Name: בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: חקור שיטה לבידוד וכימות טוקסין עצבי בוטולינום ממטריצות מורכבות כגון מזון ותרופות באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים ומדידה ספקטרוסקופית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לח&#39; Olivares וד &#39;רוגה לדיונים ועצות רבי ערך. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי הפרס NSF SBIR (IIP-1,127,245 לBioSentinel Inc) וחוזה של משרד ההגנה (W81XWH-07-2-0,045 לBioSentinel Inc).

FM דאנינג, TM פיאצה, פ Zeytin, ומקלחת טאקר הם עובדים או בעלי BioSentinel בע&quot;מ BioSentinel כיום מייצר ויש ממוסחרים חלק מהחומרים הכימיים שהוצגו בדוח זה.

פרוטוקול זה מתאר הליכים לכימות ונט / holotoxin, או supernatant מורכבים, Clostridium תרבות מטריצות מורכבות. הפרוטוקול הוא זהה, עם זאת, כאשר בודקים קפסיד אחרים ונט (למשל ונט / B, E, ו-F) עם מבחני מטריקס 56,60, למרות רגישות assay תשתנה פני קפסיד ומבחנים. פרוטוקול זה אינו לוקח בחשבון כל סוג של מדגם אפשרי וכמה שינויים שיידרשו בהתאם להרכב מדגם המסוים ויישום רצוי. מטריצות יכולות לכלול דגימות מזון (למשל בדיקת אתגר מזון) או מאגרי חומר לא פעילי תרופות (...

