Name: הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: חקור שיטות הפקת חלבונים משמרים תוך שמירה על מבנה תפקודי ומודיפיקציות טרנסלציוניות. הפרוטוקול כולל גידול תאים, הומוגניזציה וטיהור באמצעות רזין אפיניות לניתוח Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל החברים במעבדה Kerscher על תמיכתם. אנו מודים למארק Hochstrasser לזן שמרי MHY3765. עבודה זו נתמכה על ידי NSF מענק 1051970 (לאישור) והווארד יוז רפואי במכון לתואר ראשון ומסעות מענק מונרו חוקרי גרנט תכנית (לES).

טיהור של חלבוני 6xHIS-מתויגים המתבטאים בתאי שמרי ניצנים בתנאים מקומיים 1. צמיחה של תאי שמרים ואינדוקציה של ביטוי חלבון (שונה מ 2) אופציונלי: השתמש וגריתמית תרבויות שמרים גדלו מבטאות חלבון של עניין במקום תרבויות-Induced גלקטוז שתפורטנה להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך תאים של גל + שמרי מתח עם קידוד פלסמיד-גלקטוז מושרה 6xHIS מתויג חלבון של בחירה. לדוגמה, ראה רשימת חומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן transformants ב 5 מ&quot;ל של תקשורת סלקטיבית המתאימה (SD-אורציל למשל) המכיל 2% סוכרוז. לדגור על 30 מעלות CO / N, מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרבות O / N, כך שהצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מודדת 0.3 (OD 600 = 0.3) ב33 מ&quot;ל של תקשורת סלקטיבית עם 2% סוכרוז. לגדול ב 30 מעלות צלזיוס, רעד (Δ150 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התרבות הגיעה OD 600 = 0.8<html> -1.5, לגרום לביטוי של החלבון הרצוי על ידי הוספת 17 מ&quot;ל של YEP 3x עם גלקטוז 6% (מתכון בטבלה מס &#39;1), לריכוז סופי של 1x YEP עם 2% גלקטוז. נפח הכולל של התרבות הוא כעת 50 מ&quot;ל. דגירה, רועד, על 30 מעלות צלזיוס במשך 5-6 שעות נוספות. הערה: יכול להיות מגוון נפח התרבות. בשלב 1.3, לדלל לשני שלישים מהנפח הסופי הרצוי. בשלב 1.4, להוסיף נפח הסופי השליש מ3x YEP / 6% גלקטוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600 של התרבות המושרית ו צנטריפוגות Δ150-200 600 יחידות OD של תאים במשך 5 דקות ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה עם 1 מ&quot;ל קר כקרח PBS 1X עם מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x ולהעביר צינור כובע בורג מ&quot;ל 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים 1 דקות ב15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד הקפאת תא גלולה בחנקן נוזלי, ואחריו תמוגה המיידית תא או אחסון ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol>&gt; 2. הומוגניזציה של תאי שמרים והפקה של חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקפוא תא גלולה מהשלב הקודם, להוסיף 200 μl של חרוזי זכוכית חומצת שטף ו500 μl של חיץ תמוגה קר כקרח (מתכון בטבלה 1 או להשתמש במאגר תמוגה תא של בחירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה פיפטה מעלה ומטה. זה לא נדרש באופן מלא לresuspend תא גלולה. שמור צינורות על קרח בכל העת. הערה: סוף קצה פיפטה עשוי להיות מנותק לפני pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על 4 מעלות צלזיוס, מניח את הצינור (ים) עם תאים לתוך טחנת חרוז, שיווי המשקל, הנעילה, ולהפעיל את המכונה כהוראות יצרן לכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקצף חרוז המכיל את הצינור (ות) עבור 20 שניות ב 5.5 מ &#39;/ שנייה, ולאחר מכן מניח על קרח עכור דקות 1. חזור על 6x בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את החלבונים המופקים על ידי צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. אופציונלי: להסיר חלקיקים קטנים על ידי צנטריפוגה דרך פילטר SPINX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם של כל תא הדוארxtract (WCE) כדי לאשר את נוכחותו של החלבון של עניין על ידי כתם מערבי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף WCE מקביל עם 2 600 יחידות OD של תאים (לדוגמא 5 μl של תמצית תנוקה אם 200 600 יחידות OD של תאים נקצרו) ל -20% חומצת 800 μl Trichloroacetic (TCA). מערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 2.5 דקות ב 15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. למזוג supernatant, אבל להיות זהיר כדי לשמור על גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 800 μl של 2% TCA לגלולה ומערבולת הצינור, ואחריו צנטריפוגה ל2.5 דקות ב 15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. למזוג supernatant, אבל להיות זהיר כדי לשמור על גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 100 של חיץ מדגם TCA (מתכון בטבלה מס &#39;1), מערבולת לפזר גלולה. הערה: אם חיץ המדגם הופך להיות חומצי (הופך לצהוב) לאחר שבנוסף לגלולה, להוסיף aliquots של Δ10 טריס בסיס μl [1M] עד המדגם הוא כחול שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב100 ° C גוש חום במשך 2-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת AGעין לפזר באופן מלא אם שאריות של גלולה עדיין קיימות. פלטות שהוכנו על ידי שיטה זו הן קשה לשמצה להמסה מלאה. זה עלול לקחת Δ10 דקות של vortexing לפזר כדורים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם בחנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד להקפיא aliquots של WCE שנותר פינה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol> 3. טיהור אצווה של חלבונים מhomogenates התא שהמרים הערה: שיטת טיהור זו הוטבה לטיהור של חלבוני 6xHIS-מתויגים על CO 2 + שרף זיקת מתכת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איזון שרף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדגם בWCE פינה הוכן מΔ20-40 600 