מיון של Streptomyces פלטות ניידים באמצעות אובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן

המטרה הכוללת של הליך זה היא למיין כדורי תפטיר הנוצרים על ידי סטרפטומיצס חוטי לפי גודל, באמצעות ציטומטר זרימה של חלקיקים גדולים COPA. זה מושג תחילה על ידי גידול ודגימה לאחר מכן של זן החיידקים הרצוי. בשלב השני, מתח הדגימה נמדד על ידי קופה.

לאחר מכן הנתונים מנותחים בסיליקו וכדורי התפטיר ממוינים לפי פרמטרים המוגדרים על ידי המשתמש. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בניתוחים אלה כדי לאפיין עוד יותר את ההטרוגניות של גודל הגלולה. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו לסטרפטומיצס, ניתן ליישם אותה גם על אורגניזמים אחרים כגון פטריות חוטיות, מה שמדגים את ההליך הזה יהיה MaRous Petrus, דוקטורנט מהמעבדה שלנו.

ראשית, גדלו את התרביות על ידי הוספת 100 מיליליטר תמצית שמרים, מדיום תמצית מאלט ו-0.2 מיליליטר של 2.5 מגנזיום כלוריד מולארי לבקבוק ארלנמאייר סטרילי אחד של 250 מיליליטר, מצויד בקפיצי מתכת מפותלים לכל דגימת חיידקים. לאחר מכן יש לחסן כל בקבוק באחת כפול 10 לשמונת נבגי הסטרפטומיצס כדי לקבל ריכוז נבגים של אחד כפול 10 לששת הנבגים למיליליטר ולגדל את החיידקים ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-180 סל"ד. לאחר יומיים, השתמש בפיפטה סטרילית של חמישה מיליליטר כדי לאסוף דגימה של חמישה מיליליטר מכל תרבית תוך ניעור עדין של הבקבוק כדי לפזר את התאים באופן שווה.

לאחר מכן חלק כל דגימה לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר. כדי להעריך את הדגימות על ידי ניתוח קופוס, ודא שמחשב משאבת הקופוס פלוס ולייזר ארגון 488 ננומטר מופעלים, ולאחר מכן פתח את תוכנת המקור הביולוגי. ודא שבקבוק נוזל המעטפת מלא ושבקבוק הפסולת ריק ולאחר מכן לחץ על התחל והפעל.

כדי להעביר את לייזר ארגון 488 ננומטר ממצב המתנה למצב מופעל לאחר כ-60 שניות, הלייזר יהיה מוכן. לחץ, בוצע ולאחר מכן בדוק את מדי הלחץ. לחץ על תיבת הסימון לצד לחץ.

אוקיי, ולאחר מכן לאחר שהמערכת מפעילה את תא הזרימה, אשר שהגדרת ההשהיה היא ב-11 ושהרוחב הוא בשבע. הגדר את הסף ל-50 עבור האות ו-40 עבור זמן הטיסה המינימלי. לאחר מכן הסר את שאריות המים מכוס הדגימה.

הוסף כ -50 מיליליטר PBS, ולאחר מכן הוסף 0.1 מיליליטר מאחת מדגימות הסטרפטוקוס לכוס. ודא שהגביעונית סגורה כראוי ולאחר מכן לחץ על השג כדי להתחיל לאסוף נתונים. נהל את מהירות הזרימה כדי להשיג בין 30 ל-50 אירועים בשנייה כאשר נאספו לפחות 2,500 אירועים.

לחץ, עצור ולאחר מכן אחסן כדי לשמור את הנתונים לניתוח סטטיסטי עוקב כדי למיין כדורי חיידקים עבור כל דגימה. ראשית יש להגדיר מגבלות מיון ולהזין פרטים על זמן הטיסה המינימלי והמקסימלי. לחלופין, בחר אזורים ולאחר מכן הגדר אזור שער כדי ליצור אזור לבחירת הכדורים עם הממדים והמאפיינים הרצויים.

הנח צינור של 50 מיליליטר כדי לאסוף את הכדורים העומדים בפרמטרי המיון. לאחר מכן הגדר את מספר הכדורים למיון ולחץ על מיין ידנית כדי למיין עבור הפרמטרים שנבחרו. לאחר המיון, הסר את שאריות הדגימה ושטוף את הדגימה במים פעמיים.

לפני כיבוי הקופוס, נקו את הדגימה עם 70% אתנול. כעת הפעל את המערכת פעמיים. פעם אחת עם מים עם כלור ופעם עם מים רגילים, ואז רוקן את מיכל הגלישה לאחר הניקוי, לחץ על עצור כדי לשחרר את הלחץ מהמערכת.

כאשר המנוע נעצר, סגור את התוכנית ולחץ על כיבוי מבלי לנקות. לאחר מכן כבה את המחשב, את הקופה, הלייזר ואת המשאבה סטרפטומיצס. כדורי תפטיר ותרביות נוזליות בעלות מגוון רחב של גדלים.

כדי לנתח את התפלגות גודל הגלולה, תרבית צבע סטרפטומיצס סילה בת יומיים שגדלה בנוזל עברה ציטומטריה של זרימת חלקיקים גדולים באמצעות פרופיל קופוס פלוס המצויד בזרבובית של מילימטר אחד. כאן, מוצגת תרשים פיזור טיפוסי של פלט קופוס. ציר ה-x מייצג את זמן הטיסה.

ככל שהערעור גדול יותר, כך לוקח יותר זמן לעבור את קרן הלייזר. ציר ה-Y מציין את ההכחדה, המייצגת את הצפיפות האופטית של האובייקט, כל נקודה בכדור מתאים לכדור בודד העובר דרך קרן הלייזר. התוויית נקודות הנתונים להיסטוגרמה, הצביעה על כך שהגדלים ממדגם מייצג זה לא היו מחולקים בדרך כלל.

נראה שהחלוקה מוטה ליומן הימני. שינוי מערך הנתונים גם לא הוביל להתפלגות נורמלית כדי להעריך אם ניתן להסביר את התפלגות הגודל על ידי הנחת תערובת של שתי התפלגויות נורמליות, הנתונים עוצבו מתמטית. המודלים אכן הצביעו על אוכלוסייה של כדורים קטנים המהווה 92% מכלל הכדורים בגודל ממוצע של 248 מיקרומטר, ואוכלוסייה של כדורים גדולים המהווה 8% מכלל הכדורים בגודל ממוצע של 319 מיקרומטר.

כאן מוצג ניתוח מייצג של מושבות מיקרו ממוינות מאוכלוסיות הכדורים הגדולות והקטנות. גדלי הגלולות הממוצעים של שתי האוכלוסיות שימשו להגדרת גבולות המיון כדי להגביל את מיון הכדוריות מהחלק החופף של שתי התפלגות הגדלים כדוריות קטנות מ-248 מיקרומטר נחשבו לאוכלוסיית הכדורים הקטנים, בעוד שכדורים גדולים מ-319 מיקרומטר נחשבו לאוכלוסיית הגלולות הגדולה. ניתוח מיקרוסקופי של הכדורים הממוינים אישר את גודלם המובהק בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף הדור הבא או פרוטאומיקה כדי לחשוף את המנגנונים הבסיסיים של הטרוגניות זו.