הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ חלבוני שמרים תוך שמירה על אינטראקציות תפקוד מבנה מקוריות ושינויים לאחר התרגום. זה מושג על ידי גידול תאים ראשונים כדי לגרום לביטוי של החלבון המעניין. לאחר מכן, תאי השמרים שנקטפו עוברים הומוגניזציה במאגר מתאים כדי לחלץ את החלבונים.

לאחר מכן מטוהרים החלבונים המעניינים מתמצית התא השלם המובהרת באמצעות זיקה של שרף. השלב האחרון של ההליך הוא לחמוק מהחלבונים המטוהרים משרף הזיקה להמשך ניתוח או יישומים במורד הזרם. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים ואינטראקציות בטיהור חלבונים על סמך ניתוח כתמים מערביים.

מי שתדגים את ההליך תהיה קיי של אווה, בוגרת וויליאם ומרי שבילתה את השנתיים האחרונות כחוקרת לתואר ראשון במעבדה שלי. היתרון העיקרי של חרוזי חרוזים על פני שיטות קיימות אחרות הוא עיבוד מהיר וליזה של דגימות מרובות בתנאים המשמרים אינטראקציות תפקוד חלבון ושינויים לאחר התרגום. כדי להתחיל להתמיר תאים של זן שמרים חיובי עם פלסמיד המקודד גלקטוז הניתן להשראת שש, החלבון המתויג שלו מחסן טרנספורמנטים בחמישה מיליליטר של מדיום סלקטיבי מתאים כגון אורציל SD, המכיל 2% סוכרוז ודוגר ב-30 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם סיבוב למחרת לדלל את תרבית הלילה בתווך סלקטיבי עם 2% סוכרוז לנפח סופי של 33 מיליליטר כך שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מודד 0.3, גדל באינקובטור רועד ב-30 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד.

כאשר התרבית הגיעה ל-OD 600 של 0.8 עד 1.5, גרמו לביטוי של החלבון הרצוי על ידי הוספת 17 מיליליטר של שלושה XYEP עם 6% גלקטוז לריכוז סופי של XYEP אחד עם 2% גלקטוז המונח באינקובטור רועד ב-30 מעלות צלזיוס למשך חמש עד שש שעות נוספות. לאחר מדידת ה-OD 600 של צנטריפוגת התרבית המושרה כ-150 עד 200 OD 600 יחידות תאים למשך חמש דקות ב-5,000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס, ואז השתמש במיליליטר אחד של קרח קר XPBS אחד עם קוקטייל מעכב פרוטאז אחד כדי להשעות מחדש את חיך התא ולהעביר אותו לצנטריפוגה של צינור מכסה בורג של שני מיליליטר התאים למשך דקה אחת ב-15, 000 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס. לאחר סילוק הצמד הסופרנטנט הקפיאו את כדור התא בחנקן נוזלי לכדור התא הקפוא.

הוסף 200 מיקרוליטר חרוזי זכוכית שטופים בחומצה ו -500 מיקרוליטר מאגר ליזה קר כקרח. שמירה על הצינורות על קרח כל הזמן. השתמש בקצה פיפטה עם חתך הקצה כדי להניע לזמן קצר למעלה ולמטה בארבע מעלות צלזיוס.

הכנס את צינורות התאים לתוך מנעול איזון טחנת החרוזים והפעל את המכונה לפי הוראות היצרן למשך 20 שניות במהירות של 5.5 מטר לשנייה. לאחר מכן הניחו את הצינורות על קרח רפש למשך דקה אחת. חזור על הפעולה בסך הכל שש פעמים כדי לנקות את צנטריפוגת החלבונים המופקים למשך 15 דקות ב-15,000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן להכין דגימה של תמצית התא השלם או WCE עבור כתם מערבי ו- WCE המתאים לשתי יחידות OD 600 של תאים ל -800 מיקרוליטר של חומצה טריכלורואצטית 20% או מערבולת TCA לערבוב. כדי לטהר דגימה של WCE שקוף ב-50 עד 100 מיקרוליטר של שרף זיקה לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש, שטפו ואזנו את השרף על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר כביסה והפכו את החלק העליון מעל התחתון עד שהשרף מושעה מחדש. לאחר סיבוב של דקה אחת ב-5,000 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס, שאפו את הסופרנטנט כדי לקשור חלבון לטיהור זיקה ב-100 עד 200 מיקרוליטר של ליזאט מנוקה לחרוזים השטופים והשתמשו במאגר ליזה כדי להביא את הנפח הכולל למיליליטר אחד.