יחידות OD של תאים, להוסיף 50-100 μl של שרף זיקה לצינור microcentrifuge. חלבונים המופקים מהתאים שלא מבטאים את החלבון הרצוי או שרף לא ספציפי, כגון amylose, עשויים לשמש כשליטהים לכריכה ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף שרף 5x עם 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף: להפוך עליונה מעל לתחתית עד שרף הוא resuspended, ואז לסובב דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C. לשאוב supernatant. הערה: אם מבצע חילוץ וטיהור באותו היום, ניתן לבצע איזון שרף לפני המיצוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחייב חלבון לטיהור זיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100-200 μl של lysate פינה (Δ20-40 יחידות OD 600) ל50-100 חרוזים שטף μl, ולהביא את הנפח הכולל עד 1 מ&quot;ל עם חיץ תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם nutation או נדנדה על 4 מעלות צלזיוס במשך 2-5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, לשמור את דגימה של הנוזל העליון שנותר לניתוח שלאחר מכן של חלבונים מאוגד. TCA לזרז כמפורט לעיל לWCE (שלב 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף שרף עם חלבונים מאוגדים 5x עם 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף, ואחרי ספין דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב4 ° C. שמור דגימות קרות במהלך שוטף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elution של חלבונים Bound <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 חיץ elution μl לשרף, nutate על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ספין דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C ולשמור את supernatant בצינור חדש. אופציונלי: חזור על 2x וelutions בריכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם eluted לכתם מערבי: עד 25 μl של חלבוני eluted, להוסיף 25 סולפט μl 2x ליתיום dodecyl (LDS) חיץ מדגם עם 2 μl β-mercaptoethanol (BME) ו דגירה ב100 מעלות צלזיוס גוש חום למשך 2 דקות. הערה: ניתן להשתמש גם בחיץ מדגם Laemmli 2X הרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד חלבון eluted עודף הקפאה בחנקן נוזלי. אופציונלי: חלבונים שנותרו רצועה משרף עם נפח שווה של חיץ מדגם LDS 2x על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, הסירו את חלבוני LDS-eluted לצינור חדש, ולאחר מכן להוסיף 2 BME μl לחלבוני eluted, לא לשרף. צו זה הוא למנוע ההסרה של כל יונים או נוגדני הconjugaטד את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות דגימות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם מערבי ובדיקה עם נוגדנים מתאימים כדי להמחיש חלבונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10-20 μl (Δ1-3 יחידות OD 600) של כל דגימה ו3-10 μl של סולם חלבון בג&#39;ל-SDS של בחירה. ג&#39;לי בשימוש שגרתי עבור פרוטוקול זה כולל 4-12% Bis-טריס ו8% טריס-גליצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל הג&#39;ל על 200 V למשך 50 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים מג&#39;ל לקרום PVDF על ידי העברת חצי יבשה ב19 V במשך 20-30 דקות (מתכון בטבלה מס &#39;1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרום בבלוק 4% milk/1x טריס נאגר מלוח-Tween (TBST) במשך שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C (מתכון בטבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן עיקרי לחלבון epitope מתויג עניין ב4% TBST milk/1x עבור 1-3 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום 3x במשך 5 דקות כל אחד עם TBST 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם קרום מתאיםperoxidase המשני חזרת (HRP) מצומדות נוגדן ל1-3 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום 3x במשך 15 דקות כל אחד בנפח גדול של TBST 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות עם קרום מצע ECL ולעטוף בניילון נצמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הקרום לסרט ולפתח לדמיין חלבון. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li>
<li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li>
<li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li>
<li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li>
<li>Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li>
<li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeutscher%2C+MP+%22Guide+to+protein+purification%22">Guide to protein purification</a>. , (1990).</li>
<li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+Method%3A+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233(1988).</li>
<li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2%2B+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li>
<li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li>
<li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74(2011).</li>
<li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת שלמה, ילידים, ולאחר translationally שונה חלבונים מתאי שמרי ניצנים עבור יישומים למטה הנחל. לפני שאנסה פרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי לקבוע אם החלבון של עניין ניתן לאתר בקלות בתמציות חלבונים שהוכנו תחת denaturing תנאי 12. אם נוגדני polyclonal אינם זמינים זה עשוי להיות יתרון לepitope תג החלבון של עניין, כך שחלבון ההיתוך ניתן להבחין בכתמים מערביים. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתויגים SIZ1 עם HA, 6xHIS-V5, או תגיות epitope myc ואסטרטגיה זו אפשרה לנו...

