הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק חלבוני שמרים תוך שימור מבנה הנייטיב, האינטראקציות התפקודיות ומודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות. זאת מושג תחילה על ידי גידול תאים כדי להשרות ביטוי של החלבון הנחקר. לאחר מכן, תאי השמרים שנאספו עוברים הומוגניזציה בבופר מתאים להפקת החלבונים.

לאחר מכן, החלבונים המבוקשים מטוהרים מהתמצית המזוכללת של תאי השלמים באמצעות שרף זיקה (affinity resin). השלב האחרון של הפרוצדורה הוא אלואוציה (elution) של החלבונים המטוהרים מהשרף לצורך ניתוח המשכי או יישומים בהמשך התהליך. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות שינויים בטיהור החלבונים ואינטראקציות על בסיס ניתוח western blot.

את הפרוצדורה תדגים אווה, בוגרת של אוניברסיטת ויליאם אנד מרי, אשר בילתה את השנתיים האחרונות כחוקרת לתואר ראשון במעבדתי. היתרון המרכזי של שיטת ה-bead beading על פני שיטות קיימות אחרות הוא העיבוד והליזיס המהירים של דגימות מרובות בתנאים המשמרים את תפקוד החלבון, האינטראקציות והמודיפיקציות לאחר תרגום. כדי להתחיל, טרנספורמי תאים של זן שמרים חיובי לגלקטוז עם פלסמיד המקודד לחלבון נבחר עם תג His, הניתן להשראה על ידי גלקטוז; זרע את הטרנספורמנטים ב-5 mL של מצע סלקטיבי מתאים, כגון SD uracil, המכיל 2% sucrose, והדגר במצב סיבוב ב-30 °C למשך לילה. למחרת, דלל את תרבית הלילה במצע סלקטיבי עם 2% sucrose לנפח סופי של 33 mL, כך שהצפיפות האופטית ב-600 nm תהיה 0.3; גדל באינקובטור עם ניעור ב-30 °C וב-150 RPM.

כאשר התרבית מגיעה ל-OD 600 של 0.8 עד 1.5, השרו ביטוי של החלבון הרצוי על ידי הוספת 17 מיליליטר של 3X XYEP עם 6% galactose, כדי להגיע לריכוז סופי של 1X XYEP עם 2% galactose, והעבירו לאינקובטור נער בטמפרטורה של 30 °C למשך חמש עד שש שעות נוספות. לאחר מדידת ה-OD 600 של התרבית המהומה, סבבו במצנטריפוגה כ-150 עד 200 יחידות OD 600 של תאים למשך חמש דקות במהירות של 5,000 RPM בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן השתמשו ב-1 מיליליטר של 1X XPBS קר מאוד עם 1x protease inhibitor cocktail כדי לסבב מחדש את משקע התאים והעבירו אותו לשפופרת עם מכסה הברגה בנפח של 2 מיליליטר. סבבו את התאים במצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 15,000 RPM ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר שפיכת הנוזל העליון, בצעו הקפאה מהירה (snap freeze) למשקע התאים בחנקן נוזלי.

הוסיפו 200 µL של חרוזי זכוכית שטיפה בחומצה ו-500 µL של בופר ליזיס קר. שמרו על המבחנות על קרח בכל עת. השתמשו בטיפ פיפט שקצצו את קצהו כדי לבצע פיפטור מהיר למעלה ולמטה בטמפרטורה של 4 °C.

הניחו את מבחנות התאים בנעילת המאזן של טחנת הכדורים (bead mill) והפעילו את המכשיר לפי הנחיות היצרן למשך 20 שניות במהירות של 5.5 meters per second. לאחר מכן, הניחו את המבחנות על קרח נמס למשך דקה אחת. חזרו על הפעולה שישה פעמים בסך הכל כדי לנקות את החלבונים שהופקו, ולאחר מכן בצעו סנטריפוגה למשך 15 דקות ב-15,000 RPM בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius.

כדי להכין דגימה של תמצית תא שלם או WCE עבור western blot, הוסיפו WCE המקביל לשתי יחידות OD 600 של תאים ל-800 microliters של 20% trichloroacetic acid או TCA וערבבו באמצעות vortex. כדי לטהר דגימה של WCE צלול, העבירו 50 עד 100 microliters של affinity resin למבחנה חדשה למיקרו-צנטריפוגה; שטפו והאזנו את השרף על ידי הוספת one milliliter של wash buffer והפכו את המבחנה מלמעלה למטה עד שהשרף יתערבב מחדש. לאחר סבב של דקה אחת ב-5,000 RPM וב-four degrees Celsius, שאבו את הנוזל העליון. כדי לקשור חלבון לניקוי זיקה (affinity purification), הוסיפו 100 עד 200 microliters של lysate צלול לחרוזי השטיפה והשתמשו ב-lysis buffer כדי להביא את הנפח הכולל ל-one milliliter.