neurotoxins טוקסין (BoNTs) הם החומרים הקטלניים ידועים, עם מינונים קטלניים אנושיים תוך ורידי מוערכים ב 1-3 ננוגרם / ק&quot;ג 1,2. שבעה קפסיד דומים מבחינה מבנית של ונט, שכותרתו דרך G, קיימים, כל אחת בהיקף של תחום שרשרת כבד אחראי על תא מחייב, ספיגה, וטרנסלוקציה לתוך cytosol ושרשרת אור שמקודד endopeptidase אבץ 3-5. הרעילות המעודנת של ונט נובעת מ, בין שאר, את כניסתה הספציפית מחייבת ולתוך הנוירונים מוטוריים בצומת neuromuscular 6. פעם בתוך תא העצב, endopeptidase שרשרת אור במיוחד דבק אחד או יותר של N-ethylmaleimide רגיש קולטן מסיס החלבון מצורף גורם (המוקשת) החלבונים דרושים לאיחוי שלפוחית, עיכוב שחרור הנוירוטרנסמיטר ומוביל לשיתוק רפה 7-14. ידוע בכינויו מחלת &quot;בוטוליזם&quot;, שיתוק של שרירי סרעפת וצלעי בסופו של דבר התוצאות בונטכשל נשימתי ומוות, אלא אם כן אבחון וטיפול מוקדמים שקיבלו. בוטוליזם במזון אדם מזוהה לרוב עם ונט קפסיד A, B, E ו-F (בונט /, ונט / B, וכו &#39;) ובדרך כלל תוצאה של הבליעה של מזון מזוהם 15,16, אם כי, כמה מקרים של בוטוליזם פצע דווחו בקרב משתמשים בסמים תוך ורידי 17,18. בארצות הברית, בוטוליזם התינוק כתוצאה מהבליעה של נבגי Clostridium על ידי ילדים מתחת לגיל השנה הוא הצורה הנפוצה ביותר של בוטוליזם 19-21. עם זאת, התפרצויות ונט במזון כתוצאה משימורים הביתה פסולים ועיבוד מזון דווחו הן בארצות הברית והן בחו&quot;ל. בין 2000-2009, לפחות 338 מקרים של בוטוליזם במזון דווחו ברחבי העולם ובם שישה הרוגים 22. היכולת במהירות וברגישות כדי לזהות התפרצויות של בוטוליזם במזון היא אינדיקציה קריטית שיכול לסייע לאבחון מוקדם 23,24. יתר על כן, שיטות זיהוי המאפשרות יעיל וחסכוני ובדיקת מזון שגרתית יובילו לביטחון תזונתי משופר. הספציפיות עצביות של ונט ומחצית חיים ביולוגיים ארוכים גם עושה את זה טיפולי רב עוצמה. בארצות הברית, תרופות המבוססות על ונט אושרו על ידי מנהל המזון והתרופות אמריקניות לטיפול בבעיות קוסמטיות והפרעות הקשורות לתוקפת כולל קווי glabellar, דיסטוניה צוואר הרחם, מיגרנה, פעילות יתר של שלפוחית, ופזילה. יישומים &quot;מותווים&quot; רבים מתועדים, כוללים טיפולים במינון גבוה לתפקוד שרירים חמור 25-28. כימות הרעלן מדויקת היא קריטית למינון נכון, כמו underdosing עשויה להוביל לטיפול לא יעיל ואילו מינון היתר מעמיד אותם בסיכון לתופעות לוואי שעלול להזיק לחולים. למרבה הצער, אין פרוטוקול assay העוצמה סטנדרטי משותף בין יצרנים, וכתוצאה מכך אי שוויון הגדרת יחידה בין produ תרופה מבוססת ונטCTS 29-31. הבדיקה סטנדרטית לונט היא מבדק העכבר שבי דגימות ונט המכילה מוזרקות intraperitoneally לעכברים ואת מספר מקרי המוות שנרשם על 1-7 ימים 16,32,33. מבדק העכבר רגיש מאוד עם מגבלות של זיהוי (לוד) של 5-10 pg ונט / 34, עם זאת, חששות אתיים על שימוש בבעלי חיים, את העלות הגבוהה של אנשי הדרכה ותחזוקה של מתקנים לבעלי חיים, פעמים assay ארוכות, וחוסר פרוטוקולים סטנדרטיים הביאו לשיחות לפיתוח, בדיקה סטנדרטית ללא בעלי חיים בונט ושיטות כימות 35-39. לאחרונה, במספר שיטות כימות ונט החלופית פותחו המציעים עכבר או רגישות מבדק ליד העכבר 40-49. שיטות אלו נפוצות שימוש בקרינה, ספקטרומטר מסה, או שיטות החיסוניות ומציעות פעמים assay קצרות משמעותי ממבדק העכבר ללא שימוש בבעלי חיים. ספקטרומטר מסת גישות בשילוב עם techniq החיסוניUES הוצג כדי לזהות ולכמת ונט הכלולות מזון ודגימות מורכבות אחרות, עם זאת, דרישות הכשרת כוח אדם ומגבלת ציוד מיוחד מבחני אלה 50-55. רוב מבחני חלופיים האחרים אינם בקלות החלים על בדיקת מדגם מורכבת או חוסר התפוקה הנדרשת לבדיקה שגרתית בונט. הטבע משתנה מאוד של צמיגות מדגם מזון, pH, תוכן מלח, ומרכיבים מטריצה ​​מציג אתגר קשה במיוחד כאשר מנסה לפתח שיטות assay במבחנה עם רגישות כדי להתאים את העוצמה הקיצונית של ונט. יתר על כן, אפילו מערכות חיץ פשוטות וסבירות יחסית, כגון אלה הנובעים מresuspension של מוצרים תרופתיים המבוססים על ונט, מכילות מלח, אלבומין, וסוכר מייצבים (כלומר חומרים בלתי פעיל) המשפיעים באופן משמעותי במבחנה ונט עוצמה 56. טיהור רעלן נדרש לבדיקת פעילות מדויקת של כל אבל הפשוט ביותר של דגימות 56-59. BoTest מבחני מטריקס תוכננו לתפוקה גבוהה מהירה, וכימות עקבי של ונט מדגימות מורכבות ביותר באמצעות ציוד נמצאות בדרך כלל במעבדות מחקר 56,60. מבחני אלה משתמשים בחרוזי פאראמגנטיים קוולנטית קשורים לנוגדנים נגד ונט סרוטיפ ספציפי להיקשר ולעקל ונט מתוך מדגם ולאחר מכן להסיר מפריע תרכובות מטריצה ​​על ידי שטיפה. בעקבות שטיפה, פעילות פרוטאוליטי ונט מאוגדת אז לכמת במאגר תגובה מותאמת באמצעות כתב תואם נבדק סרוטיפ ונט. כתבים אלה הם חלבוני fluorogenic המורכב מחלבון ציאן N-מסוף ניאון מחצית (CFP) ונגזר בטרמינל C-צהובה ניאון חלבון מחצית (ונוס) מקושר על ידי מצע ונט, שאריות SNAP25 141-206 או שאריות synaptobrevin 33-94 מהווים / D / עיתונאים / E או B BoTest F / G, בהתאמה 45. מחשוף כתב ידי ונט מנוטר באמצעות העברת אנרגיית התהודה פורסטר (סריג). כאשר tהוא הכתב לא נפגע, עירור של CFP תוצאות בסריג לוונוס, מרווה פליטת CFP ופליטת ונוס מרגשת. מחשוף של הכתב ידי ונט מונע סריג, מה שמוביל לעלייה בפליטת CFP וירידה בפליטת ונוס. הפעילות בונט ואז ניתן למדידת כמותית באמצעות היחס בין פליטת CFP ונוגה. לוד להלן 3 pg אפשרית ממגוון רחב של מזונות באמצעות תבנית צלחת 96 היטב תפוקה גבוהה 56. ניתן להשיג רגישות מוגברת באמצעות כרכי מדגם גדולים יותר מאז assay מאפשר ריכוז של רעלן על פני השטח חרוז. מבחני מטריקס BoTest לBoNTs A, B, E, ו-F פותחו ונבדקו עם מזון, תרופות, ודגימות סביבתיות 56,60. כאן, אנו מתארים הליכים לביצוע מבחני אלה לצורך זיהוי של ונט במורכבות נמוכה (למשל תרופות, ונט בחיץ) ומורכבות גבוהה (לדוגמא: מזון, איכות סביבה) דגימות. שיטות עיבוד ספציפיותבמשך כמה סוגי מדגם מטופלים בפרוטוקול זה וסוגי המדגם אינו מתוארים כאן בדרך כלל ניתן להתאים באמצעות שילוב של השיטות שהוצגו. הפרוטוקול שפותח ונבדק בונט / אבל להתאמה זנים אל ונט אחרות באמצעות מבחני שלהם כפי שמודגם במקומות אחרים 56,60.