כוח האדיר של שמרי גנטיקה הוא אגדי, אבל ההכנה והניתוח של חלבוני ילידים משמרי ניצנים, Saccharomyces cerevisiae, הוא לעתים קרובות כרוכה בבעיות. האחרון הוא כתוצאה מהחוזק מכאני הניכר והאלסטיות של תא שמרי 1 הקיר. אמצעים שונים כבר תאר להאנזימטית, כימית, מכאני, ומבוסס לחץ השיבוש של תאי שמרים להשיג תמצית חלבון כל תא 2-6. טכניקות אלו משתנות במידה רבה ביעילותם להניב תמציות חלבוני תא נציגויות, ילידים שיכולים לשמש לניתוחים שלאחר מכן או צעדי טיהור. לדוגמה, ניתן להסיר את דופן תא השמרים עם אנזימים ממסים (למשל zymolyase) וכתוצאה מכך יכול spheroblasts להיות מופר על ידי גז, חומרי ניקוי, או תמוגה האוסמוטי לשחרר חלבונים. גישה זו כבר מועסק בהצלחה כנקודה מוצאת לחלוקות subcellular רבות אבל זה דורש incubations ארוךשאינם תואם את היציבות של חלבונים מסוימים 7. ריאגנטים תמוגה שמרי קנייניות (כגון חומרי ניקוי) למיצוי הכימי של חלבונים של תאי שמרים זמינים מסחרי, אבל היעילות של חומרים כימיים האלה במיצוי חלבון והשפעתם על האפיון ביוכימי הבא של חלבונים לא תמיד ברורה 8. homogenizers לחץ גבוה, המכונה לעתים קרובות לוחץ צרפתית, ביעילות לשבור תאי שמרים על ידי חשיפתם הראשונה ללחץ גבוה ולאחר מכן extruding אותם דרך פתח קטן בתא לחץ. טכניקה זו מייצרת תמציות באיכות גבוהות, אבל הציוד מאוד יקר ולא יכול להיות מתאים לכמויות קטנות של תאים או במספר רב של דגימות 9. לכן, הפרעה מכאנית של תאי שמרים בטחנת חרוז היא לעתים קרובות את שיטת בחירה של חלבון הכנות שמרי ילידים 10. טכניקה זו כרוכה בהפרעה מכאנית של דופן תא השמרים עם חומצה-WAלשפוך חרוזי זכוכית, אשר יכול להיות שנערכו עם מגוון רחב של המלשינים, vortexers או טחנות חרוזים. יש לציין, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעבד בו זמנית מספר רב של מדגמים קטנים יותר (1 מ&quot;ל של תאים או פחות). חרוזים שונים או מטריצות שיבוש טחנת חרוז זמינים מסחרי לשבש כמעט כל סוג של תא בסוג 2 צינורות מ&quot;ל עכשיו. בהתחשב בטכניקות ובציוד האחרות, יש טחנת חרוז יתרון נוסף שהשיבוש של תאי שמרים מתרחש מהר מאוד, מה שעוזר לשימור לאחר translational שינויים כגון sumoylation, במיוחד כאשר את המאגרים המתאימים עם פרוטאז ו / או מעכבי proteasome מנוצלים והטמפרטורה של תמציות נשלטת. פרוטוקול זה מתמקד בחילוץ המהיר, יעיל, ואמין של חלבונים אנדוגניים וביטוי יתר בתנאים עדינים עם המטרה הסופית לשמר את תפקוד חלבון, יחסי גומלין, ולאחר translational שינויים. תקשורת צמיחה, מאגר תמוגה תאקומפוזיציות והגדרות טחנת חרוז מותאמות לשמור על אינטראקציות חלבון ולאחר translational שינויים כגון sumoylation וubiquitylation.

