ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

פרוטוקול זה משתמש במקדם הניתן לוויסות המאפשר ביטוי חלבון מבוקר. בניסוי זה, אנו משתמשים בפלסמיד עותק גבוה של שני מיקרון המבטא את תחום ה-N שניים ממקדם מתיונין הניתן לדיכוי. תאי שמרים מסוג בר הופכים עם זה.

פלסמיד וטרנספורמנטים נבחרים על צלחות חסרות uol. לאחר צמיחה בן לילה. במדיה סלקטיבית תאים מסונכרנים על ידי צמיחה ללא קורטיזול. מעצר.

לבסוף, ולביטוי מושרה על ידי העברת תאים למדיה חסרת מתיונין במהלך ניסוי מהלך הזמן. ריכוז החלבון מנוטר על ידי כתמים מערביים והתפתחות פנוטיפ מורפולוגי על ידי מיקרוסקופיה. היי, אני קלאודיה במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת פרדו.

אני דה בארי מוג'י באלאר ואני וגם במעבדת AL. היום אנו הולכים להראות לכם נוהל לניתוח התפתחות פנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז החלבון באינדוקציה בגוף. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ההיבטים המורפולוגיים והמולקולריים של פנוטיפ חלוקת תאים שנצפה בביטוי יתר של תחום N 2 של החלבון האדפטיבי האנדוציטי בהיעדר שניים.

אז בואו נתחיל. פרוטוקול זה מתחיל בבנייה של זן שמרים שיבטא את החלבון המעניין שלך. במקרה שלנו, הפכנו את זן השמרים מסוג הבר W 3 0 3 עם DNA פלזמה בעל עותק גבוה המכיל nth two תחת שליטת מקדם המתיונין הניתן לדיכוי שני מדכאי מתיונין מילי-מולרי פגש 25 פעילות מקדם.

בעוד שמדיה חסרה מתיונין מאפשרת ביטוי מקסימלי, בחר שש מושבות מצלחת המכילה תאים שעברו טרנספורמציה לאחרונה וחסן ב-50 מיליליטר של חומר סלקטיבי עם 0.2 מילי-מולרי מתיונין בבקבוק חרוטי דגירה למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד למחרת בבוקר. הערכת צפיפות התא על ידי מדידת הצפיפות האופטית של התרבית ב-600 ננומטר. מעבירים את המקבילה ל-20 OD 600 ננומטר למיליליטר תאים לצינור צנטריפוגה סטרילי וקוצרים על ידי צנטריפוגה.

השעו מחדש את התאים במדיום YPD על ידי מערבולת כדי לסנכרן את מחזור התא לריכוז סופי של 15 מיקרוגרם למיליליטר ממלאי של מיליגרם אחד למיליליטר ב-DMSO. דגירה במשך ארבע שעות ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד. לאחר ארבע שעות, בדוק את אחוז התאים שנעצרו במיטוזה.

על ידי צפייה במיקרוסקופ וספירת מספר התאים עם ניצנים בגודל שווה המשך לשלב הבא. רק אם המעצר גדול מ-90%קצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב-2200 סל"ד למשך חמש דקות. לאחר שלוש שטיפות במים קרים כקרח, החייאה, השעו את הגלולה במדיה סלקטיבית חסרת מתיונין בצפיפות תאים של כ-0.5 OD 600 ננומטר למיליליטר.

העבירו מחצית מנפח התאים לצינור סטרילי חדש והוסיפו מתיונין לריכוז סופי של 0.2 מילימולר. זה ישמש כבקרה על ההשפעות הנובעות מרמות בסיסיות של ביטוי חלבון. החזר את שתי התרבויות לחממה של 30 מעלות צלזיוס.

תאים מנותחים להתפתחות פנוטיפ כל שעה במשך שש שעות בכל פעם. העברה נקודתית של מיליליטר אחד של תרחיף תאים של כל תרבית לצינור מיקרו-פוגה סטרילי וקוצרת את התאים על ידי צנטריפוגה, שאיבת הסופרנטנט והשעיית הגלולה מחדש ב-70 מיקרוליטר מדיה. לאחר מכן הוסף 30 מיקרוליטר מתילן כחול ממלאי של מיליגרם אחד למיליליטר במים סטריליים.