<table><tbody><tr><td>BoTest Matrix A ערכת זיהוי נוירוטוקסין בוטולינום</td> ערכות זיהוי <td>BioSentinel</td><td>A1015</td><td>עבור BoNT/B ו-F זמינות גם כן.</td></tr><tr><td>קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי פלאש Varioskan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>ניתן להשתמש ברוב היחידות המבוססות על מונוכרומטור או פילטר עם עירור של 434 ננומטר ויכולת פליטה של 470 ננומטר ו-526 ננומטר.</td></tr><tr><td>צלחת הפרדת חרוזים מגנטית 96 באר</td><td>V& P Scientific</td><td>VP771H</td><td>ניתן להשתמש בלוחות מגנטיים אחרים, אך יש לתכנן את הצלחת כך שתפריד את החרוזים לצד הבאר.</td></tr><tr><td>מכונת כביסה תואמת חרוזים מגנטיים</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>אופציונלי, נדרש רק לשטיפת צלחות אוטומטית.&nbsp; ניתן להשתמש גם במכונות כביסה אחרות התואמות חרוזים מגנטיות, אך יש לבדוק אותן לפני השימוש.</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>אופציונלי, נדרש רק לדגימות הזקוקות לצנטריפוגה.</td></tr><tr><td>מערבל צלחות MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td>משמש בטמפרטורת החדר או בטמפרטורה של 25 מעלות; C אם בקרת טמפרטורה זמינה</td></tr><tr><td>טבליות מעכבות פרוטאז ללא EDTA</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>נדרשת רק לבדיקות מזון או סביבה. מעכבי פרוטאז חייבים להיות נטולי EDTA.</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>מטאביולוגיות</td><td></td><td>אופציונליות, נדרשת רק למטרות סטנדרטיזציה וכימות</td></tr><tr><td>צלחות שחורות, עם תחתית שטוחה 96 בארות</td> אין לטפל בצלחות <td>NUNC</td><td>237105</td> אין <td>לטפל בסרט</td></tr><tr><td>איטום צלחות 96 בארות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני botest

