מיון של
13 בפברואר 2014
תרבויות Streptomyces-גדל נוזל מאופיינים בכדורי mycelial כי הם הטרוגנית בגודל. אנחנו כאן מתארים שיטה לניתוח וסוג כזה כדורים באופן תפוקה גבוהה. כדורים אלה יכולים לשמש לניתוחים נוספים, אשר יספק מוביל להבין ולשלוט ההטרוגניות צמיחה.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למיין כופתיות מיצליום (mycelial pellets) שנוצרו על ידי streptomyces חוטים לפי גודלן, באמצעות ציטומטר זרימה מסוג COPA לחלקיקים גדולים. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול ודגימה של זן החיידקים הרצוי. בשלב השני, זן הדגימה נמדד באמצעות coppa.
לאחר מכן הנתונים מנותחים in silico והגשישים המיצליים ממוינים בהתאם לפרמטרים שהגדיר המשתמש. בסופו של דבר, ניתוחים אלו יכולים לשמש לאפיון נוסף של ההטרוגניות בגודל הגשישים. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו עבור streptomyces, ניתן להחילה גם על אורגניזמים אחרים כגון פטריות Filamentous; את ההליך ידגים MaRous Petrus, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה שלנו.
ראשית, גדלו את התרביות על ידי הוספת 100 milliliters של מצע תמצית שמרים ותמצית מאלט ו-0.2 milliliters של magnesium chloride בריכוז 2.5 molar לבקבוק ארלנמייר סטרילי בנפח 250 milliliter, המצויד בקפיצי מתכת עבור כל דגימת חיידקים. לאחר מכן, חסנו כל בקבוק עם 1x10⁸ נבגי *Streptomyces* כדי להגיע לריכוז נבגים של 1x10⁶ נבגים ל-milliliter, וגדלו את החיידקים בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור ב-180 RPM. לאחר יומיים, השתמשו בפיפטה סטרילית של 5 milliliter כדי לאסוף דגימה של 5 milliliter מכל תרבית, תוך כדי ניעור עדין של הבקבוק כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.
לאחר מכן, העבירו כל דגימה למבחנות קוניות נפרדות בנפח 15 milliliter. כדי להעריך את הדגימות באמצעות אנליזת copus, ודאו שמחשב ה-copus plus pump והלייזר ארגון ב-488 nanometer דולקים, ולאחר מכן פתחו את תוכנת ה-bio source. ודאו שבקבוק נוזל המעטפה מלא ו שבקבוק הפסולת ריק, ואז לחצו על start and run.
כדי להעביר את לייזר הארגון בעל אורך גל של 488 nanometer ממצב המתנה למצב פעיל, המתינו כ-60 שניות עד שהלייזר יהיה מוכן. לחצו על "done", ולאחר מכן בדקו את מדי הלחץ. סמנו את תיבת הסימון שליד הלחץ.
בסדר, ולאחר שהמערכת תבצע רטיבה (priming) של תא הזרימה, וודאו שהגדרת ההשהיה (delay) היא 11 ושהרוחב (width) הוא 7. הגדירו את הספי (thresholds) ל-50 עבור האות (signal) ול-40 עבור זמן מעוף (time of flight) מינימלי. לאחר מכן, הסירו את שאריות המים מכוסית הדגימה.
הוסיפו כ-50 milliliters של PBS, ולאחר מכן הוסיפו 0.1 milliliter של אחת מדגימות ה-strep demy לתוך הכוס. ודאו שהכוס סגורה כראוי ולאחר מכן לחצו על acquire כדי להתחיל באיסוף נתונים. וסתרו את מהירות הזרימה כדי להשיג בין 30 ל-50 אירועים לשנייה כאשר נאספו לפחות 2,500 אירועים.
לחצו על stop, ולאחר מכן על store כדי לשמור את הנתונים לצורך ניתוח סטטיסטי עוקב למיון משקעי חיידקים עבור כל דגימה. ראשית, הגדירו את גבולות המיון והזינו את הפרטים לגבי ערכי זמן המעוף (time of flight) המינימליים והמקסימליים. לחלופין, בחרו אזורים ולאחר מכן הגדירו gate region כדי ליצור שטח לבחירת המשקעים בעלי הממדים והתכונות הרצויים.
הנח מבחנה של 50 milliliter לאיסוף התאים (pellets) העומדים בפרמטרי המיון. לאחר מכן, הגדר את מספר התאים למספר המיון ולחץ על sort manually כדי לבצע מיון לפי הפרמטרים שנבחרו. לאחר המיון, הסר את שארית הדגימה ושטוף את כוס הדגימה במים פעמיים.