הדגירה תתבצע עם מוטציה או בערבול (rocking) בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים עד חמש שעות. השתמשו בחנקן נוזלי להקפאה מהירה (snap freeze) של מנות מה-WCE הצלול שנותר, ואחסנו בטמפרטורה של 80 °C- עד לשימוש נוסף, בעוד שתמיסת הליסאט מהסלק מדגגרת על קרח עבור דגימת ה-Western blot של ה-WCE. לאחר סבב צנטריפוגה של שתי דקות וחצי במהירות של 15,000 RPM בטמפרטורה של 4 °C, שפכו את הנוזל העליון (supernatant) תוך הקפדה על שימור המשקע (pellet), הוסיפו למשקע 800 µL של 2% TCA וערבבו בורטקס (vortex) את המבחנה לפני חזרה על סבב הצנטריפוגה של שתי הדקות וחצי.

לאחר דקנטציה זהירה של העלייה, הוסף 100 µL של TCA sample buffer וערבב במכשיר vortex כדי להמיס את המשקע לפני הדגראציה של הדגימה. בבלוק חימום בטמפרטורה של 100 °C למשך שתיים עד חמש דקות, בצע את הפעולה שניתם כדי להמיס לחלוטין שאריות של המשקע, שעלולות להיות קשות להמסה, ואחסן בטמפרטורה של 80°C- עד למועד השימוש. לאחר דגראציה של דגימת ה-lysate bead, וספינטציה במהירות של 5,000 RPM ובטמפרטורה של 4 °C למשך דקה אחת, השתמש ב-wash buffer כדי לשטוף את השרף חמש פעמים לצורך אלוציה של החלבונים.

הוסיפו 150 µL של בופר אלואוציה (elution buffer) לשרף, דגרו בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. צנטריפוגו למשך דקה אחת ב-5,000 RPM ובטמפרטורה של 4 °C ושמרו את העל-נוזל (supernatant) במבחנה חדשה. לבסוף, כדי להכין דגימה ל-western blot, הוסיפו 25 µL של בופר דגימה 2x lithium dodecyl sulfate עם 2 µL של BME ל-25 µL של דגימת חלבון UD.

כפי שמוצג בדמות זו, ניתן להוציא באופן הדיר חלבונים במגוון רחב מתאי שמרים. פסים נפרדים בטווח של משקלים מולקולריים מעידים על תמציות חלבון באיכות גבוהה. ניתן לאשר את איכות התמציות באמצעות western blotting עבור חלבונים עם תג epitope ספציפי.

כאן מוצגת תוצאה מייצגת עבור ה-Sumo Ligase עם חמישה תגים בעל ביטוי יתר של גალაქטוז, אשר רץ בערך ב-120 kilodaltons. בדרך כלל, חלבונים שעברו פירוק חלקי יופיעו כפרגמנטים מרובים מתחת למשקל הצפוי, אך כאן נצפה רק החלבון באורכו המלא. בנוסף, תסמיכים בעלי משקל מולקולרי גבוה של חלבון נתון עשויים להעיד על מודיפיקציות לאחר תרגום.

לדוגמה, ניתן לראות כאן ביטוי יתר של lactose sumo related S one delta four 40 ו-SIS one באורכו המלא. כפי שהודגם ב-Western blot זה, ניתן לשמר מודיפיקציות גם על S one המבוטא באופן אנדוגני. איור זה מראה כי שני חלבונים המועשרים בגרעין, SLX five ו-CS one delta four 40, טוהרו בהצלחה מה-ws שלנו.

באופן בולט, ניתן לטהר בזיקה חלבון המסומן בתג 6-histidine מ-W'S, הן בתנאים טבעיים (native) והן בתנאי דנטורציה. לעומת זאת, SLX 5G ST ו-CS one delta four 40 ha חסרים epitope של 6-histidine, אך בתנאים טבעיים הם עדיין מקיימים אינטראקציה עם שרף זיקת המתכת באופן הרגיש ל-ole. אנו מציעים כי CIS one, ובמידה פחותה SLX five, מסוגלים להיקשר לשרף זיקת המתכת באמצעות דומיין טבעת תיאום המתכות שלהם.

למרות שלמיטב ידיעתנו, תופעה ספציפית זו טרם דווחה, תואר מצב דומה שבו תת-יחידה B של רעל הכלרה נקשרת לשרף זיקה של Nicola באופן המתווך על ידי שאריות היסטמידין טבעיות שלה. תצפית זו מרמזת כי חלבונים ב-WCER, לפחות בחלקם, מקופלים באופן טבעי לצורך חקר תפקוד חלבונים. חשוב להראות שקומפלקסים של חלבונים נותרים שלמים בתמריתי תאים שלמים.

נתונים מייצגים גילו כי CS one delta four 40 SLX five, ו-P GK one, חלבון ציטוזולי המשמש כבקרת טעינה, היו נוכחים ב-WS cis one. Delta four 40 בודד מתמריות אלו על בסיס יכולתו המולדת להיקשר לשרפים בעלי זיקה למתכת. בנוסף, כאשר SLX five ו-SIS one בועו ביטוי משותף בתאי שמרים, רמות ה-SLX five ב-EITs עלו, דבר שמעלה את האפשרות ש-SLX five עשוי להקיים אינטראקציה עם SIS one.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן גידול ועיבוד תאי שמרים במטרה להפיק, לטהר ולהדגים חלבוני שמרים תחת תנאים טבעיים (native conditions).