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

איתור וכימות של עצבי טוקסין (בונט) מטריצות מורכבות מדויקים הנדרש עבור תרופות, סביבתיות, ובדיקת מדגם מזון. בדיקה המהירה בונט של מוצרי מזון נחוצה במהלך זיהוי פלילי פרוץ, אבחון מטופל, ובדיקות בטיחות מזון תוך נדרשת בדיקות עוצמה מדויקות לייצור מוצרים מבוססי תרופה בונט ובטיחות מטופל. מבדק העכבר בשימוש נרחב לבדיקת ונט הוא רגיש מאוד אך חסר הדיוק ותפוקה הנדרש לבדיקה בונט מהירה ושגרתית. יתר על כן, השימוש של המבדק של בעלי חיים הביא לשיחות על ידי הרשויות הרגולטוריות מוצר תרופה ותומכי זכויות בעלי החיים בארצות הברית ובעולם כדי להחליף את מבדק העכבר לבדיקה בונט. כמה מבחני חוץ גופיית החלפה פותחו שפועלים היטב עם ונט מטוהרת במאגרים פשוט, אבל רובם לא הוכחו כרלוונטי לבדיקה במטריצות מורכבות ביותר. כאן, פרוטוקול לזיהוי שלונט במטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest מוצגת. Assay מורכב משלושה חלקים: החלק הראשון כולל הכנת הדגימות לבדיקה, החלק השני הוא צעד immunoprecipitation באמצעות חרוזים פאראמגנטיים מצופה נוגדן אנטי ונט לטהר ונט מהמטריצה, ואת החלק השלישי מכמת מפרקי החלבונים של ונט המבודדת פעילות באמצעות כתב fluorogenic. הפרוטוקול כתוב לבדיקת תפוקה גבוהה בצלחות 96 היטב באמצעות מטריצות הן נוזליים ומוצקות ודורש כ 2 שעות של הכנה ידנית עם פעמים assay כוללת של 4-26 שעות, תלוי בסוג המדגם, עומס רעלן, ורגישות רצויה. הנתונים מוצגים עבור ונט בדיקות / עם פוספט שנאגרו מלוח, מוצר תרופה, supernatant התרבות, חלב 2%, ועגבניות טריות וכוללים דיון בפרמטרים קריטיים להצלחת assay.

תרשים המסכם את השלבים בפרוטוקול המתואר מוצג באיור 2. Assay מחייב בין 4-26 שעות כדי להשלים בהתאם לסוג דגימה ורגישות assay רצוי, אבל ~ 2 שעות רק של ידיים על זמן. Assay מתבצע בצלחות 96 היטב ו, תלוי בסוג של מתבצעת בדיקה, מאפשרת בדיקה בשלושה עותקים של עד 20 דגימות לרבות תקנים לכל צלחת. תרשים 3 מראה תוצאות assay נציג באמצעות ונט / holotoxin זינק לתוך PBS ונבדק עם הפרוטוקול המתואר הבא 2...

מבחני זיהוי עצבי וטולינום BoTest מטריקס (ונט) במהירות לטהר ולכמת ונט מתוך מגוון רחב של מטריצות מדגם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיתור והכימות של ונט ממטריצות הן מוצקות ונוזליות ולהפגין assay עם בוטוקס, עגבניות, וחלב.

בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא לכמת את הפעילות הפרוטאוליטית של רעלן בוטולינום (botulinum neurotoxin) במטריצות מורכבות, כגון דגימות תרופתיות, סביבתיות ודגימות מזון. מטרה זו מושגת תחילה על ידי עיבוד דגימות הבדיקה ודגימות עקומת הסטנדרט, במידת הצורך, כדי להשיג תנאי pH וצמיגות מתאימים. לאחר מכן, רעלן הבוטולינום מופק מהדגימות באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) בעזרת חרוזי מגנט מצופים בנוגדנים.לאחר מכן, שוטפים ביסודיות את החרוזיים המגנטיים כדי להסיר תרכובים מפריעים, וסוסיפם שוב בבופר תגובה אופטימלי. לבסוף, מדגירים את החרוזיים השטופים עם חלבון מדד (reporter protein) ומודדים באופן ספקטרוסקופי את השסוע של המדד לאורך זמן. בסופו של דבר, השוואה בין שסוע המדד בדגימות הבדיקה לבין דגימות עקומת הסטנדרט משמשת לכימות הפעילות של רעל הבוטולינום בדגימות הבדיקה, ברגישות השקופה לבדיקה ביולוגית בעכברים (mouse bioassay).היתרונות המרכזיים של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון שימוש בעכברים, בדיקות ביולוגיות (bioassay), שיטות אימונולוגיות ושיטות פלואורסצנטיות אחרות, הם שבדיקה זו אינה דורשת שימוש בבעלי חיים והוכחה יעילותה בשימוש במטריצות מורכבות מאוד הנמצאות בדגימות מזון, סביבה ותרופות. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות, שכן היא דורשת עיבוד ומיהול מדויקים של הדגימה. את הפרוצדורה יעגיל ד"ר Mark Dunning, מדען ב-Bio Sentinel.הכינו תמיסות בופר בהתאם לפרוטוקול הכתוב כדי ליצור עקומת סטנדרט לכימות דגימות הבדיקה. שקלו 10 ± 0.01 גרם של דגימת מזון מוצקה אל תוך מבחנה קונוית של 50 מיליליטר והפרישו אותה; דגימה זו תשמש כמדלל. במבחנה שנייה, שקלו 2 ± 0.01 גרם של דגימת מזון מוצקה. הוסיפו רעל עצבי של בוטולינום (botulinum neurotoxin או BoNT) לפני השטח של דגימת המזון במשקל שני גרם עד לריכוז סופי של 30,000 MLD₅₀ לגרם מזון. דגרו את המדלל ואת הדגימות המועשרות בטמפרטורת החדר או ב-4°C למשך שעתיים, כדי לאפשר ל-BoNT להגיב עם מטריצת המזון.בחיקוי של זיהום טבעי, עיינו בפרוטוקול הטקסט לסוגי דגימות נוספים. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של GPB לכל גרם מזון לדגימות המועשרות ולדגימות שאינן מועשרות, והשתמשו בעק לוואי להומוגניזציה עד לקבלת תערובת אחידה. השלימו את הנפח הכולל של דגימה מועשרת במשקל שני גרם על סמך הנפח הכולל המשוער של דגימת המדלל במשקל 10 גרם.לאחר מכן, הוסיפו נפח של 1/10 ממרכז ניטרול (neutralization buffer) בריכוז 10x לדגימת המדלל במשקל 10 גרם ולדגימה המוסיפה (spiked sample) במשקל שני גרם, בהתאם לנפחים הכוללים שלהן. ערבבו את הדגימות היטב על ידי הפיכה, והבהירו חלקית את שתי הדגימות באמצעות סרטיפוגציה למשך 10 דקות ב-6,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. מיד לאחר מכן, הסירו את העילאיים והעבירו אותם למבחנות חדשות, כאשר הדגימה המוסיפה משמשת כ-D1 והדגימה שאינה מוסיפה משמשת כמדלל; הכינו את שאר דגימות עקומת הסטנדרט במבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.להכנת דגימות מזון מוצקות, התחילו בשקילה של 2 ± 0.01 גרם של דגימה מוצקה לא ידועה לתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר. הוסיפו 2 מיליליטר של GPB והשתמשו בעלי פיתה (pestle) כדי להומוגניзировать את הדגימה. לאחר מכן, הוסיפו לדגימה נפח של עשירית מהנפח של 10 x neutralization buffer וערבבו היטב על ידי היפוך. לאחר ביצוע הבהרה חלקית של הדגימה באמצעות סנטריפוגציה למשך 10 דקות ב-6,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C, העבירו מיד לפחות 750 µL מהעליון (supernatant) למבחנת מיקרו-סנטריפוגה.