<table><tbody><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td></td></tr><tr><td>Yeast ORF strain in BG1805</td><td>ThermoScientific</td><td>YSC3869</td><td>GAL+ זן שמרים שניתן להשתמש בו לאינדוקציה ומיצוי</td></tr><tr><td>pYES2.1 TOPO וקטור</td><td>Life Technologies</td><td>K4150-01</td><td>GAL+ זן שמרים שניתן להשתמש בו לאינדוקציה ומיצוי; מכיל תג V5/6xHIS</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז קוקטייל חד פעמי ( 100x)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>2.0 מ"ל צינור חצאית עם מכסה בורג קשור</td><td>BioExpress</td><td>C-3369-3</td><td>ודא שהצינור מתאים כראוי לקרע החרוזים</td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה, 425-600 ומיקרו; m (30-40 מסננת ארה"ב)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X מסנני צינור צנטריפוגה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161</td><td>שימוש לסינון נוסף של ליזאט מובהר</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>לטיהור חלבונים מתויגים 6xHIS</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>כדי להכין ו/או להעלים דגימות לפני SDS-PAGE ו-Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td>ג'לים טרומיים המשמשים לעתים קרובות עבור SDS-PAGE לפני Western Blotting</td></tr><tr><td>Simply Blue</td><td>Life Technologies</td><td>#LC6060</td><td>כתם ג'ל חלבון</td></tr><tr><td>מאגר ליזה של יונקים</td><td>Promega</td><td>G9381</td><td>מאגר ליזה מסחרי חלופי</td></tr><tr><td>Anti-V5 agarose</td><td>Sigma</td><td>A7345</td><td>שיטת אימונו-משקעים</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>PVDF ממברנה</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS ג'לים</td><td>Life Technologies NP0321BOX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד myc</td><td>Covance</td><td>mms-150R</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני</td><td>Abcam</td><td>ab97040</td><td>עז pAb לעכבר IgG (HRP)</td></tr></tbody></table>

