מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב

המטרה הכוללת של שימוש בתוכנה לניתוח תמונות ובביולוגיה התפתחותית היא השגת נתונים כמותיים עבור מודלים מכניסטיים של תהליכים ביולוגיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון כיצד ניתן לנתח באופן כמותי פנוטיפים של מוטנטים? היתרון המרכזי של מתודולוגיה זו הוא שהיא מעניקה לחוקרים את היכולת לזהות שינויים בתהליכים ביולוגיים ובתופעות התפתחותיות באופן בלתי מוטה.

למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי להפיק תובנות לגבי ההתפתחות והמורפוגנזה של sea elegance, ניתן להחיל אותה גם על אורגניזמי מודל אחרים כגון josepha. את שחזור צורת התא באמצעות IOD תדגים CINA Leman, סטודנטית לדוקטורט במעבדתי. לאחר התקנת תוכנית IM MOD, פתחו את ה-eunuch shell והקלידו Im mod בחלון ה-IM mod. בחרו את הקובץ עם נתוני הגלם המתאימים שמהם תיווצר דגם תלת-ממדי, והשתמשו בחלון המידע כדי לאתר את החלק התחתון והעליון של האובייקטים בחלון ה-zap.

בחלון המידע, סמנו שוב את קווי המתאר של התאים על ידי יצירת קונטור ראשון במישור העליון של כל תא, תוך הקפדה על יצירת אובייקט חדש עבור כל תא. לאחר מכן, גללו מטה בציר Z וצרו קונטור חדש עבור כל מישור Z, וביצירה זו צרו אובייקט חדש עבור כל תא. לאחר סימון מספר תאים המתאים למודל, פתחו את חלון תצוגת המודל כדי לבחון את האובייקטים ואת הקונטורים שלהם.

לאחר מכן, בסרגל הכלים של תצוגת המודל (model view), בחרו בעריכה (edit) ובאובייקטים (objects). ייפתח חלון העריכה המתאים כדי למדל את כל התאים כאובייקטים מלאים וסגורים. בחרו ברשת (mesh) כסוג נתוני השרטוט ובמילוי (fill) כסגנון השרטוט.

לחצו על meshing וסמנו את האפשרות cap. לאחר מכן, בחרו את כל האובייקטים הדרושים ולחצו על mesh. התוכנה תייצר אובייקטים מוצקים מערי המתארים (contours).

שנו את קנה מידה Z בחלון התצוגה כדי להתאים את פקטור דגימת ה-Z לפי הצורך. לאחר מכן, תחת תפריט העריכה (edit), בחרו בתצוגה (view) כדי לסובב את האובייקטים התלת-ממדיים, ושמרו תצלומי מסך (snapshots) או סרטונים של התאים כמידת הצורך כדי לעקוב אחר אובייקטים מהקלטות פלואורסצנטיות של צילום רב-זמני (time-lapse). השתמשו תחילה ב-NDR כדי להמיר את הנתונים הגולמיים לקובץ TIFF.

לאחר מכן פתח את הקובץ. ב-end drop, בחר באייקון של התצוגה הדו-ממדית (2D viewer) ולחץ על אייקון התאמת הטווח (fit range) כדי להתאים את ההיסטוגרמה תחת תפריט הנתונים (data menu).

בחר קובץ, שם, תמונה, סט, ערוץ, והגדר רזולוציית X, Y, Z והזן את ערכי ה-X, Y ו-Z. כדי לסמן את הגרעינים, עבור למישור הרלוונטי ובחר שוב בצופה ה-2D. לאחר מכן בחר lineage מהתפריט הנפתח ובחר new lineage.

לחצו וגררו על הגרעין שבו אתם מעוניינים כדי לסמן אותו. לאחר מכן, לחצו לחיצה ימנית על הגרעין ובחרו באפשרות rename particle. מהתפריט הנפתח, הזינו שם לחלקיק ולאחר מכן גררו את סמל החץ כדי לשנות את קוטר המעגל.

בשלב הבא, לחצו על האייקון הימני כדי לסמן את המישור המרכזי של הגרעין. לאחר מכן, כדי להתקדם בזמן ובמישור, בחרו את אפשרויות ה-frame וה-Z בסרגל הכלים התחתון והתאימו את המיקום או את גודל העיגול המסמן את הגרעין בהתאם, עד לחלוקת התא הנעקב. כאשר נצפית חלוקת תא, סמנו את גרעיני הבת ולחצו על אייקון החלונות כדי לעבור לתצוגת השושלת (lineage).

על הצופה לסמן את שלושת הגרעינים בו-זמנית ולבחור ב-"associate parent" תחת אפשרות השושלת (lineage). לאחר שכל התאים יעקבו, יש ללחוץ על שם הקובץ ולעבור לערוץ. סימון השאריות של חלוקת התא לצורך ניתוח כמותי של זרימה קורטיקלית באמצעות תוכנת סימטריה של מהירות תמונת חלקיקים (particle image velocity symmetry software).