זהו הדילול הראשון של הדגימה הבלתי ידועה. הוסף 675 µL מהמדלל לשתי מבחנות המסומנות כדילול שני ושלישי של הדגימה הבלתי ידועה. המדלל יהיה אותו חומר מעובד ששימש ליצירת עקומת הסטנדרט.השתמשו בדילול הראשון כדי לבצע דילול סדרתי על ידי העברה של 75 µL מהדילול הראשון למבחנה של דילול שני וערבוב. לאחר מכן, העבירו 75 µL מדילול שני למבחנה של דילול שלישי וערבבו. כדי להבהיר את הדגימות, סבבו אותן בצנטריפוגה למשך חמש דקות לפחות ב-14,000 ×g.הסִירו מיד את העילאים והעבירו אותם למבחנות חדשות כדי להכין פלטה לדגימות; הוסיפו 20 µL של 10 x binding buffer לכל באר. עבור כל דגימה לא ידועה ועבור דגימות עקום הסטנדרט D1 עד D8 נדרשות שלוש בארות, ועבור דגימה D9 נדרשות שש בארות. הוסיפו 200 µL מכל דגימה לבארות המתאימות והשתמשו במערבב מיקרופלטות כדי לערבב את הפלטה למשך 10 שניות. ערבבו במערבל Vortex את חרוזי ה-IPA למשך 10 שניות במהירות המקסימלית או עד להסעה מלאה.לאחר מכן, טפטפו 20 µL של החרוזים לכל באר דגימה וערבבו את הפלטה במשך 30 שניות. דגרו את הפלטה בתוך דגורת פלטות מסתובבת למשך שעתיים ב-750 RPM וב-25 °C או בטמפרטורת החדר, כדי לשטוף את הפלטה באמצעות שוטפת פלטות אוטומטית. לאחר הרצת תוכנית ההכנה (prime program), הניחו את הפלטה על פלטת הפרדת חרוזי מגנט של 96 בארות בשוטפת הפלטות.לאחר מכן, הפעילו את תוכנית השטיפה הראשית. עם השלמת התוכנית, הוציאו את הפלטה מהשוטף. הוסיפו 50 µL של תמיסת סניפ (reaction buffer) בריכוז 1x לכל באר דגימה וערבבו למשך 30 שניות.כדי להתחיל את בדיקת מטריצת ה-bot, הוסף 50 µL של AE reporter בריכוז 0.5 µM לכל באר דגימה. כדי למנוע אפקטים של קצוות, הוסף 100 µL של מים לכל באר שאינה בשימוש. השתמש בסרט דביק לאיטום הפלטה, הגן עליה מפני אור והדגר אותה ב-750 RPM ובטמפרטורה של 25 °C או בטמפרטורת החדר.בכל מועד קריאה, הוצא את הפלטה מהאינקובטור. הסר את סרט האיטום העליון, והנח מיד את הפלטה על פלטת הפרדת חרוזיים מגנטית בעלת 96 בארות; המתן שתי דקות להפרדת החרוזיים. הנח את הפלטה בקורא המיקרופלטות ומדוד את הפליטות באורך גל של כ-470 ושל כ-526 ננומטר תחת עירור של כ-434 ננומטר.אם נדרשים זמני קריאה נוספים, לאחר השהייה של החרוזים למשך 30 שניות על מערבל המיקרופלטה (microplate mixer), אטמו שוב את הפלטה והחזירו אותה לאינקובטור. מוצגות כאן תוצאות בדיקה עבור bot holo-toxin שהוזרק ל-PBS ונבדק לאחר דגירה של שעתיים, ארבע שעות ו-24 שעות עם ה-AE reporter. שסועו של ה-reporter על ידי bot נמדדת כהפחתה ביחס הפליטה שנמדד על ידי קורא הפלטות שלנו, מכ-2.7 עבור ה-reporter השלם לכ-0.7 עבור ה-reporter השסוע לחלוטין.ערכים ספציפיים יהיו שונים בין קוראי לוחות, כפי שנראה מההסטה שמאלה של העקומה; זמן דגירה ממושך עם החלבון המדווח מוביל להגברת הפיצול של החלבון המדווח. נקודות הנתונים שנבדקו בשלוש חזרות מראות סטיית תקן נמוכה של הממוצע ועוקבות אחר המגמה הצפויה של יחס פליטה מוגבר עם עומס רעלן מופחת. כישלון של הבדיקה לעקוב אחר מגמה צפויה זו עשוי להצביע על שגיאה במהלך יצירת הדילוציות או בשיזוף הנתונים; יחסי הפליטה של הביקורות שאינן מכילות bot A נותרו יציבים גם הם במהלך הדגירה, מה שמעיד על היעדר פעילות פרוטאז לא ספציפית.