בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

המטרה הכללית של נוהל זה היא לכמת את הפעילות הפרוטאוליטית של רעלן בוטולינום (botulinum neurotoxin) במטריצות מורכבות, כגון דגימות תרופתיות, סביבתיות ודגימות מזון. מטרה זו מושגת תחילה על ידי עיבוד דגימות הבדיקה ודגימות עקומת הסטנדרט, במידת הצורך, כדי להשיג תנאי pH וצמיגות מתאימים. לאחר מכן, רעלן הבוטולינום מופק מהדגימות באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) בעזרת חרוזי מגנט מצופים בנוגדנים.

לאחר מכן, שוטפים ביסודיות את החרוזיים המגנטיים כדי להסיר תרכובים מפריעים, וסוסיפם שוב בבופר תגובה אופטימלי. לבסוף, מדגירים את החרוזיים השטופים עם חלבון מדד (reporter protein) ומודדים באופן ספקטרוסקופי את השסוע של המדד לאורך זמן. בסופו של דבר, השוואה בין שסוע המדד בדגימות הבדיקה לבין דגימות עקומת הסטנדרט משמשת לכימות הפעילות של רעל הבוטולינום בדגימות הבדיקה, ברגישות השקופה לבדיקה ביולוגית בעכברים (mouse bioassay).

היתרונות המרכזיים של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון שימוש בעכברים, בדיקות ביולוגיות (bioassay), שיטות אימונולוגיות ושיטות פלואורסצנטיות אחרות, הם שבדיקה זו אינה דורשת שימוש בבעלי חיים והוכחה יעילותה בשימוש במטריצות מורכבות מאוד הנמצאות בדגימות מזון, סביבה ותרופות. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות, שכן היא דורשת עיבוד ומיהול מדויקים של הדגימה. את הפרוצדורה יעגיל ד"ר Mark Dunning, מדען ב-Bio Sentinel.

הכינו תמיסות בופר בהתאם לפרוטוקול הכתוב כדי ליצור עקומת סטנדרט לכימות דגימות הבדיקה. שקלו 10 ± 0.01 גרם של דגימת מזון מוצקה אל תוך מבחנה קונוית של 50 מיליליטר והפרישו אותה; דגימה זו תשמש כמדלל. במבחנה שנייה, שקלו 2 ± 0.01 גרם של דגימת מזון מוצקה. הוסיפו רעל עצבי של בוטולינום (botulinum neurotoxin או BoNT) לפני השטח של דגימת המזון במשקל שני גרם עד לריכוז סופי של 30,000 MLD₅₀ לגרם מזון. דגרו את המדלל ואת הדגימות המועשרות בטמפרטורת החדר או ב-4°C למשך שעתיים, כדי לאפשר ל-BoNT להגיב עם מטריצת המזון.

בחיקוי של זיהום טבעי, עיינו בפרוטוקול הטקסט לסוגי דגימות נוספים. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של GPB לכל גרם מזון לדגימות המועשרות ולדגימות שאינן מועשרות, והשתמשו בעק לוואי להומוגניזציה עד לקבלת תערובת אחידה. השלימו את הנפח הכולל של דגימה מועשרת במשקל שני גרם על סמך הנפח הכולל המשוער של דגימת המדלל במשקל 10 גרם.

לאחר מכן, הוסיפו נפח של 1/10 ממרכז ניטרול (neutralization buffer) בריכוז 10x לדגימת המדלל במשקל 10 גרם ולדגימה המוסיפה (spiked sample) במשקל שני גרם, בהתאם לנפחים הכוללים שלהן. ערבבו את הדגימות היטב על ידי הפיכה, והבהירו חלקית את שתי הדגימות באמצעות סרטיפוגציה למשך 10 דקות ב-6,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. מיד לאחר מכן, הסירו את העילאיים והעבירו אותם למבחנות חדשות, כאשר הדגימה המוסיפה משמשת כ-D1 והדגימה שאינה מוסיפה משמשת כמדלל; הכינו את שאר דגימות עקומת הסטנדרט במבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

להכנת דגימות מזון מוצקות, התחילו בשקילה של 2 ± 0.01 גרם של דגימה מוצקה לא ידועה לתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר. הוסיפו 2 מיליליטר של GPB והשתמשו בעלי פיתה (pestle) כדי להומוגניзировать את הדגימה. לאחר מכן, הוסיפו לדגימה נפח של עשירית מהנפח של 10 x neutralization buffer וערבבו היטב על ידי היפוך. לאחר ביצוע הבהרה חלקית של הדגימה באמצעות סנטריפוגציה למשך 10 דקות ב-6,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C, העבירו מיד לפחות 750 µL מהעליון (supernatant) למבחנת מיקרו-סנטריפוגה.

