ניתוח שיטתי של במבחנה תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע מחקרי גלגול תאים עם תפוקה מוגברת תחת זרימת גזירה מבוקרת היטב ורלוונטית מבחינה פיזיולוגית. זה מושג באמצעות מערכת מיקרופלואידית מרובת בארות שבה בארות סמוכות בצלחת מיוחדת מחוברות באמצעות תעלה מיקרופלואידית. ממשק המערכת מחבר משאבה אלקטרו פנאומטית לחלק העליון של לוח הבארות, ומפעיל לחץ פנאומטי המניע את הנוזל מתוך הבארות דרך התעלות המיקרופלואידיות בקצב זרימה מוגדר.

לאחר שהתעלה המיקרופלואידית מצופה במצע הרצוי או בחד-שכבת תא חד-שכבתית, התאים המעניינים מוכנסים לתעלה המיקרופלואידית כדי לחקור את אינטראקציות הגלגול הספציפיות שלהם עם המשטח המצופה, לאחר מכן ניתן לנתח את תכונות הגלגול של התאים כשהם מקיימים אינטראקציה עם המצע או המשטח המצופה חד-שכבתי בתנאי ניסוי שונים באמצעות התוכנה המתאימה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תא זרימת צלחת מקביל, הוא שטכניקה זו מאפשרת לחקור את תכונות גלגול הכסף עם תפוקה גבוהה משמעותית תחת זרימת צינור מבוקרת ורלוונטית מבחינה פיזיולוגית תוך מזעור צריכת ריאגנטים ותאים. פלטפורמה זו עשויה לסייע בקידום טיפולים מבוססי תאים אקסוגניים על ידי מתן אפשרות לניתוח מהיר ומדויק של גישות הנדסיות שנועדו להשפיע על גלגול תאים וביות.

כדי לצפות תעלה מיקרופלואידית במצע חלבון, הוסף תחילה 25 עד 50 מיקרוליטר מתמיסת החלבון הטרייה שהוכנה לכניסה. ובכן, הפעל כוח עצום של שני סעודות לסנטימטר מרובע למשך חמש דקות כדי להחדיר את התמיסה לתעלה. כאשר חרוז נוזל נראה בשקע, עצור היטב את הזרימה, דגר את הצלחת למשך הזמן המתאים עם החלבון המעניין, ואז שאב את התמיסה מכל אחד מהם. ובכן.

לאחר מכן, הוסף 200 עד 500 מיקרוליטר של PBS לבאר היציאה, ולאחר מכן החל זרימה שקופה של שתי סועדים לסנטימטר מרובע למשך חמש דקות כדי לשטוף את התעלה ליצירת חד-שכבת תא בתוך התעלה המיקרופלואידית. התחל בטריפסין עדין של התאים המעניינים מצלחת התרבית שלהם למשך שלוש דקות, עצור את התגובה עם נפח כפול של מדיה מלאה, ולאחר מכן צנטריפוגה של התאים למשך חמש דקות ב-400 Gs ו-rt. לאחר מכן, שטפו את הגלולה ב -10 מיליליטר מדיה מלאה.

לאחר מכן השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיה מלאה טרייה וספרו אותם, התאימו את תמיסת התא לריכוז המתאים, ולאחר מכן הכניסו 25 עד 50 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל כניסה. ובכן, כעת הניחו את הצלחת על במת המיקרוסקופ והפעילו זרימה מוחלטת של שתי סועדים לסנטימטר רבוע כדי להזרים את התאים לתעלה עד שנצפה כי התאים ממלאים את כל הערוץ. לאחר עצירת הזרימה, מלאו את בארות היציאה והיבשה ב-200 מיקרוליטר של המדיה התאית המתאימה, ולאחר מכן הניחו לתאים להתייצב ולהיצמד ל-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2.

לאחר שלוש שעות יש לשטוף את התעלה במדיה מלאה כדי להסיר את התאים הלא מחוברים. התאים צריכים כעת להיות מתכנסים לחלוטין ומוכנים לשימוש כדי לגרום להפעלה דלקתית של תאי אנדותל בתעלות. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת TNF אלפא טרייה שהוכנה לבאר הכניסה, ולאחר מכן הכניס את התמיסה לתעלה על ידי החלת זרימה שקופה של שני סועדים לסנטימטר מרובע למשך חמש דקות.