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization ממכות חרוז הוא דרך מהירה ויעילה כדי לשחרר דנ&quot;א, רנ&quot;א, חלבונים ומטבוליטים מתאי שמרי ניצנים, שהם קשים לשמצה לשבש. כאן אנו מתארים את השימוש בטחנה homogenizer חרוז להפקת חלבונים לתוך המאגרים מותאמים לשמור את הפונקציות, אינטראקציות ולאחר translational שינויים של חלבונים. תאים גדלים וגריתמית המבטאים את החלבון של עניין הם גדלו בתקשורת צמיחה נוזלית של בחירה. את תקשורת הצמיחה עלולה להיות בתוספת חומרים כימיים כדי לגרום ביטוי חלבון מיזמים מושרים (למשל גלקטוז), לסנכרן את שלב מחזור תא (לדוגמא nocodazole), או לעכב פונקצית proteasome (למשל MG132). תאים אז pelleted וresuspended בחיץ מתאים המכיל פרוטאז ו / או מעכבי phosphatase ומעובדים או מייד או קפוא בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר. Homogenization מושגת על ידי שישה מחזורים של 20 שניות ביהD-מכות (5.5 מ &#39;/ שנייה), כל אחד ואחריו דגירה דקה אחת על קרח. Homogenate כתוצאה מכך אינו מסומן על ידי צנטריפוגה וניתן להסיר חלקיקים קטנים על ידי סינון. כל תמצית התא פינה כתוצאה מכך (WCE) הוא זירז באמצעות 20% TCA לניתוח ישיר של חלבונים הכולל ב-SDS אחריו מערבי סופג. תמציות מתאימות גם לטיהור זיקה של חלבונים מסוימים, זיהוי של לאחר translational שינויים, או הניתוח של חלבוני שיתוף לטיהור. כמו במקרה של רוב פרוטוקולי טיהור חלבונים, אנזימים וחלבונים מסוימים עשויים לדרוש תנאים ייחודיים או בהרכבי חיץ לטיהורם ואחרים עשויים להיות לא יציבים או לא מסיס בתנאים האמורים. במקרה האחרון, שהוצג הפרוטוקול עשוי לספק נקודת התחלה שימושית אמפירי כדי לקבוע את אסטרטגית חרוז המכות הטובה ביותר למיצוי חלבון וטיהור. אנחנו מראים את השאיבה וטיהור של epitope מתויג SUMO E3 האנזים, Siz1, מחזור תאמוסדר חלבון שהופך גם sumoylated וphosphorylated, כמו גם למקטע האנזים היוביקוויטין SUMO ממוקד, Slx5.

תוצאות הנציג שלנו מגלות כי פרוטוקול חילוץ חרוז מכות וחלבון תאר שימושי להכנה לשחזור של חלבונים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם (בטבלה 2). -SDS אחריו מכתים Coomassie של WCEs מראה כי מגוון רחב של חלבונים (~ 12 ל&gt; 250 KDA) ניתן לחלץ reproducibly מתאי שמרים (איור 1 א). להקות בדידות על פני טווח של משקלים מולקולריים מצביעות על תמציות חלבונים באיכות גבוהות. האיכות של תמציות יכולה להיות מאושרת על ידי מערבי סופג לחלבוני epitope-מתויגים ספציפיים. מוצ...

הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים.