לאחר מכן, פיפטה כשישה מיקרוליטר מהמתלה הזה על מגלשת זכוכית נקייה והנח החלקת כיסוי מעל הטיפה. לחץ בעדינות על החלקת הכיסוי ליצירת שכבה דקה ואחידה של תאים בין ממשקי הזכוכית. חלק את תלוש הכיסוי לתשעה רבעים וצלם שלוש תמונות לכל רבע.

מספר התאים לשדה לא צריך להיות גדול מ-30 תאים כדי לאפשר כימות מדויק. ספרו את מספר התאים המציגים את הפנוטיפ הנחקר, שבדוגמה זו הם תאי שמרים ניצנים עם ניצנים מוארכים או משורשרים שאינם מצליחים להיפרד זה מזה. אנו סופרים גם את מספר התאים המתים שזוהו על ידי צבעם הכחול מאז הפגם בחלוקת התא שנגרם ב-nth.

שני ביטויי יתר מובילים למוות של תאים כדי לדמיין פגמים ספציפיים לפנוטיפ בכל פעם. יש להצביע על מיליליטר אחד של תרבית בצינור מיקרו פוגה סטרילי ולקצור תאים על ידי צנטריפוגה ראוס. השעו את גלולת התא ב -100 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר, תמיסה לבנה קלורית במים סטריליים ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

צביעה בלבן סידן מאפשרת הדמיה של דופן התא האלקטרוני. שטפו את הגלולה שלוש פעמים עם XPBS אחד. אנו משעים את הגלולה הסופית ב -100 מיקרוליטר PBS.

התבונן בתאים תחת המיקרוסקופ ורכוש תמונות בהגדלה של פי 100 באמצעות אופטיקת UV להמחשת דופן התא. כדי לדמיין תמונות של רכישת ספטין מתויג GFP באמצעות מסנן FS E, כמת את אחוז התאים עם פגמים בדופן התא ולוקליזציה של ספטין מיס באמצעות השיטה שהוצגה קודם לכן על ידי חלוקת החלקת הכיסוי לתשעה רבעים וצילום שלוש תמונות לכל רבע לספירת וידאו TimeLapse. מיקרוסקופיה של תאי שמרים בודדים דורשת מיטות אגרוס משובצות במדיה כדי ליצור מצע אגרוס.

ראשית נקו מגלשת זכוכית עם שקע קעור עם 70% אלכוהול והניחו לה להתייבש באוויר בזמן שהמגלשה מתייבשת באוויר. מרתיחים 0.06 גרם אגרוס בחמישה מיליליטר של מדיה סלקטיבית חסרת מתיונין במיקרוגל עד שהאגרוס מתמוסס לחלוטין במהירות. פיפטה 200 מיקרוליטר של האגרוס המכיל מדיה בשקופית.

שקע והיפוך מגלשת זכוכית נקייה נוספת מעליו, וודא שלא נלכדות בועות אוויר מתחתיו. כאשר הג'ל מתמצק, הזיזו את המגלשה למעלה בצורה חלקה הרחק ממגלשת השקע, תוך שמירה על משטחיהם מקבילים בכל עת. זה מבטיח שפני השטח של מיטת האגרוס סומק עם פני השטח של מגלשת השקע.

נקה את אזור המגלשה המקיף את מיטת האגרוס ברקמה עדינה. המגלשה מוכנה כעת לשימוש בזמן השווה לארבע שעות. מעבירים מיליליטר אחד של תאים מהתרבית לצינור מיקרו פוגה סטרילי וקוצרים על ידי צנטריפוגה.

שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מדיה סלקטיבית טרייה חסרת מתיונין. מרחו ג'לי נפט על שולי החלקת הכיסוי. לאחר מכן הניחו טיפת תרחיף תאים במרכז מצע האגרוס ומורחים באופן אחיד על ידי לחיצה עדינה על החלקת כיסוי מעליה.

אטום את שולי החלקת הכיסוי ותקן את מיקומו על ידי ריפוד הקצוות בלק. לאחר שהלק יבש, הניחו את השקף על במה מחוממת של מיקרוסקופ. אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss Axio 200M המצויד במצלמה דיגיטלית מונוכרום של Zeiss Axio camm, MRM כדי לבחור שדה המכיל לא יותר מ-10 תאים במרווחים מספיקים מכיוון שהשדה יהיה צפוף עם הזמן.

