להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום הדמיית מולקולה בודדת של אינטראקציות חלבון DNA כגון שכפול DNA, תיקון גנים ושמירה על מבנה הכרומוזום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג DNA למבדה שונה עם קולגן גבוה ולאחר מכן לרפא במהירות את החלבונים המסומנים הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הרכבת תאי הזרימה.

כדי לנקות את הכיסויים, הניחו 20 כיסויים לארבע צנצנות מכתים, שפכו לתוכם אתנול וסוניקציה למשך 30 דקות באתנול. לאחר מכן שטפו את הכיסויים במים טהורים במיוחד שלוש פעמים. לאחר מכן, סוניקציה של הכיסויים עם אשלגן הידרוקסיד טוחנת אחת למשך 30 דקות ושטוף את הכיסויים במים טהורים במיוחד שלוש פעמים.

לאחר מכן חזור על סוניקציה של אתנול ואשלגן הידרוקסיד פעם אחת. סוניק את הכיסויים עם אצטון למשך 30 דקות ולאחר מכן שטוף היטב במים טהורים במיוחד. כעת הניחו את הכיסויים בתמיסת פיראנה ודגרו בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר הדגירה, שטפו את הכיסויים במים טהורים במיוחד חמש פעמים. לאחר מכן שטפו כל כיסוי בהרחבה במים טהורים במיוחד. השתמש בנייר כדי לייבש את הכיסוי מהקצה שלו והנח את הכיסוי בצנצנת מכתים.

יבש היטב את הכיסוי בתנור 110 מעלות צלזיוס. כעת שטפו את הכיסוי במתנול ולאחר מכן הכניסו את צנצנת הצביעה בחזרה לתנור 110 מעלות צלזיוס כדי לייבש את הכיסוי. כדי לבצע פונקציונליזציה של כיסוי, הוסף 70 מיליליטר תמיסת סילאן לכל צנצנת, הברג את המכסה והשאיר את הצנצנת בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

שטפו את הכיסויים בעזרת שלוש כוסות מלאות במים טהורים במיוחד. יבש היטב את הכיסויים באמצעות גז חנקן. ממיסים 150 מיליגרם של מתוקסי-PEG ושישה מיליגרם של ביוטין-PEG לתוך מיליליטר אחד של נתרן ביקרבונט טרי 0.1 מולארי.

צנטריפוגה ב 17, 000 פעמים גרם למשך דקה אחת להסרת PEG בלתי מסיסים. כעת פיפטה 100 מיקרוליטר של תמיסת PEG במרכז הכיסוי הסילאני והנח כיסוי סילאני נוסף בחלקו העליון. דגרו את הכיסויים עם תמיסת PEG למשך שלוש שעות לפחות בחושך.

הפרד את זוגות הכיסוי ושמור על המשטח הפונקציונלי כלפי מעלה. יש לשטוף בהרחבה את הכיסויים במים טהורים במיוחד ולייבש אותם בגז חנקן. כעת סמן את הצד הפונקציונלי של הכיסויים באחת הפינות בעזרת עט טוש.

הנח כיסוי אחד לתוך צינור של 50 מיליליטר שנקדח עם חור אחד על המכסה שלו. הכניסו את הצינור לשקית ניילון, אטמו את השקית בעזרת אוטם ואקום ואחסנו אותה בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להרכיב את תא הזרימה, חותכים תעלה במרכז פיסת סרט דו צדדי בעזרת אגרוף.

מקלפים את צד הנייר של הקלטת הדו-צדדית ומדביקים אותו על צד זכוכית עם שני חורים. קל יותר להסיר בועות אוויר על ידי קילוף צד הנייר מאשר צד הפלסטיק של הסרט הדו-צדדי. לחץ על הסרט כדי להסיר בועות אוויר.

לאחר מכן חותכים כיסוי פונקציונלי לארבע חתיכות באמצעות סופר זכוכית עם קצה יהלום ומסירים את הפסולת באמצעות גז חנקן תוך שמירה על הצד הפונקציונלי כלפי מעלה. קלף את צד הפלסטיק של הסרט הדו-צדדי והדבק את השקופית על הכיסוי הפונקציונלי. לחץ בעדינות כדי להסיר בועות אוויר בין הכיסוי לסרט.