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק חלבוני שמרים תוך שימור מבנה הנייטיב, האינטראקציות התפקודיות ומודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות. זאת מושג תחילה על ידי גידול תאים כדי להשרות ביטוי של החלבון הנחקר. לאחר מכן, תאי השמרים שנאספו עוברים הומוגניזציה בבופר מתאים להפקת החלבונים.לאחר מכן, החלבונים המבוקשים מטוהרים מהתמצית המזוכללת של תאי השלמים באמצעות שרף זיקה (affinity resin). השלב האחרון של הפרוצדורה הוא אלואוציה (elution) של החלבונים המטוהרים מהשרף לצורך ניתוח המשכי או יישומים בהמשך התהליך. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות שינויים בטיהור החלבונים ואינטראקציות על בסיס ניתוח western blot.את הפרוצדורה תדגים אווה, בוגרת של אוניברסיטת ויליאם אנד מרי, אשר בילתה את השנתיים האחרונות כחוקרת לתואר ראשון במעבדתי. היתרון המרכזי של שיטת ה-bead beading על פני שיטות קיימות אחרות הוא העיבוד והליזיס המהירים של דגימות מרובות בתנאים המשמרים את תפקוד החלבון, האינטראקציות והמודיפיקציות לאחר תרגום. כדי להתחיל, טרנספורמי תאים של זן שמרים חיובי לגלקטוז עם פלסמיד המקודד לחלבון נבחר עם תג His, הניתן להשראה על ידי גלקטוז; זרע את הטרנספורמנטים ב-5 mL של מצע סלקטיבי מתאים, כגון SD uracil, המכיל 2% sucrose, והדגר במצב סיבוב ב-30 °C למשך לילה. למחרת, דלל את תרבית הלילה במצע סלקטיבי עם 2% sucrose לנפח סופי של 33 mL, כך שהצפיפות האופטית ב-600 nm תהיה 0.3; גדל באינקובטור עם ניעור ב-30 °C וב-150 RPM.כאשר התרבית מגיעה ל-OD 600 של 0.8 עד 1.5, השרו ביטוי של החלבון הרצוי על ידי הוספת 17 מיליליטר של 3X XYEP עם 6% galactose, כדי להגיע לריכוז סופי של 1X XYEP עם 2% galactose, והעבירו לאינקובטור נער בטמפרטורה של 30 °C למשך חמש עד שש שעות נוספות. לאחר מדידת ה-OD 600 של התרבית המהומה, סבבו במצנטריפוגה כ-150 עד 200 יחידות OD 600 של תאים למשך חמש דקות במהירות של 5,000 RPM בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן השתמשו ב-1 מיליליטר של 1X XPBS קר מאוד עם 1x protease inhibitor cocktail כדי לסבב מחדש את משקע התאים והעבירו אותו לשפופרת עם מכסה הברגה בנפח של 2 מיליליטר. סבבו את התאים במצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 15,000 RPM ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר שפיכת הנוזל העליון, בצעו הקפאה מהירה (snap freeze) למשקע התאים בחנקן נוזלי.הוסיפו 200 µL של חרוזי זכוכית שטיפה בחומצה ו-500 µL של בופר ליזיס קר. שמרו על המבחנות על קרח בכל עת. השתמשו בטיפ פיפט שקצצו את קצהו כדי לבצע פיפטור מהיר למעלה ולמטה בטמפרטורה של 4 °C.הניחו את מבחנות התאים בנעילת המאזן של טחנת הכדורים (bead mill) והפעילו את המכשיר לפי הנחיות היצרן למשך 20 שניות במהירות של 5.5 meters per second. לאחר מכן, הניחו את המבחנות על קרח נמס למשך דקה אחת. חזרו על הפעולה שישה פעמים בסך הכל כדי לנקות את החלבונים שהופקו, ולאחר מכן בצעו סנטריפוגה למשך 15 דקות ב-15,000 RPM בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius.כדי להכין דגימה של תמצית תא שלם או WCE עבור western blot, הוסיפו WCE המקביל לשתי יחידות OD 600 של תאים ל-800 microliters של 20% trichloroacetic acid או TCA וערבבו באמצעות vortex. כדי לטהר דגימה של WCE צלול, העבירו 50 עד 100 microliters של affinity resin למבחנה חדשה למיקרו-צנטריפוגה; שטפו והאזנו את השרף על ידי הוספת one milliliter של wash buffer והפכו את המבחנה מלמעלה למטה עד שהשרף יתערבב מחדש. לאחר סבב של דקה אחת ב-5,000 RPM וב-four degrees Celsius, שאבו את הנוזל העליון. כדי לקשור חלבון לניקוי זיקה (affinity purification), הוסיפו 100 עד 200 microliters של lysate צלול לחרוזי השטיפה והשתמשו ב-lysis buffer כדי להביא את הנפח הכולל ל-one milliliter.