הגדר את זמן המגע ל-250 שניות בקצב זרימה של חמישה מיקרוליטר לדקה והגדר את נתיב הזרימה לשני. לאחר מכן, הוסף את הפקודה לדוגמה תחת שלב מחזור הדוגמה.

בחר את לוח הדוגמה והגדר את זמן המגע ל-60 שניות. זמן הדיסוציאציה ל-200 שניות בקצב זרימה של 30 מיקרוליטר לדקה והגדר את נתיב הזרימה לשניהם. הכנס את פקודת ההתחדשות פעמיים תחת שלב מחזור ההתחדשות, בחר את לוח ההתחדשות האחד, הזן את פתרון ההתחדשות.

תן שם לזמן מגע של 30 שניות ב-30 מיקרוליטר לדקה, והגדר את נתיב הזרימה לשני. חזור על אותו הליך להתחדשות. שני פאנלים בוחרים להגדיר, להריץ ולהגדיר את נתיב הזרימה לשני מקפים אחד לבחור הבא ולהכניס G-S-T-T-C-O ו-teraz AP 1, 497 מצומדים כפתרון הלכידה שמות FKBP 12 כשם המדגם ו-1.5 עד 96 ננו מולר בדילול אחד עד שניים כסדרת הריכוז.

לאחר הנחת בקבוקוני התמיסה במדף ריאגנט שניים וסדרת הדילול בצלחת 96 בארות שמור את תבנית השיטה והתחל את בדיקת הכריכה. קיבוע הפיך יעיל של מולקולות קטנות ביו-אקטיביות עם שליטה על אוריינטציה וצפיפות ממלא תפקיד מפתח בפיתוח יישומי חיישנים ביולוגיים חדשים. מוצג כאן ניטור בזמן אמת של קיבוע טרז בנזואין.

תמיסה של G-S-T-T-C-O מוזרקת על משטח אנטי GST משותק מראש וכתוצאה מכך עלייה של כ-400 R RU. בתגובה, זריקה שנייה עם Teraz zine Benzo Lamine מראה עלייה מהירה של 15 RU בתגובה. לא נצפתה דיסוציאציה של אנטיגן הדרט לאחר המעבר למאגר פועל, מה שמספק עדות ליציבות המבנה.

המשטח נוצר מחדש בשלב האחרון של המחזור כדי לאפשר מחזורי מהדורת סייקלו. באמצעות הליך זה והחלפת הטטרה, חלק בנזיל למין במצומד טרז AP 1, 497 מייצר משטח ביו-אקטיבי, המשמש למחקרי אינטראקציה עם המטרה שלו. שיבוש FK BP 12 באינטראקציה של אנטיגן הנוגדנים מחדש את פני השטח נגד GST, ומאפשר לבנות מכלול מולקולרי חדש.

במקרה זה, הזרקת GST TERAZ מלווה בהזרקה של N-P-T-C-O, ולמעשה משתקת את הננו-חלקיק למשטח החיישן. קבוצות TCO לא מגיבות על הננו-חלקיקים זמינות למהדורת סייקלו עם טראז בנזו לאמין מוזרק. לחלופין, מצומד TET INE AP 1, 497 משמש לניטור אינטראקציות ננו-חלקיקים פונקציונליים FK BP 12.

לא נצפתה דיסוציאציה של המבנים הרב-רכיביים המספקים עדויות ליציבות המבנה וביו-אקטיביות עם יכולות לניטור תגובת קיבוע בזמן אמת והתחדשות פני השטח. האפיון הישיר של שיעור האסוציאציה KA מושג כפי שמוצג כאן. ידע בקינטיקה של תגובה מספק הנחיות לשליטה בצפיפות אימוביליזציה ופרמטר חשוב לבדיקות חיישנים ביולוגיים.

הזרקת ריכוזים הולכים וגדלים של teraz BELAMINE או N-P-T-C-O בשכפול על פני משטחי G-S-T-T-C-O או GST teraz zine בהתאמה מייצרת את נתוני הקשירה. נתוני הקישור עבור שתי דגימות אנליטים עוקבות באותו ריכוז על אותו משטח הם כמעט סופר ניתנים להטלה ומשקפים אובדן מינימלי של יכולת קשירת נוגדנים. בשל מחזורים מרובים של מהדורת סייקלו לכידה והתחדשות, תוכנת ההערכה מספקת את הניתוח הקינטי המתאים ביותר לשיעורי התגובה של מהדורת הציקלו.

פיתחנו גישה המשתמשת בלכידת אנטיגן נוגדנים, יחד עם תגובות מהירות וספציפיות מאוד של מהדורת ציקלו בין טרז לטרנס ציקלין המאפשרות קיבוע מהיר הפיך של מולקולות קטנות. עבור מחקרים מבוססי שבב SPR, שיטת מהדורת מחזור הלכידה דורשת זמני מגע קצרים עם פחות מ-10 ריכוזים מיקרו-מולאריים של ליגנדים של מולקולות קטנות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשתק מולקולות קטנות או מבנים מרובי רכיבים על משטח חיישן בשיטת מהדורת ציקלו.

על מנת להשיג זאת, חשוב להשתמש בריאגנטים באיכות טובה לתגובות צימוד ולהגדיר כראוי פרמטרי בדיקה במכשיר ה-SPR.