איור זה מדגים את המתודולוגיה הכללית המשמשת לזיהוי או לכימות של כל דגימה לא ידועה מול עקומת סטנדרט, ומכמת דגימות של תכשירים פרמצבטיים של bot a. עקומת סטנדרט הוכנה ב-PBS עם bot purified, שהו holo toxin, ועובדה במקביל עם מהלעות של מוצר תרופתי שהוכנו מבקבוק lyophilized Botox בודד של 100 יחידות ששוחלל ב-0.9% saline. בבדיקה זו, החלק הליניארי של עקומת הסטנדרט חל בין יחס פליטה של 2.11 ל-1.05, והוא מסומן על ידי המסגרת המקווקווקת באיור. ריכוזיהן של שלוש הדגימות הבלתי ידועות שנמצאו בטווח ליניארי זה חושבו לאחר מכן באמצעות אינטרפולציה מעקומת הסטנדרט.בניסוי זה, עגבניות טריות וחלב 2% שימשו כמטריצות מזון מוצקות ונוזליות, ואליהן הוסף bot A - קומפלקס המורכב מהחלבון הליבתי (core), מהחלבון הנושאי (non-toxic protein) ומהנוירוטוקסין. שילוב זה נבחר מכיוון שהוא דומה לרעל המיוצר במהלך זיהום טבעי ב-clostridium, כפי שמוצג כאן. התאוששות של bot A נצפתה בשתי המטריצות.יתרה מכך, הגברת זמן האינקובציה עם הדיווח (reporter) מעלה את רגישות הבדיקה אך אינה גורמת לירידה ביחסי הפליטה עבור בקרות ללא רעלן, מה שמעיד על כך ששבירה הנצפית נובעת מ-bot A ולא ממעבר של פרוטאזה לא ספציפית מהמזון בבדיקה. ה-bot A-L-O-D-L-O-Q וה-EC 50 עבור שני סוגי המזון בכל נקודת זמן המוצגת מסוכמים בטבלה זו. ה-LOD וה-LOQ מוגדרים כדגימה בריכוז הנמוך ביותר עם יחס פליטה הנמוך משלוש ו-10 סטיות תקן מתחת לרקע, בהתאמה.שונות בין מטריצות ב-LOD וב-LOQ היא צפויה, שכן אפקטים של מטריצה עשויים להשפיע על קישור הרעלן לחרוזים ועל השחזור של החרוזים במהלך השטיפה. למרות שמהנתונים נראה כי שחזור הרעלן מחלב 2% היה גבוה יותר מאשר מעגבניות, חלק ניכר מהבדל זה נובע מהדילול הנוסף הנדרש להומוגניזציה של דגימות עגבניות ב-GPB. בנוסף להיותן מטריצת מזון מוצקה, עגבניות הן סוג דגימה שבו התאמת ה-pH והחוזק היוני היא קריטית להצלחת הבדיקה.איור זה ממחיש את תגובות הבדיקה בעת בדיקת עגבניות עם או ללא הוספת תמיסת ניטרול 10x. אי-הוספה של התמיסה גורמת להתשגום דל של bot A מהדגימות, דבר המודגם על ידי יחס פליטה קבוע בכל ריכוזי ה-bot A שנבדקו; לעומת זאת, הוספת תמיסת ניטרול 10x מובילה לזיהוי רגיש של הרעלן. פרוטאזים לא ספציפיים עשויים להיות אנדוגניים לדגימת המזון או להיכנס בעת שימוש בתכשירי bot לא מופרשים, כגון תרבית Clostridium וסבנאטס (supernatants), ועשויים לשגג את ה-AE reporter, מה שיוביל לתוצאות חיוביות שגויות. דוגמה זו ממחישה פעילות פרוטאז לא ספציפית שנמצאה בסבנאטס של תרבית Clostridium bot a, תוך שימוש ברפורטר משופר שאינו משגג יותר על ידי bot A. הרמות הגבוהות של שגיגת הרפורטר מעידות על התרבית.הנוזל העליון מכיל פעילות פרוטאזית משמעותית, אשר מנוטרלת ביעילות על ידי הוספת מעכבי פרוטאז. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך זמן בדיקה כולל של בין 4 ל-26 שעות, בהתאם לסוג הדגימה ולעומס הרעלן. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של אופן הבידוד והכימות של רעלן בוטולינום (botulinum neurotoxin) מדגימות מורכבות באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) במערכת דיווח חלבונית המבוססת על פלואורסצנציה.אין לשכוח כי עבודה עם רעלנים עצביים של botulinum עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להשתמש באמצעי זהירות כגון כפפות, הלבוש המעבדה, וארונות בטיחות כימיים וביולוגיים בעת ביצוע הליך זה.