הסרה יסודית של בועות אוויר יכולה להגן על תא הזרימה מפני דליפה בזמן שאיבה לתוכו מאגרים. כעת הכנס את צינור הכניסה לחור הקטן והכנס את צינור היציאה לחור הגדול. תקן את הצינור באמצעות אפוקסי.

יש לשאוב ידנית 20 מיקרוליטר של 0.2 מיליגרם למיליליטר סטרפטווידין לתא הזרימה באמצעות מזרק ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן יש לשאוב את המאגר החוסם לתוך תא הזרימה כדי להחליף את סטרפטווידין ולשמור אותו בטמפרטורת החדר. השג את יישור המוקד של אדום ואדום רחוק עם A5 בשקופית בדיקת המיקרוסקופ הקרינה מספר אחת על ידי עירור בו זמנית באמצעות לייזר 532 ננומטר ולייזר 640 ננומטר.

הפק תמונות באורך גל כפול עם אופטיקה מפוצלת. הנח את תא הזרימה על המיקרוסקופ וחבר את צינור היציאה שלו לצינור ארוך יותר המחובר לקפיץ של 10 מיליליטר המותקן על משאבה אוטומטית הניתנת לתכנות לנסיגת עירוי. הסר בועות אוויר בתא הזרימה על ידי הזרקת מאגר חוסם והיפוך צינור היציאה.

הוסף 0.5 מיקרוליטר של DNA למבדה-ARS317 ביוטיניל ל-80 מיקרוליטר של מאגר חוסם. שואבים את התערובת המוכנה לתא הזרימה במהירות של 25 מיקרוליטר לדקה למשך שתי דקות. לאחר מכן שטפו את ה-DNA lambda-ARS317 באמצעות 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם בקצב של 50 מיקרוליטר לדקה.

כעת שאבו 200 מיקרוליטר של מאגר קשירה בקצב של 50 מיקרוליטר לדקה כדי להסיר את המאגר החוסם בתא הזרימה. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של ORC-Qdot705, מיקרוליטר אחד של DTT ומיקרוליטר אחד של ATP לתוך 96 מיקרוליטר של מאגר קשירה. הריכוז הסופי של ORC-Qdot705 הוא 0.2 ננו-מולארי.

לאחר שאיבת מאגר הכריכה כמפורט בפרוטוקול הטקסט, יש לשאוב 20 מיקרוליטר מתמיסת ORC-Qdot705 המוכנה בקצב של 10 מיקרוליטר לדקה לתא הזרימה. שטוף עודף ORC-Qdot705 באמצעות 200 מיקרוליטר של מאגר קשירה בקצב של 100 מיקרוליטר לדקה. לאחר מכן שאב מאגר קשירה עם 30 ננו-מולרי SYTOX Orange לתא הזרימה כדי להכתים מצעי DNA בקצב של 100 מיקרוליטר לדקה.

לבסוף, עורר את אות ORC-Qdot705 באמצעות לייזר 405 ננומטר ועורר את אות ה- DNA המוכתם בכתום SYTOX באמצעות לייזר 532 ננומטר. התבונן באותות בו-זמנית עם זרימה של 100 מיקרוליטר לדקה באמצעות מסנן פס פס מרובע פס. הקלט את התמונות על ידי EMCCD עם 100 אלפיות השנייה למסגרת.

האיור של מצע ה-DNA lambda-ARS317 מוצג כאן. ORC עם התווית Qdot705 התרגש על ידי לייזר של 405 ננומטר. SYTOX DNA מוכתם כתום התרגש על ידי לייזר של 532 ננומטר.

התוצאה הממוזגת מצביעה על כך ש-ORC עם התווית Qdot705 נקשר ב-ARS317. התוצאה של התפלגות קשירת ORC על DNA למבדה-ARS317 מראה ש-ORC נקשר ב-ARS317 בשפע גבוה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו FRET של מולקולה בודדת על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לאינטראקציות חלבון-חלבון ודינמיקה של חלבון.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת לחקור אינטראקציות של חלבון DNA במערכות משוחזרות של שכפול DNA ותיקון DNA במבחנה. אל תשכח שעבודה עם תמיסת פיראנה עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון חבישת מסכות פנים מגן בעת ביצוע הליך זה.