הדגירה תתבצע עם מוטציה או בערבול (rocking) בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים עד חמש שעות. השתמשו בחנקן נוזלי להקפאה מהירה (snap freeze) של מנות מה-WCE הצלול שנותר, ואחסנו בטמפרטורה של 80 °C- עד לשימוש נוסף, בעוד שתמיסת הליסאט מהסלק מדגגרת על קרח עבור דגימת ה-Western blot של ה-WCE. לאחר סבב צנטריפוגה של שתי דקות וחצי במהירות של 15,000 RPM בטמפרטורה של 4 °C, שפכו את הנוזל העליון (supernatant) תוך הקפדה על שימור המשקע (pellet), הוסיפו למשקע 800 µL של 2% TCA וערבבו בורטקס (vortex) את המבחנה לפני חזרה על סבב הצנטריפוגה של שתי הדקות וחצי.לאחר דקנטציה זהירה של העלייה, הוסף 100 µL של TCA sample buffer וערבב במכשיר vortex כדי להמיס את המשקע לפני הדגראציה של הדגימה. בבלוק חימום בטמפרטורה של 100 °C למשך שתיים עד חמש דקות, בצע את הפעולה שניתם כדי להמיס לחלוטין שאריות של המשקע, שעלולות להיות קשות להמסה, ואחסן בטמפרטורה של 80°C- עד למועד השימוש. לאחר דגראציה של דגימת ה-lysate bead, וספינטציה במהירות של 5,000 RPM ובטמפרטורה של 4 °C למשך דקה אחת, השתמש ב-wash buffer כדי לשטוף את השרף חמש פעמים לצורך אלוציה של החלבונים.הוסיפו 150 µL של בופר אלואוציה (elution buffer) לשרף, דגרו בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. צנטריפוגו למשך דקה אחת ב-5,000 RPM ובטמפרטורה של 4 °C ושמרו את העל-נוזל (supernatant) במבחנה חדשה. לבסוף, כדי להכין דגימה ל-western blot, הוסיפו 25 µL של בופר דגימה 2x lithium dodecyl sulfate עם 2 µL של BME ל-25 µL של דגימת חלבון UD.כפי שמוצג בדמות זו, ניתן להוציא באופן הדיר חלבונים במגוון רחב מתאי שמרים. פסים נפרדים בטווח של משקלים מולקולריים מעידים על תמציות חלבון באיכות גבוהה. ניתן לאשר את איכות התמציות באמצעות western blotting עבור חלבונים עם תג epitope ספציפי.כאן מוצגת תוצאה מייצגת עבור ה-Sumo Ligase עם חמישה תגים בעל ביטוי יתר של גალაქטוז, אשר רץ בערך ב-120 kilodaltons. בדרך כלל, חלבונים שעברו פירוק חלקי יופיעו כפרגמנטים מרובים מתחת למשקל הצפוי, אך כאן נצפה רק החלבון באורכו המלא. בנוסף, תסמיכים בעלי משקל מולקולרי גבוה של חלבון נתון עשויים להעיד על מודיפיקציות לאחר תרגום.לדוגמה, ניתן לראות כאן ביטוי יתר של lactose sumo related S one delta four 40 ו-SIS one באורכו המלא. כפי שהודגם ב-Western blot זה, ניתן לשמר מודיפיקציות גם על S one המבוטא באופן אנדוגני. איור זה מראה כי שני חלבונים המועשרים בגרעין, SLX five ו-CS one delta four 40, טוהרו בהצלחה מה-ws שלנו.באופן בולט, ניתן לטהר בזיקה חלבון המסומן בתג 6-histidine מ-W'S, הן בתנאים טבעיים (native) והן בתנאי דנטורציה. לעומת זאת, SLX 5G ST ו-CS one delta four 40 ha חסרים epitope של 6-histidine, אך בתנאים טבעיים הם עדיין מקיימים אינטראקציה עם שרף זיקת המתכת באופן הרגיש ל-ole. אנו מציעים כי CIS one, ובמידה פחותה SLX five, מסוגלים להיקשר לשרף זיקת המתכת באמצעות דומיין טבעת תיאום המתכות שלהם.למרות שלמיטב ידיעתנו, תופעה ספציפית זו טרם דווחה, תואר מצב דומה שבו תת-יחידה B של רעל הכלרה נקשרת לשרף זיקה של Nicola באופן המתווך על ידי שאריות היסטמידין טבעיות שלה. תצפית זו מרמזת כי חלבונים ב-WCER, לפחות בחלקם, מקופלים באופן טבעי לצורך חקר תפקוד חלבונים. חשוב להראות שקומפלקסים של חלבונים נותרים שלמים בתמריתי תאים שלמים.נתונים מייצגים גילו כי CS one delta four 40 SLX five, ו-P GK one, חלבון ציטוזולי המשמש כבקרת טעינה, היו נוכחים ב-WS cis one. Delta four 40 בודד מתמריות אלו על בסיס יכולתו המולדת להיקשר לשרפים בעלי זיקה למתכת. בנוסף, כאשר SLX five ו-SIS one בועו ביטוי משותף בתאי שמרים, רמות ה-SLX five ב-EITs עלו, דבר שמעלה את האפשרות ש-SLX five עשוי להקיים אינטראקציה עם SIS one.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן גידול ועיבוד תאי שמרים במטרה להפיק, לטהר ולהדגים חלבוני שמרים תחת תנאים טבעיים (native conditions).