לפני כיבוי המכשיר, נקו את כוס הדגימה עם 70% ethanol. כעת הפעילו את המערכת פעמיים: פעם אחת עם מים מכלורים ופעם אחת עם מים רגילים, ולאחר מכן רוקנו את מיכל העודפים. לאחר הניקוי, לחצו על stop כדי לשחרר את הלחץ מהמערכת.
כאשר המנוע עוצר, סגור את התוכנה ולחץ על כיבוי ללא ניקוי (shut down without purging). לאחר מכן, כבה את המחשב, את ה-copa, את הלייזר ואת המשאבה. pellets מיצליים ותרביות נוזליות של streptomyces בעלות טווח רחב של גדלים.
כדי לנתח את התפלגות גודל הגושים (pellets), תרבית של *Streptomyces cila color* שגודלה בנזיל במשך יומיים הועברה לבדיקה בציטומטריית זרימה לחלקיקים גדולים באמצעות Copus Plus Profiler המצויד בנחיר של מילימטר אחד. כאן מוצגת תרשים פיזור טיפוסי של פלט מ-Copus. ציר ה-x מייצג את זמן המעוף (time of flight).
ככל שהגרגיר גדול יותר, כך נדרש זמן רב יותר למעבר קרן הלייזר. ציר Y מציין את הבלימה (extinction), המייצגת את הצפיפות האופטית של האובייקט, כאשר כל נקודה תואמת לגרגיר בודד העובר דרך קרן הלייזר. שרטוט נקודות הנתונים להיסטוגרמה העיד על כך שהגדלים במדגם מייצג זה לא היו בעלי התפלגות נורמלית.
נראה כי ההתפלגות הייתה מוטה ימינה באופן לוגריתמי. גם טרנספורמציה של מערך הנתונים לא הובילה להתפלגות נורמלית. כדי לבחון האם ניתן להסביר את התפלגות הגדלים על ידי הנחה של תערובת של שתי התפלגויות נורמליות, הנתונים מודלו באופן מתמטי. המידול אכן הצביע על אוכלוסייה של כופתיות קטנות המהווה 92% מכלל הכופתיות עם גודל ממוצע של 248 micrometers, ואוכלוסייה של כופתיות גדולות המהווה 8% מכלל הכופתיות עם גודל ממוצע של 319 micrometers.
כאן מוצג ניתוח מייצג של מיקרו-מושבות שמופרסות מאוכלוסיות של משקעים גדולים וקטנים. הגדלים הממוצעים של המשקעים בשתי האוכלוסיות שימשו להגדרת הגבולות להפרסה, וזאת כדי להגביל את הפרסתו של משקעים מהחלק החופף של שתי התפלגויות הגדלים; משקעים קטנים מ-248 micrometers נחשבו כשייכים לאוכלוסיית המשקעים הקטנים, בעוד שמשקעים גדולים מ-319 micrometers נחשבו כשייכים לאוכלוסיית המשקעים הגדולים. ניתוח מיקרוסקופי של המשקעים המופרסים אישש את גדליהם המובחנים לאחר ביצוע הליך זה.
ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ריצוף דור הבא (next generation sequencing) או פרוטאומיקה, כדי לחשוף את המנגנונים שבבסיס ההטרוגניות זו.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה למיון פלטות מיצליום מתרביות של Streptomyces שגודלו בנוזל, בהתבסס על גודלן, באמצעות ציטומטר זרימה מסוג COPA לחלקיקים גדולים. גישה זו מאפשרת ניתוח בתפוקה גבוהה של ההטרוגניות בגודל הפלטות, דבר שעשוי להוביל לתובנות בנוגע לבקרת הגדילה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ביוטכנולוגיה
רקע
- סטרפטומייס (Streptomyces) הן חיידקים Filamentous הידועים במחזורי חיים מורכבים.
- גשרי מיצליום (Mycelial pellets) הנוצרים במהלך הגדילה מראים הטרוגניות בגודלם.
- הבנת הטרוגניות זו היא קריטית ליישומים בביוטכנולוגיה.
- ציטומטריה של זרימה (Flow cytometry) מספקת שיטה לניתוח גודל חלקיקים באופן בעל תפוקה גבוהה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה למיון גושי מיצליום לפי גודל.
- ניתוח של התפלגות הגדלים של גושי Streptomyces.
- אספקת מסגרת למחקרים עתידיים על הטרוגניות בצמיחה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול של תרביתי Streptomyces בסביבה מבוקרת.
- דגימה והכנה של תרביתיים לניתוח בציטומטריה זרימה.
- שימוש בציטומטר זרימה מדגם COPA למדידה ומיון של גומיות (pellets) על בסיס גודל.