דגירה עם מוטציה או נדנוד בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד חמש שעות. השתמש בחנקן נוזלי כדי להקפיא כמויות של ה-WCE השקוף שנותר ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף, בזמן שתמיסת סלק הליזאט דוגרת עבור דגימת הכתם המערבי של WCE על קרח. לאחר סיבוב של שתיים וחצי דקות ב-15,000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס, שפכו את הסופרנטנט תוך הקפדה לשמור על הגלולה, הוסיפו 800 מיקרוליטר של 2% TCA לגלולה ומערבלו את הצינור לפני שתחזרו על הסיבוב של שתיים וחצי דקות.

לאחר סילוק זהיר של הסופרנטנט, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר דגימת TCA ומערבולת כדי להמיס את הגלולה לפני הדגירה של הדגימה. בבלוק חום של 100 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד חמש דקות לוקח פעם שנייה להמיס לחלוטין את שאריות הגלולה, שעלולות להיות קשות להמסת ולאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לשימוש. לאחר הדגירה של דגימת חרוז הליזאט, לאחר סיבוב ב-5,000 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, השתמש במאגר כביסה כדי לשטוף את השרף חמש פעמים כדי לסלק את החלבונים.

הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר פליטה לשרף בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. סובב במשך דקה אחת ב-5,000 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס ושמור את הסופרנטנט בצינור חדש. לבסוף, להכין דגימה לכתם מערבי ב-25 מיקרוליטר של שני x מאגר דגימת ליתיום דוקל סולפט עם שני מיקרוליטרים של BME עד 25 מיקרוליטר של דגימת חלבון UD.

כפי שמוצג באיור זה, ניתן להפיק מגוון רחב של חלבונים מתאי שמרים. רצועות בדידות במגוון משקלים מולקולריים מעידות על תמציות חלבון באיכות גבוהה. ניתן לאשר את איכות התמציות על ידי כתמים מערביים לחלבונים ספציפיים המתויגים באפיטופים.

הנה תוצאה מייצגת עבור הגלקטוז מבוטא יתר על המידה V חמש Sumo Ligase הוא אחד שנודד בכ-120 קילו-דלטון. בדרך כלל, חלבונים שהתפרקו חלקית ירוצו כמקטעים מרובים מתחת למשקל הצפוי, אך כאן נצפה רק חלבון באורך מלא. בנוסף, תוספות משקל מולקולרי גבוהות של חלבון נתון עשויות להצביע על שינויים לאחר התרגום.

לדוגמה, כאן ניתן לראות לקטוז מעל סומו מבוטא הקשור S אחד דלתא ארבע 40 ו-SIS באורך מלא אחד. כפי שהודגם בכתם המערבי הזה, ניתן לשמר שינויים גם ב-S 1 המבוטא באופן אנדוגני. איור זה מראה ששני חלבונים מועשרים גרעיניים SLX 5 ו-CS דלתא אחת 4 40 טוהרו בהצלחה מ-ws שלנו.

יש לציין כי חלבון מתויג של שש שריקה יכול להיות מטוהר מ-W'S, הן בתנאים טבעיים והן בתנאי דנטורינג. לעומת זאת, SLX 5G ST ו-CS דלתא אחת ארבע 40 דונם חסרים אפיטופ של שש שריקה, אך בתנאים מקוריים עדיין מקיימים אינטראקציה עם שרף הזיקה למתכת בצורה רגישה ל-ole. אנו מציעים ש-CIS one ובמידה פחותה SLX 5 מסוגלים לקשור את שרף הזיקה למתכת באמצעות תחום טבעת התיאום המתכתית שלהם.

בעוד שלמיטב ידיעתנו, תופעה מסוימת זו עדיין לא דווחה, תואר מצב דומה שבו תת-יחידה B של רעלן כול קושרת שרף זיקה של ניקולה באופן המתווך על ידי שאריות ההיסטמין הטבעיות שלו. תצפית זו מצביעה על כך שחלבונים ב-WCER, לפחות בחלקם, מקופלים באופן טבעי לחקר תפקוד החלבון. חשוב להראות כי קומפלקסים של חלבונים נשארים שלמים בתמציות תאים שלמים.

נתונים מייצגים חשפו כי CS אחד דלתא ארבע 40 SLX חמש, ו-P GK אחד, חלבון ציטוזולי המשמש כבקרת עומס היו קיימים ב-WS cis. דלתא ארבע 40 טוהר מתמציות אלה על סמך יכולתו הטבועה להיקשר לשרפים בעלי זיקה למתכת. בנוסף, כאשר SLX 5 ו-SIS 1 באו לידי ביטוי בתאי שמרים, רמות SLX 5 ב-EITs גדלו, מה שמעלה את האפשרות ש-SLX 5 עשוי לקיים אינטראקציה עם SIS 1.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגדל ולעבד תאי שמרים על מנת לחלץ, לטהר ולדמיין חלבוני שמרים בתנאים מקוריים.