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול לזהות trichothecenes (mycotoxins של דאגה לבריאות האדם) בשיטת ההקרנה החדשה שפותחה על בסיס שיטת immunochemical תחרותי זיהוי סופי אלקטרוכימיים מודגם.

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

בדו"ח זה, אנו מתארים כיצד plasmon משטח תהודה משמש כדי לזהות כניסה רעלן לתוך cytosol המארח. שיטה זו רגישה מאוד יכול לספק נתונים כמותיים על כמות הרעלן cytosolic, וזה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של רעלים.

איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

סרטון זה מדגים בדיקה חיסונית מבוססת חרוזים לכימות מטרות ציטוקינים מרובות בדגימה. תערובת של מיקרוספרות נפרדות המצומדות לנוגדנים ספציפיים לציטוקינים משמשת לקשירת הציטוקינים הנמצאים בדגימה. כתבים המתויגים על ידי סטרפטווידין משותקים על הציטוקינים הקשורים באמצעות נוגדנים לזיהוי ביוטינילציה. ציטומטריית זרימה מזהה את הציטוקינים הקשורים על סמך הגדלים הייחודיים ועוצמות הפלואורסצנטיות הפנימיות של המיקרוספרות, בעוד שעוצמת הפלואורסצנטיות של המדווחים מציינת את מספר הציטוקינים.

בדיקה חיסונית מבוססת חרוזים לכימות מטרות ציטוקינים מרובות

שרשרת הקלה של הבוטולינום נוירוטוקסין מסוג A (BoNT/A LC) היא מטאלופרוטיאז שנכנס לנוירונים מוטוריים, מבקע את המצע שלו SNAP-25 ומשבש את ההולכה העצבית, ובכך גורם לשיתוק רפוי. באמצעות בדיקה מבוססת FRET תואמת תפוקה גבוהה, ניתן לסנן ספריות גדולות של מולקולות קטנות להשפעתן על הפעילות האנזימטית של BoNT/A LC.

פלטפורמה מבוססת FRET תואמת תפוקה גבוהה לזיהוי ואפיון של מודולטורים של שרשרת אור בוטולינום נוירוטוקסין

בוטולינום נוירוטוקסין הוא אחד הרעלנים החזקים ביותר מבין גורמי האיום הביולוגי מקטגוריה A, אך טיפול לאחר חשיפה אינו זמין. גישת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה היא מתודולוגיה רבת עוצמה לזיהוי מעכבים חדשים מכיוון שהיא מאפשרת סריקה רב-פרמטרית באמצעות נוירונים מוטוריים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, המטרה העיקרית של רעלן זה.

Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

מתואר פרוטוקול מותאם אישית להבדיל תאי ES של עכברים לאוכלוסיות מוגדרות של נוירונים טהורים ביותר המציגים סינפסות מתפקדות והתנהגות רשת מתעוררת. ניתוח אלקטרופיזיולוגי מדגים את אובדן ההעברה הסינפטית בעקבות חשיפה לסרוטיפים של נוירוטוקסין בוטולינום /A-/G ורעלן עצבי טטנוס.

הערכה תפקודית של ביולוגי עצבי בתרבויות ברשת של תאי גזע שמקורם בנוירונים במערכת עצבים מרכזי

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

פרוטוקול זה מציג שיטת ספקטרומטריית מסה מאומתת של כרומטוגרפיה נוזלית - ניידות יון ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע את נוכחותם של אלקלואידים ארגוט במזון בהתאם לתקנה של הנציבות (EU) 2023/915 שפורסמה לאחרונה.

זיהוי אלקלואידים ארגוטיים מוסדרים במטריצות מזון על ידי ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים בכרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה בזמן טיסה

זה פרוטוקול וידאו מדגים את שיטת assay neurosphere ליצור ולהרחיב בתאי גזע עצביים מן האזור עכבר מבוגר periventricular, ומספק תובנות טכניות על מנת להבטיח ניתן להשיג תרבויות neurosphere לשחזור.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Explants ממערכת המוח התיכון דופאמין הסטריאטום משמשים assay קולגן מטריקס...

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

חקור שיטה לבידוד וכימות טוקסין עצבי בוטולינום ממטריצות מורכבות כגון מזון ותרופות באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים ומדידה ספקטרוסקופית.

בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

גלה סרטונים נוספים