בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את הפעילות הפרוטאוליטית של נוירוטוקסין בוטולינום במטריצות מורכבות כגון דגימות תרופות, סביבה ומזון. זה מושג על ידי בדיקת עיבוד ראשונה ודגימות עקומה סטנדרטיות במידת הצורך, כדי לקבוע תנאי pH וצמיגות מתאימים. לאחר מכן, הנוירוטוקסין של הבוטולינום מוזרז חיסוני מהדגימות באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים.

לאחר מכן החרוזים המגנטיים נשטפים ביסודיות כדי להסיר תרכובות מפריעות ומועים מחדש במאגר תגובה אופטימלי. לבסוף, החרוזים השטופים מודגרים עם מדווח חלבון ומודדים ספקטרוסקופית את המחשוף של המדווח לאורך זמן. בסופו של דבר, השוואה של מחשוף המדווח בדגימות הבדיקה לעומת דגימות העקומה הסטנדרטית משמשת לכימות הפעילות של רעלן הבוטולינום בדגימות הבדיקה עם רגישות ביולוגית של עכבר לעכבר הקרוב.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות אחרות כגון עכבר, בדיקה ביולוגית, אימונולוגית ושיטות פלואורסצנטיות אחרות הם שבדיקה זו אינה דורשת שימוש בבעלי חיים והוכחה לשימוש במטריצות מורכבות ביותר הנמצאות בדגימות מזון, סביבה ותרופות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שנדרש עיבוד ודילול דגימה זהירים. מי שידגים את ההליך הזה יהיה ד"ר מארק דאנינג, מדען ב-Bio Sentinel.

הכן מאגרים לפי פרוטוקול הטקסט כדי ליצור עקומה סטנדרטית לכימות דגימות בדיקה, שקול 10 פלוס מינוס 0.01 גרם של דגימת מזון מוצק לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר והניח בצד דגימה זו תשמש כמדלל בצינור שני שוקל שני פלוס מינוס 0.01 גרם של דגימת מזון מוצק. הוסף בוטולינום נוירוטוקסין או נקנה על פני דגימת המזון של שני גרם לריכוז סופי של 30,000 MLD 50 לגרם מזון. דגרו את הדגימות המדללות והדוקרניות בטמפרטורת החדר או ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לתת לבוט זמן לקיים אינטראקציה עם מטריצת המזון.

חיקוי זיהום טבעי, עיין בפרוטוקול הטקסט לסוגי דגימות נוספים. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של GPB לגרם מזון לדגימות הדוקרניות והלא דוקרניות, והשתמש בעלי כדי להומוגני עד לקבלת תערובת יסודית. אקסטרפולציה של הנפח הכולל של הבוט של שני גרם דגימה דוקרנית מהנפח הכולל המשוער של דגימת הדילול של 10 גרם.

לאחר מכן הוסף נפח עשירי של מאגר נטרול פי 10 לדגימת הדילול של 10 גרם ושני גרם קנו דגימה דוקרנית על סמך הנפחים הכוללים שלהם. דגימות מעורבות היטב על ידי היפוך, מבהירות חלקית את שתי הדגימות על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בכוח הכבידה פי 6,000 וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר מיד את הסופרנטנטים והעביר לצינורות חדשים באמצעות הבוט דגימה דוקרנית כ-D אחת והדגימה הלא-דוקרנית כמדלל מייצרת את דגימות העקומה הסטנדרטיות הנותרות בצינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

להכנת דגימות מזון מוצק התחל בשקילת שני פלוס מינוס 0.01 גרם של דגימה מוצקה לא ידועה לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. הוסף שני מיליליטר GPB והשתמש בעלי כדי להומוגניזציה של הדגימה. לאחר מכן, הוסף עשירית מהנפח של מאגר נטרול פי 10 לדגימה וערבב היטב על ידי היפוך לאחר הבהרה חלקית של הדגימה על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בכוח הכבידה פי 6, 000 וארבע מעלות צלזיוס העבירו מיד לפחות 750 מיקרוליטר של סופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה.

זהו דילול לא ידוע אחד. הוסף 675 מיקרוליטר של המדלל לשני צינורות המסומנים דילול לא ידוע שתיים ושלוש. המדלל יהיה אותו חומר מעובד המשמש ליצירת עקומה סטנדרטית.