זהו הדילול הראשון של הדגימה הבלתי ידועה. הוסף 675 µL מהמדלל לשתי מבחנות המסומנות כדילול שני ושלישי של הדגימה הבלתי ידועה. המדלל יהיה אותו חומר מעובד ששימש ליצירת עקומת הסטנדרט.

השתמשו בדילול הראשון כדי לבצע דילול סדרתי על ידי העברה של 75 µL מהדילול הראשון למבחנה של דילול שני וערבוב. לאחר מכן, העבירו 75 µL מדילול שני למבחנה של דילול שלישי וערבבו. כדי להבהיר את הדגימות, סבבו אותן בצנטריפוגה למשך חמש דקות לפחות ב-14,000 ×g.

הסִירו מיד את העילאים והעבירו אותם למבחנות חדשות כדי להכין פלטה לדגימות; הוסיפו 20 µL של 10 x binding buffer לכל באר. עבור כל דגימה לא ידועה ועבור דגימות עקום הסטנדרט D1 עד D8 נדרשות שלוש בארות, ועבור דגימה D9 נדרשות שש בארות. הוסיפו 200 µL מכל דגימה לבארות המתאימות והשתמשו במערבב מיקרופלטות כדי לערבב את הפלטה למשך 10 שניות. ערבבו במערבל Vortex את חרוזי ה-IPA למשך 10 שניות במהירות המקסימלית או עד להסעה מלאה.

לאחר מכן, טפטפו 20 µL של החרוזים לכל באר דגימה וערבבו את הפלטה במשך 30 שניות. דגרו את הפלטה בתוך דגורת פלטות מסתובבת למשך שעתיים ב-750 RPM וב-25 °C או בטמפרטורת החדר, כדי לשטוף את הפלטה באמצעות שוטפת פלטות אוטומטית. לאחר הרצת תוכנית ההכנה (prime program), הניחו את הפלטה על פלטת הפרדת חרוזי מגנט של 96 בארות בשוטפת הפלטות.

לאחר מכן, הפעילו את תוכנית השטיפה הראשית. עם השלמת התוכנית, הוציאו את הפלטה מהשוטף. הוסיפו 50 µL של תמיסת סניפ (reaction buffer) בריכוז 1x לכל באר דגימה וערבבו למשך 30 שניות.

כדי להתחיל את בדיקת מטריצת ה-bot, הוסף 50 µL של AE reporter בריכוז 0.5 µM לכל באר דגימה. כדי למנוע אפקטים של קצוות, הוסף 100 µL של מים לכל באר שאינה בשימוש. השתמש בסרט דביק לאיטום הפלטה, הגן עליה מפני אור והדגר אותה ב-750 RPM ובטמפרטורה של 25 °C או בטמפרטורת החדר.

בכל מועד קריאה, הוצא את הפלטה מהאינקובטור. הסר את סרט האיטום העליון, והנח מיד את הפלטה על פלטת הפרדת חרוזיים מגנטית בעלת 96 בארות; המתן שתי דקות להפרדת החרוזיים. הנח את הפלטה בקורא המיקרופלטות ומדוד את הפליטות באורך גל של כ-470 ושל כ-526 ננומטר תחת עירור של כ-434 ננומטר.

אם נדרשים זמני קריאה נוספים, לאחר השהייה של החרוזים למשך 30 שניות על מערבל המיקרופלטה (microplate mixer), אטמו שוב את הפלטה והחזירו אותה לאינקובטור. מוצגות כאן תוצאות בדיקה עבור bot holo-toxin שהוזרק ל-PBS ונבדק לאחר דגירה של שעתיים, ארבע שעות ו-24 שעות עם ה-AE reporter. שסועו של ה-reporter על ידי bot נמדדת כהפחתה ביחס הפליטה שנמדד על ידי קורא הפלטות שלנו, מכ-2.7 עבור ה-reporter השלם לכ-0.7 עבור ה-reporter השסוע לחלוטין.

ערכים ספציפיים יהיו שונים בין קוראי לוחות, כפי שנראה מההסטה שמאלה של העקומה; זמן דגירה ממושך עם החלבון המדווח מוביל להגברת הפיצול של החלבון המדווח. נקודות הנתונים שנבדקו בשלוש חזרות מראות סטיית תקן נמוכה של הממוצע ועוקבות אחר המגמה הצפויה של יחס פליטה מוגבר עם עומס רעלן מופחת. כישלון של הבדיקה לעקוב אחר מגמה צפויה זו עשוי להצביע על שגיאה במהלך יצירת הדילוציות או בשיזוף הנתונים; יחסי הפליטה של הביקורות שאינן מכילות bot A נותרו יציבים גם הם במהלך הדגירה, מה שמעיד על היעדר פעילות פרוטאז לא ספציפית.