עבור תעלות תאי אנדותל לא מופעלות בקרה, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה בסיסית של תאי אנדותל לכניסה. ובכן, כדי לחסום סלקטין P או E על פני תא האנדותל, הכניסו לתעלה חמישה מיקרוגרם למיליליטר של הנוגדן המנטרל המתאים ודגרו על הצלחת למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התעלות במדיה בזאלית לפני תחילת הבדיקה המתגלגלת.

בדוק היטב את התעלות במיקרוסקופ כדי לוודא שהתעלות מצופות כהלכה. לאחר מכן שטפו את תרחיף תאי HL 60 במדיה בסיסית פעמיים לאחר ספירת הכביסה השנייה, ולאחר מכן השעו מחדש את התאים ב-IMDM בחמש פעמים 10 עד שישית תאים לריכוז מיליליטר. לאחר הוספת 25 עד 50 מיקרוליטר של מתלה התא לשקע, הכניסו היטב את הצלחת למחזיק הצלחת מבוקרת הטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, והניחו את מחזיק הצלחת על שלב המיקרוסקופ.

הכנס את התאים לתעלה המיקרופלואידית. יש לצפות בהם תוך 10 עד 15 שניות הזורמים מהשקע לכניסה. כאן, ניתן לצפות בתאי HL 60 המסומנים פלואורסצנטית, המקיימים אינטראקציה עם המשטח המקודד P select, מציגים תגובת גלגול לבחינת תגובת הגלגול כפונקציה של מתח גזירה, להפחית את הגזירה ל-0.25 סעודות לסנטימטר רבוע ולרכוש 20 עד 32 סרטונים באמצעות פונקציית רכישת הזרם בכל גזירה רצויה, ועל ידי הגדלה הדרגתית של הגזירה מ-0.25 ל-5 סעודות לסנטימטר מרובע.

לבסוף, השתמש במצלמת CCD כדי לרכוש וידאו של הבדיקה עם רכישת זרם של 11 פריימים לשנייה. לדוגמה, כאן, מוצג תא HL 60 המתגלגל על שכבה אחת של תאי צ'ופ. נתח את הנתיבים והמהירויות המתגלגלים באמצעות התוכנה התואמת המתאימה.

תאי HL 60 נחשבים לגלילים סטנדרטיים של זהב מכיוון שהם מבטאים מגוון ליגנדים ביות, כולל הליגנדים המתגלגלים, P select וליגנד גליקופרוטאין אחד ו-CI Lewis X.To לבדוק את היכולות של המערכת המיקרופלואידית מרובת הבארות, תעלות מיקרופלואידיות רבות צופו בו זמנית במצעים שונים ובאינטראקציות הגלגול של תאי HL 60. עם המצעים הללו נותחו, התאים הפגינו התנהגות גלגול חזקה על המשטח המקודד P Select כאשר התאים נלכדו לראשונה מהזרימה, ואחריהם תנועת גלגול מובהקת. כפי שמוצג בגרף זה ובהתאם לספרות, תאי HL 60 מציגים התנהגות גלגול דומה על משטחי סלקטין e ו-p, אך לא על מצעים מצופים FiberInc.

מהירות התא כפי שנותחה באמצעות תוכנה תואמת תוכננה כנגד מתח מוחלט המראה תגובת גלגול חזקה של התאים על p ו-e סלקטין עם מהירות ממוצעת בין 1 ל-12 מיקרון לשנייה. כדי להעריך את ההיתכנות של מערכת מיקרופלואידית זו בבדיקה יעילה של האינטראקציות בין התאים המעניינים לבין תא חד-שכבתי המצפה את פני השטח נעשה שימוש בתאי CHO P, שהועברו כדי לבטא ביציבות P, אך לא e סלקטין, כפי שמוצג כאן. תאי HL 60 מציגים תגובת גלגול משמעותית על חד-שכבת תא CHO P כדי לבדוק אם תנועת הגלגול של HL 60 אכן מתווכת על ידי פקטין.