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד...

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

זיהום של ההכנות של הריבוזומים אוקריוטים מטוהרים באמצעות שיטות מסורתיות על ידי שיתוף טיהור nucleases ו פרוטאזות משפיע לרעה על ניתוחים ביוכימיים ומבניים במורד הזרם. שיטה מהירה ופשוטה טיהור chromatographic משמש כדי לפתור את הבעיה הזו באמצעות הריבוזומים שמרים כמערכת מודל.

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

כתב יד זה מתאר את הגילוי של sumoylation וubiquitination של חלבוני קינטוכור, Ndc10 וNdc80, בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים.

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

כאן אנו מציגים פרוטוקול אקספרס, solubilize של לטהר מספר שנאים בוראט האיקריוטים עם הומולוגיה למשפחה טרנספורטר SLC4 בעזרת שמרים. אנו מתארים גם assay cross-linking כימי כדי להעריך את החלבונים homomeric מטוהרים להרכבה multimeric. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים חלבונים ממברנה מאתגרים אחרים.

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה עבור הביטוי, טיהור וליפופי מחייב של SNX-BAR הטרודימרים ב שמרים.

ביטוי, טיהור, וליפוזום קשירה של שמרים מסוג SNX-BAR הטרודיורס

למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

חקור שיטות הפקת חלבונים משמרים תוך שמירה על מבנה תפקודי ומודיפיקציות טרנסלציוניות. הפרוטוקול כולל גידול תאים, הומוגניזציה וטיהור באמצעות רזין אפיניות לניתוח Western blot.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

גלה סרטונים נוספים