השתמש בדילול אחד כדי לבצע דילול סדרתי על ידי העברת 75 מיקרוליטר של דילול אחד לתוך צינור הדילול השני וערבוב. לאחר מכן מעבירים 75 מיקרוליטר דילול שניים לצינור הדילול השלישי ומערבבים. כדי להבהיר את הדגימות, צנטריפוגה אותן למשך חמש דקות לפחות 14,000 פעמים. משיכה.

הסר מיד את הסופרנטנטים והעביר לצינורות חדשים כדי להקים צלחת לדגימות, הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר מחייב פי 10 לכל באר כל דגימה לא ידועה והדגימות המעוקלות הסטנדרטיות D אחת עד D שמונה דורשות שלוש בארות ודגימה D תשע דורשת שש בארות. הוסף 200 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות המתאימות והשתמש במיקסר מיקרופלייט כדי לערבב את הצלחת למשך 10 שניות. מערבולת את חרוזי ה-IPA למשך 10 שניות במהירות הגבוהה ביותר או עד להשעיה מלאה.

לאחר מכן פיפטה 20 מיקרוליטר מהחרוזים לכל דגימה היטב ומערבבים את הצלחת למשך 30 שניות. דגרו את הצלחת בחממת צלחות מסתובבת למשך שעתיים ב-750 סל"ד ו-25 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר כדי לשטוף את הצלחת באמצעות מכונת כביסה אוטומטית. לאחר הפעלת תוכנית הפריים, הנח את הצלחת על לוחית הפרדת החרוזים המגנטית 96 באר על מכונת הכביסה של הצלחות.

לאחר מכן הפעל את תוכנית הכביסה הראשית. בסיום התוכנית, הסר את הצלחת ממכונת הכביסה. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר תגובה אחד x לכל דגימה היטב וערבב במשך 30 שניות.

כדי להתחיל את בדיקת מטריצת הבוט, הוסף 50 מיקרוליטר של מדווח AE של 0.5 מיקרומולרי. לכל באר דגימה כדי למנוע השפעות קצה, הוסף 100 מיקרוליטר מים לכל באר שאינה בשימוש. ובכן השתמש בסרט תקרה כדי לאטום את הצלחת, להגן עליה מפני אור ולדגור אותה ב -750 סל"ד ו -25 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר.

בכל זמן קריאה, הסר את הצלחת מהחממה. הסר את סרט התקרה, והנח מיד את הצלחת על צלחת הפרדת החרוזים המגנטית 96 באר, אפשר לחרוזים להיפרד למשך שתי דקות. הנח את הצלחת בקורא המיקרו-פלטות ומדוד את הפליטות בכ-470 וכ-526 ננומטר תחת עירור בכ-434 ננומטר.

אם רוצים זמני קריאה נוספים, לאחר החייאת החרוזים למשך 30 שניות על מערבל המיקרופלייט, אטמו מחדש את הצלחת והחזירו אותה לחממה. מוצגות כאן תוצאות בדיקה באמצעות בוט הולו טואין שהוכנס ל-PBS ונבדק לאחר דגירה של שעתיים, ארבע ו-24 שעות עם מדווח AE. מחשוף של המדווח על ידי בוט נמדד כהפחתה ביחס הפליטה שנמדד על ידי קורא הלוחות שלנו כ-2.7 עבור המדווח השלם לכ-0.7 עבור המדווח השסוע במלואו.

ערכים ספציפיים יהיו שונים בין קוראי הלוחות כפי שניתן לראות על ידי ההסטה שמאלה בעקומה, זמן הדגירה הממושך עם המדווח מביא למחשוף מדווח מוגבר. נקודות הנתונים שנבדקו בטריפליקט מציגות סטיית תקן נמוכה של הממוצע ועוקבות אחר המגמה הצפויה של עלייה ביחס הפליטה עם ירידה בעומס הרעלנים. כישלון הבדיקה לעקוב אחר מגמה צפויה זו עשוי להצביע על שגיאה במהלך יצירת דילול או נתונים המתווים את יחסי הפליטה של הפקדים שאינם מכילים בוט A נשארים יציבים גם במהלך הדגירה, מה שמצביע על היעדר פעילות פרוטאז לא ספציפית.