החד-שכבתי הודגרה מראש עם נוגדנים חוסמים לסלקטין P או E לפני השפע של תאי HL 60 לתעלה. כפי שמוצג בגרף זה, חסימת החד-שכבתי CHO p עם נוגדן P סלקטין הביאה לירידה משמעותית במספר תאי HL 60 המתגלגלים על פני השטח, מה שמדגים כי P בוחר ואכן מתווך גלגול HL 60. כפי שתואר קודם לכן, הצלחת המיקרופלואידית מרובת הבארות מורכבת ממספר תעלות מיקרופלואידיות נפרדות, המאפשרות בדיקת תפוקה גבוהה יותר של מספר תנאים שונים.

עיצוב יתרון זה שימש לצלחת תאי אנדותל בתוך התעלות המיקרופלואידיות לניתוח מהיר של האינטראקציות בין תאי HL 60 לתאי אנדותל במגוון תנאים ניסיוניים כדי לדמות מצבים דלקתיים, תאי אנדותל טופלו מראש בציטוקין הפרו-דלקתי TNF אלפא, וכתוצאה מכך ויסות מוגבר של E, אך לא P סלקטין על פני תא האנדותל. מעניין שתאי HL 60 לא קיימו אינטראקציה עם תאי האנדותל המושבתים, והתאים לא נצפו מתגלגלים על משטח זה. נהפוך הוא, תאי HL 60 הפגינו התנהגות גלגול חזקה על תאי אנדותל המופעלים על ידי TNF אלפא במהירות ממוצעת של חמישה עד 15 מיקרון לשנייה כדי לחקור את המעורבות של p או E סלקטין באינטראקציות המתגלגלות בין תאי HL 60 לתאי אנדותל מופעלים.

תאי אנדותל המופעלים על ידי TNF אלפא הודגרו מראש עם בחירת P או E בנוגדנים חוסמים, והגלגול של תאי HL 60 נותח כפי שמודגם בחסימת הגרף שנבחר על תאי אנדותל אלפא TNF הביא לירידה משמעותית במספר התאים המתגלגלים על חד-שכבת האנדותל המופעלת. לעומת זאת, שימוש בבקרת איזוטופ או נוגדן נגד פקטין, שאינו מתבטא בתאי אנדותל מופעלים, לא השפיע באופן משמעותי על גלגול HL 60 על שכבת האנדותל המופעלת. נתונים אלה מדגימים את המעורבות הישירה של S סלקטין בגלגול HL 60 על תאי אנדותל המופעלים על ידי TNF אלפא בהתאם לדיווחים קודמים.

תוכנת ניתוח מאפשרת מעקב אחר הנתיבים של תאים בודדים כשהם מקיימים אינטראקציה עם פני השטח. לפיכך, הנתיבים של תאים בודדים כשהם מקיימים אינטראקציה עם תאי אנדותל מופעלים TNF אלפא עם או בלי e select וחסימת נוגדנים היו במעקב ספציפי כפי שמוצג באיור זה, מספר התאים המתגלגלים על תאי אנדותל מופעלים לא חסומים היה גבוה משמעותית מאשר בתאי אנדותל מופעלים נבחרים וחסומים. יתר על כן, נראה כי תנועת הגלגול של תאי HL 60 על תאי אנדותל לא חסומים הייתה רציפה וחזקה בעוד שמסלולי הגלגול של התאים על תאי האנדותל הנבחרים והחסומים היו מקוטעים.

בהתאם לממצא זה, מהירות הגלגול של תאי HL 60 על תאי אנדותל מופעלים TNF אלפא לא חסומים הייתה נמוכה משמעותית ממהירות הגלגול בתאי אנדותל שנבחרו וחסומים. מחקר זה מדגים את השימוש במערכת מיקרופלואידית מרובה לביצוע יעיל של ניסויי גלגול תאים עם תפוקה מוגברת של עד 10 גזים מתגלגלים לשעה תחת זרימת צינור מבוקרת היטב. בסך הכל, מערכת מיקרופלואידית זו מתגלה כטכניקה רבת עוצמה לחקר גלגול תאים, היבט מרכזי של חידוד תאים.

לדוגמה, המעבדה שלנו משתמשת כיום במערכת זו כדי לסנן תנאים לשיפור הביות של תאי גזע מזנכימליים כאסטרטגיה לשיפור השפעתם התרפואטית.