כאשר התאים מתחלקים, צלמו תמונה של השדה כל חמש דקות במשך כחמש שעות. על מנת להימנע מהתאמת המיקוד שוב ושוב. אנו מתכנתים את תוכנת רכישת התמונות כך שתרכוש אוטומטית כמה תמונות Zack בכל נקודת זמן.

התמונה עם המיקוד הטוב ביותר תיבחר מאוחר יותר להרכבת הסרט על מנת להבטיח חום הולם לתאים, ניתן ללמוד מקור חום חיצוני בנוסף לשלבים המחוממים המסופקים על ידי השארת האור הלבן המועבר של המיקרוסקופ דולק למשך כל משך ההדמיה רגרסיה פנוטיפית על ידי הרכבת התמונות לסרט באמצעות תוכנת Image J. כאן אנו מראים תוצאות מייצגות של ביטוי יתר של החלבון המעניין שלנו. השני.

ראשית, ביטוי החלבון של n שתיים. במהלך הזמן של הניסוי נקבע, ליזטים מתאים המבטאים HA nth שניים נותחו על ידי Western Blotting באמצעות נוגדן חד שבטי נגד HA כפי שמוצג על ידי תאי הכתם החיסוני הגדלים בנוכחות 0.2 מילי-מולרי מתיונין הם בעלי ביטוי חלבון מינימלי. עם זאת, תאים שגדלו במצע חסר מתיונין מראים עלייה עקבית בריכוז S 2 במהלך הניסוי.

לאחר מכן, נותחו תאים שגדלו בנוכחות או בהיעדר מתיונין במשך שש שעות, מכיוון שריכוז נמוך של n, 2 אינו מסוגל לגרום לפנוטיפ של חלוקת תאים או מוות תאים בלבד. אחוז נמוך של תאים מתים כפי שמעיד צבעם הכחול לאחר צביעה בכחול מתילן. כמו כן, מספר הגרעינים לתא, דופן התא וארגון המחיצה תקינים כצפוי.

לעומת זאת, ביטוי יתר של M 2 מוביל לפגם מסיבי בחלוקת התאים ולמוות תאים, כפי שמודגם על ידי שרשראות ארוכות של ניצנים מוארכים מחוברים השומרים על הצבע הכחול כאשר הם מוכתמים בכחול מתילן. רוב התאים הפנוטיפיים הם מרובי גרעינים כפי שמצוין על ידי צביעת DPI. צביעה לבנה של קלציור מדגימה הצטברות של כתמי דופן התא החריגים.

בנוסף, ספטין הוא לא מאורגן ולא מאורגן. כימות הפנוטיפ כפונקציה של זמן מוצג בגרף זה כאשר העיגולים הפתוחים מייצגים אפס מתיונין מילי-מולרי והעיגולים הסגורים מייצגים 0.2 מילי-מולארי מתיונין. אנו רואים כאן שככל שריכוז n שני מצטבר בתאים לאורך זמן, אחוז התאים המציגים את פנוטיפ חלוקת התא עולה גם הוא.

תאי ביקורת שגדלו ב-0.2. מילי מתיונין מראה כי התפתחות פנוטיפ היא פונקציה של ריכוז חלבון מוגבר ולא בגלל תנאי תרבית תאים. לבסוף, התפתחות פנוטיפ בביטוי יתר של שניים נלכדת על ידי מיקרוסקופ וידאו דולג זמן.

לאחר ארבע שעות של n, שני תאי ביטוי יתר מראים פנוטיפ חלוקת תאים מורפולוגי קל. ככל שהסרט מתקדם, אנו רואים תקופות חריגות וממושכות של צמיחת ניצנים אפיקליים, המולידים ניצנים מוארכים מאוד. אנו רואים גם אירועים של הופעת ניצנים חדשים לפני שהתרחש אירוע היפרדות תאים.

בנוסף, נצפים ניצנים מגיחים מכמה אזורים בתא האם ויוצרים ענף למראה. זה עתה הראינו לכם כיצד לאפיין ולנתח את התפתחות הפנוטיפ המורפולוגי כפונקציה של ריכוז החלבון ברשימת הניצנים. על ידי ביצוע הליך זה, חשוב לזכור ללטף את התאים במהירויות הצנטריפוגה המומלצות מכיוון שמהירויות גבוהות יותר עלולות לפגוע בתאים.

חשוב גם לזכור להוסיף מתילן כחול וכלוריד ממש לפני ההדמיה מכיוון שהם רעילים לתאי מזרח בהירים. אז תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.