טענו את קבצי התמונה החדשים ב-pif lab ובחרו את סגנון הרצף. 1, 2, 2, 3. לאחר מכן, נווטו לספרייה המכילה את רצף התמונות הרצויות.

בחרו את התמונות ולחצו על הוספה (add) כדי לייבא את התמונות. לאחר מכן, תחת הגדרות ניתוח (analysis settings), בחרו בהחרגות (exclusions). השתמשו בכפתור מסכת ROI (ROI mask).

שרטטו מסכות עבור הפריים הנוכחי כדי להשבית את החלק הבלתי רצוי של התמונות תחת הגדרות הניתוח. שוב, בחרו את הגדרות ה-PIF ובחרו ב-fast Fourier transformation window deformation כאלגוריתם ה-PIF הרצוי. עבור מעבר ראשון, הזינו ערך של 64 pixels לאזור התשאול עם צעד של 32 למעבר השני.

הזינו ערך של 32 פיקסלים לאזור התחקור (interrogation area) עם צעד של 16. לאחר מכן, בחרו באפשרות linear מהתפריט הנפתח של עיוות החלון (window deformation) ובחרו בשיטת Gaussian two by three point להערכת הסטה בתת-פיקסל. כעת, בחרו ב-analyze מתפריט הניתוח (analysis menu) ובחרו ב-analyze all frames post-processing, בחרו ב-vector validation מתפריט עיבוד לאחר הבדיקה (post-processing menu) והחילו סף מסנן של סטיית תקן של שבעה לכל הפריימים מתוך תפריט הגרפים (plot menu).

בחרו פרמטרים נגזרים. שנו את הנתונים, ולאחריהם את הווקטורים, את מספר הפיקסלים לפריים, והתאימו את רמת החלקות של הווקטורים ואת מסנן התדרים הגבוהים (high pass filter). לאחר החלת התאמות אלו על כל הפרייםים, הגדירו את הפרייםים בשימוש מאחד עד הסוף.

לבסוף, לחצו על כפתור calculate mean vectors כדי למדוד את הווקטורים הממוצעים של כל הפריימים המתמקדים בכיפוף של הגונדה של בוגרי C elegance מסוג wild type שצולמו כפי שהודגם הרגע. מודל תלת-ממדי של תאי הנבט נוצר מנתוני המיקרוסקופיה, המאפשר ניתוח של השינויים בגודל התאים המתרחשים בזמן שהתאים עוברים מהזרוע הדיסטלית לזרוע הפרוקסימלית של ה-cus באמצעות מיקרוסקופיה של צילום רצף בזמן (time-lapse) בשני צבעים. המודלים שהתקבלו באמצעות חלבוני היתוך של היסטון ומיאוזין שאינו של השריר ב-NDR ממחישים את התבנית הסטריאוטית של חלוקת תאים וירושה של שאריות.

יתרה מכך, מנתוני הקווים, ניתן להפיק בניסוי זה את המסלולים עבור כל תא L ושארית של חלוקת תא, ואת המתאם לתזמון חלוקת התא. ביצעו מיקרוסקופיית time-lapse לטווח קצר ברזולוציה זמנית גבוהה של cortical non-muscle myosin two כדי להעריך הבדלים בדינמיקה של זרימה מקטבת קורטיקלית ביןו Embryos מסוג wild type לבין Embryos שבהם נושל ה-row gtpa activating protein RGA three, כפי שצפוי. הזרימה ב-Embryos מסוג wild type הייתה בעיקר לאורך הציר הארוך של ה-embryo.

בעוד שהזרימה בעובר RGA בעל הפרעה ל-RNA הייתה ניצבת לציר זה, כפי שניתן לראות בקלות מניתוח ה-PIP. ברגע שנשלטת הפעולה, ניתן לבצע פלגומנטציה ידנית של עצמים מורכבים ומעקב אחר תאים במהלך ההתפתחות העוברית בתוך מספר שעות אם הדבר נעשה כהלכה, בעת ניסיון לבצע מעקב אחר תאים ועצמים. חשוב לזכור להגדיר רזולוציה זמנית מתאימה כדי לא לאבד את העצם במהלך הניתוח באמצעות שלושת הכלים המתוארים כאן.

ניתן לבצע גם ניתוח סטטיסטי כדי לענות על שאלות הנוגעות לשונות או פשוט כדי להשוות בין עוברים שונים. הטמעת תוכנה לניתוח כמותי של תמונות מאפשרת לנו ולביולוגים התפתחותיים אחרים לחקור מנגנונים מורפוגנטיים של התפתחות ברמת פירוט חסרת תקדים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להחזיק בהבנה טובה לגבי השימוש במערך מגוון של כלי תוכנה לביצוע ניתוח כמותי של תמונות.