איור זה מדגים את המתודולוגיה הכללית המשמשת לזיהוי או לכימות של כל דגימה לא ידועה מול עקומת סטנדרט, ומכמת דגימות של תכשירים פרמצבטיים של bot a. עקומת סטנדרט הוכנה ב-PBS עם bot purified, שהו holo toxin, ועובדה במקביל עם מהלעות של מוצר תרופתי שהוכנו מבקבוק lyophilized Botox בודד של 100 יחידות ששוחלל ב-0.9% saline. בבדיקה זו, החלק הליניארי של עקומת הסטנדרט חל בין יחס פליטה של 2.11 ל-1.05, והוא מסומן על ידי המסגרת המקווקווקת באיור. ריכוזיהן של שלוש הדגימות הבלתי ידועות שנמצאו בטווח ליניארי זה חושבו לאחר מכן באמצעות אינטרפולציה מעקומת הסטנדרט.

בניסוי זה, עגבניות טריות וחלב 2% שימשו כמטריצות מזון מוצקות ונוזליות, ואליהן הוסף bot A - קומפלקס המורכב מהחלבון הליבתי (core), מהחלבון הנושאי (non-toxic protein) ומהנוירוטוקסין. שילוב זה נבחר מכיוון שהוא דומה לרעל המיוצר במהלך זיהום טבעי ב-clostridium, כפי שמוצג כאן. התאוששות של bot A נצפתה בשתי המטריצות.

יתרה מכך, הגברת זמן האינקובציה עם הדיווח (reporter) מעלה את רגישות הבדיקה אך אינה גורמת לירידה ביחסי הפליטה עבור בקרות ללא רעלן, מה שמעיד על כך ששבירה הנצפית נובעת מ-bot A ולא ממעבר של פרוטאזה לא ספציפית מהמזון בבדיקה. ה-bot A-L-O-D-L-O-Q וה-EC 50 עבור שני סוגי המזון בכל נקודת זמן המוצגת מסוכמים בטבלה זו. ה-LOD וה-LOQ מוגדרים כדגימה בריכוז הנמוך ביותר עם יחס פליטה הנמוך משלוש ו-10 סטיות תקן מתחת לרקע, בהתאמה.

שונות בין מטריצות ב-LOD וב-LOQ היא צפויה, שכן אפקטים של מטריצה עשויים להשפיע על קישור הרעלן לחרוזים ועל השחזור של החרוזים במהלך השטיפה. למרות שמהנתונים נראה כי שחזור הרעלן מחלב 2% היה גבוה יותר מאשר מעגבניות, חלק ניכר מהבדל זה נובע מהדילול הנוסף הנדרש להומוגניזציה של דגימות עגבניות ב-GPB. בנוסף להיותן מטריצת מזון מוצקה, עגבניות הן סוג דגימה שבו התאמת ה-pH והחוזק היוני היא קריטית להצלחת הבדיקה.

איור זה ממחיש את תגובות הבדיקה בעת בדיקת עגבניות עם או ללא הוספת תמיסת ניטרול 10x. אי-הוספה של התמיסה גורמת להתשגום דל של bot A מהדגימות, דבר המודגם על ידי יחס פליטה קבוע בכל ריכוזי ה-bot A שנבדקו; לעומת זאת, הוספת תמיסת ניטרול 10x מובילה לזיהוי רגיש של הרעלן. פרוטאזים לא ספציפיים עשויים להיות אנדוגניים לדגימת המזון או להיכנס בעת שימוש בתכשירי bot לא מופרשים, כגון תרבית Clostridium וסבנאטס (supernatants), ועשויים לשגג את ה-AE reporter, מה שיוביל לתוצאות חיוביות שגויות. דוגמה זו ממחישה פעילות פרוטאז לא ספציפית שנמצאה בסבנאטס של תרבית Clostridium bot a, תוך שימוש ברפורטר משופר שאינו משגג יותר על ידי bot A. הרמות הגבוהות של שגיגת הרפורטר מעידות על התרבית.

הנוזל העליון מכיל פעילות פרוטאזית משמעותית, אשר מנוטרלת ביעילות על ידי הוספת מעכבי פרוטאז. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך זמן בדיקה כולל של בין 4 ל-26 שעות, בהתאם לסוג הדגימה ולעומס הרעלן. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של אופן הבידוד והכימות של רעלן בוטולינום (botulinum neurotoxin) מדגימות מורכבות באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) במערכת דיווח חלבונית המבוססת על פלואורסצנציה.

אין לשכוח כי עבודה עם רעלנים עצביים של botulinum עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להשתמש באמצעי זהירות כגון כפפות, הלבוש המעבדה, וארונות בטיחות כימיים וביולוגיים בעת ביצוע הליך זה.