איור זה מדגים את המתודולוגיה הכללית המשמשת לאיתור או לכימות של כל דגימה לא ידועה כנגד עקומה סטנדרטית ומכמת דגימות בוט תרופות. עקומה סטנדרטית נוצרה ב-PBS עם בוט מטוהר, הולו טואין ועובדה במקביל לדילול של מוצר תרופה שנוצר מבקבוקון יחיד של 100 יחידות של בוטוקס ליופילי מיובש ב-0.9% מלח בבדיקה זו, החלק הליניארי של העקומה הסטנדרטית נופל בין יחס פליטה של 2.11 ל-1.05, ומסומן על ידי התיבה המקווקו באיור. הריכוזים של שלושת הבלתי ידועים הנופלים בתחום ליניארי זה הועברו לאחר מכן מהעקומה הסטנדרטית.

בניסוי זה, עגבניות טריות וחלב 2% שימשו כמטריצות מזון מוצקות ונוזליות ושובצו ב-bot קומפלקס המורכב מחלבוני הליבה הקשורים להולו, טואין ונוירוטוקסין. שילוב זה נבחר מכיוון שהוא דומה לרעלן המיוצר במהלך זיהום קלוסטרידיום טבעי כפי שמוצג כאן. התאוששות של בוט A נצפית בשתי המטריצות.

יתר על כן, זמן הדגירה המוגבר עם המדווח מגדיל את רגישות הבדיקה אך אינו מביא לירידה בשיעורי הפליטה עבור בקרות ללא רעלים המציינות את תוצאות המחשוף שנצפו מבוט A ולא פרוטאז לא ספציפי שהועבר מהמזון בבדיקה. הבוט A-L-O-D-L-O-Q ו-EC 50 עבור שני המזונות בכל נקודת זמן מוצגת מסוכמים בטבלה זו. ה-LOD וה-LOQ מוגדרים כמדגם הריכוז הנמוך ביותר עם יחס פליטה נמוך מ-3 ו-10 סטיות תקן מתחת לרקע בהתאמה.

צפויה שונות מסוימת בין מטריצה למטריצה ב-LOD ו-LOQ מכיוון שהשפעות מטריצה עשויות להשפיע על קשירת הרעלן לחרוזים ועל התאוששות החרוזים במהלך הכביסה. בעוד שנראה כי הייתה יותר התאוששות רעלנים מחלב 2% מאשר עגבניות מהנתונים, חלק גדול מההבדל הזה נובע מהדילול הנוסף הנדרש להומוגניזציה של דגימות עגבניות ב-GPB. בנוסף להיותן מטריצת מזון מוצק, עגבניות הן סוג מדגם ראוי לציון שבו התאמת pH וחוזק יוני היא קריטית להצלחת הבדיקה.

איור זה ממחיש את תגובות הבדיקה בעת בדיקת עגבניות עם או בלי הכללה של מאגר נטרול פי 10. אי הוספת המאגר גורמת להתאוששות לקויה של בוט A מדגימות ומודגמת על ידי יחס פליטה קבוע בכל ריכוזי הבוט A שנבדקו תוספת של מאגר נטרול פי 10, עם זאת, מביאה לזיהוי רעלנים רגישים, פרוטאזות לא ספציפיות עשויות להיות אנדוגניות לדגימת המזון או מוכנסות בעת שימוש בתכשירי בוט לא מטוהרים כגון תרבית קלוסטרידיום, סופרנטנטים, ועלולים לבקע את מדווח ה-AE ולהוביל לתוצאות חיוביות כוזבות. דוגמה זו מדגימה פעילות פרוטאז לא ספציפית שנמצאה בבוט Clostridium, תרבית סופרנטנטים המשתמשים במדווח שונה שכבר אינו נחתך על ידי בוט A. הרמות הגבוהות של מחשוף המדווח מצביעות על התרבות.

סופרנטנט מכיל פעילות פרוטאז משמעותית, אשר נשללת למעשה על ידי תוספת של מעכבי פרוטאז. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו בין ארבע ל-26 שעות זמן בדיקה כולל, תלוי בסוג הדגימה ובעומס הרעלן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולכמת נוירוטוקסין בוטולינום מדגימות מורכבות באמצעות משקעים חיסוניים במערכת דיווח חלבון מבוססת פלואורסצנטי.

אל תשכח שעבודה עם נוירוטוקסינים של בוטולינום עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להשתמש באמצעי זהירות כגון כפפות, קודי מעבדה וארונות בטיחות כימיים וביולוגיים בעת ביצוע הליך זה.