- ניתוח סטטיסטי של התפלגות הגדלים ומידול של אוכלוסיות הגומיות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של שתי אוכלוסיות נפרדות של כופתיות על בסיס הגודל.
- הכופתיות הקטנות היו בממוצע 248 micrometers, בעוד שהכופתיות הגדולות היו בממוצע 319 micrometers.
- התפלגות הגדלים לא הייתה נורמלית, מה שמעיד על הטרוגניות משמעותית.
- ניתוח מיקרוסקופי אישר את הגדלים השונים של הכופתיות הממוינות.
מסקנות
- השיטה שפותחה ממיינת ביעילות פלטים של מיצליום לפי גודלם.
- ניתוחים נוספים עשויים להשיל אור על המנגנונים העומדים מאחורי ההטרוגניות בגודל.
- ניתן להתאים גישה זו לאורגניזמים פילמנטריים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הטרוגניות בגודל גושי המיצליום משפיעה ישירות על הפרודוקטיביות בייצור אנזימים ואנטיביוטיקה המבוססת על סטריפטומיצטים, ומהווה צוואר בקבוק באופטימיזציה של מפעל התאים. מיון הגושים לפי גודל מאפשר הפחתת סיכונים מכנית הנובעת משונות בצמיחה ותומך בביטחון חיזוי בביצועי הזן. יכולת זו מסייעת לקבלת החלטאות בשלבי גילוי מוקדמים על ידי קישור הפלט הפנוטי לסקביליות של הביו-תהליך.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות לגבי הטרוגניות בצמיחה באמצעות בידוד של תתי-אוכלוסיות מוגדרות של גושי מיצליום (pellets).
- ערך תפעולי: מספק פרקציונציה הדירה של גושי מיצליום לצורך סריקת פנוטיפ או אנליזותה אומקס (omics) בהמשך.
- ערך אסטרטגי: תומך בתיקוף מטרות על ידי קישור גודל גושי המיצליום למאפייני פריון במפעלי תאים של streptomycetes.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מייצר פרקציות משקע ממוינות לפי גודל עבור קלטים סטנדרטיים לבדיקות בסריקת אנזימים או מטבוליטים.
- ערך תפעולי: מספק מדידות כמותיות של זמן טיסה (time-of-flight) וכיבוי (extinction) לצורך סיווג המשקע.
- ערך אסטרטגי: מקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי הפחתת רעש ביולוגי הנובע משונות בגודל המשקע.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לקנה מידה פרה-קליני על ידי אספקת משקעים ממוינים לניתוחי RNA, חלבון או אומיקה.
- ערך תפעולי: תומך בהכנה של דגימות בקנה מידה רחב למחקרים מכניסטיים העומדים בבסיס ההטרוגניות של המשקעים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות על התקדמות מותאמת סיכונים באמצעות זיהוי סממנים לפרודוקטיביות המתואמים עם הגודל.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לסריקה פנוטיפית של תתי-אוכלוסיות של משקעים לפני זיהוי המולקולות המובילות (leads) ותיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מנגנוני צמיחה באמצעות פראקציונציה של pellets המבוססת על גודל.
- סריקה: מספק דגימות pellets הומוגניות בגודלן, המוכנות לבדיקה (assay) של תרכובות או תנאים.
- אנליטיקה: מספק קריאות של זמן מעוף (time-of-flight) ואטינציה (extinction) לצורך סיווג ומיון כמותי של pellets.
- מחקר תרגומי: מקשר בין pellets ממוינים לניתוח מולקולרי המשכי לגילוי סמנים ביולוגיים או מנגנונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לניתוח pellets על פני תוכניות פיתוח של זני streptomycetes.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרי גדילה על ידי מתן אפשרות לבידוד של אוכלוסיות pellets מוגדרות.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה בניתוח pellets בין סדרות וזנים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי קישור גודל ה-pellet לתוצרי פרודוקטיביות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של זני streptomycetes בהתבסס על נתוני פרודוקטיביות ממוינים לפי גודל.
שיקולים ביישום
- דורש מומחיות בציטומטריה של זרימה ובטיפול בתרביות של streptomycetes.
- תלוי במכשור COPAS לחלקיקים גדולים עם תצורת נחיר ולייזר מתאימה.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת הדגימות ונוזל המעטפת בין המשתמשים.
- כולל התאמה של שערי מיון (sorting gates) לטווחים שונים של גדלי משקעים במערכות שונות של פטריות סיביות.
- מוגבל על ידי הצורך באופטימיזציה של קצבי הזרימה והגדרות הסף לזיהוי מדויק של משקעים.
