Name: מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב C. elegans שימוש בכלי קוד פתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: חקור מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב-C. elegans באמצעות כלי קוד פתוח. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של פנוטיפים מוטנטיים ומודלים תלת-ממדיים של תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין מה לחשוף.

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+cell+lineages+originate+in+the+gastrula+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish.</a> Science. 231 (4736), 365-368 (1986).</li>
<li>Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+in+ascidian+embryos+by+intracellular+injection+of+a+tracer+enzyme.+III.+Up+to+the+tissue+restricted+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage.</a> Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+plant+growth+in+4D%3A+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).</li>
<li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li>
<li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li>
<li>Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+inference+of+systems-level+mechanistic+models+of+development+from+live-imaging-based+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis.</a> Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).</li>
<li>Amat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+accurate+reconstruction+of+cell+lineages+from+large-scale+fluorescence+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data.</a> Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).</li>
<li>He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).</li>
<li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+rotational+cortical+flow%2C+asymmetric+midbody+positioning%2C+and+spindle+rotation+mediates+dorsoventral+axis+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans.</a> Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).</li>
<li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+function+for+the+midbody+remnant+in+embryonic+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A function for the midbody remnant in embryonic patterning.</a> Commun. Integr. Biol. 7, e28533(2014).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endrov%3A+an+integrated+platform+for+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Endrov: an integrated platform for image analysis.</a> Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).</li>
<li>Thielicke, W., Stamhuis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIVlab+-+Towards+User-friendly%2C+Affordable+and+Accurate+Digital+Particle+Image+Velocimetry+in+MATLAB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Open+Research+Software%22%5BJournal%5D)">PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB.</a> Journal of Open Research Software. 2 (1), e30(2014).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), e53419(2013).</li>
<li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li>
<li>Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+GTPase-activating+proteins+RGA-3+and+RGA-4+are+required+to+set+the+initial+size+of+PAR+domains+in+Caenorhabditis+elegans+one-cell+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).</li>
<li>Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+novel+RhoGAP+proteins+RGA-3+and+RGA-4+in+the+germ+line+and+in+the+early+embryo+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans.</a> Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).</li>
<li>Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+torque+generation+by+the+actomyosin+cell+cortex+drives+left-right+symmetry+breaking%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking.</a> Elife. 3, e04165(2014).</li>
<li>Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+specification+of+the+embryonic+lineage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).</li>
<li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cell+sorting+in+the+C.+elegans+embryo+defines+a+new+mechanism+for+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation.</a> Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).</li>
<li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li>
<li>Giurumescu, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).</li>
<li>Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan+defines+precise+spindle+orientation+by+modulating+Wnt+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans.</a> Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).</li>
<li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope%3A+variability+of+development+and+regional+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).</li>
</ol>

המחקר במעבדה ל-CP ממומן על ידי ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; FOR 1756) ורשתות יוביקוויטין של אשכול המחקר LOEWE. CP נתמך גם על ידי תוכנית המסגרת של האיחוד האירופי 7 (Marie Curie Actions Project 326632).

באמצעות מעקב אחר אובייקט בפיתוח, במעקב גרעיני מסוים, זה כבר אפשרי להבהיר מנגנוני דפוסים מרכזיים של ג elegans עובר 1,23,24. הרחבת אסטרטגיה זו לתפוקה גבוהה יותר, זה כבר אפשרי לאחרונה לחשוף כללי דפוסים נוספים ולהציע שיטה איך להסיק דפוסים שולטת דה נובו 10. למוטציות רבות, עם זאת, פגמי דפוסים המדויקים עדיין אינם ידועים. השיטות שתוארו כאן הן כלים שיכולים להיות אינסטרומנטלי בהבהרתם. חשוב לציין, זה הפך להיות ברור בשנים האחרונות שלמרות שרבי מערכות מוד...

עם השיפורים מתמידים של חלבוני ניאון, הנדסה גנטית, מיקרוסקופ אור, ורך מחשב וחומרה, עכשיו זה אפשרי להקליט פיתוח של אורגניזמים מודל רבים ברזולוציה מרחב ובזמן חסרת תקדים. הדבר מאפשר לחוקרים לשאול שאלות שלא ניתן לטפל בעבר או לבקר תהליכים התפתחותיים ידועים כדי לחפש את היבטים התעלמו. התקדמות זו עוררה את תחום הביולוגיה התפתחותית כמותיים, שמטרתה להפוך את הדגמים איכותיים, פורמליים למודלים כמותיים על ידי מדידות יסודיות וניתוחים סטטיסטיים. תאי מעקב ומבני subcellular הפכו אותו ניתן להפיק מודלים כמותיים של התפתחות עוברית, פעילות מערכת עצבים, או תא חלוקה 1-12. על ידי מעקב אחר שרידי חלוקת התא במהלך ההתפתחות המוקדמת של ג עובר elegans, אנו יכולים לחשוף לאחרונה שהם בצעו סטריאוקיטוב חשוב הקליד נתיב ומהווה גורמי 13,14. הנה, פרוטוקולים מוצגים שהופכים את הביולוגיה התפתחותית כמותיים גישות נגישות לאינם מומחים. המוקד נמצא על שלושה כלים ישר קדימה, זמינים באופן חופשי כי הם ישימים בכל מעבדה יש ​​לו גישה למיקרוסקופיה confocal סטנדרטית ומחשבים. אלה כוללים פרוטוקול כדי ליצור צורות תא 3D, פרוטוקול כדי לעקוב אחר שרידי חלוקת תא, ופרוטוקול לתאר כמותית דינמיקת actomyosin קליפת המוח. נמטודות ג elegans משמש כמקרה למופת, לעומת זאת, השיטות וכלים שנדונו כאן הם מתאימות למגוון רחב של שאלות במודלים אחרים ביולוגיים, למשל, תאים בתרבית, explants רקמות, organoids או spheroids, עוברים אחרים, וכו &#39; בדרך כלל, חלק מהניתוחים המוצגים כאן יכול גם להתבצע עם ImageJ כלי הקוד פתוח הפופולרי (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; או פיג&#39;י, &quot;הסוללות כלולות&quot; גרסה של ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) שלתוספים רבים לניתוחים כמותיים שונים זמינים. עם זאת, התוכניות שנדונו כאן נועדו להתמודד עם בעיות ספציפיות. ראשית, IMOD, עיבוד תמונה, דוגמנות וחבילת תצוגה יכולים לשמש לשחזורי 3D סעיפים סדרתי מאלקטרון או מיקרוסקופ אור 15. IMOD מכיל גם כלים להצגת נתוני 3D מכל כיוון. שנית, Endrov, תכנית Java נועדה לבצע ניתוח תמונה, עיבוד נתונים, וביאור של רשתות או רצועות (בין יתר) על בסיס ארכיטקטורת תוסף מורחב, עם תאימות תוסף ImageJ 16. הוא מכיל מעל 140 פעולות עיבוד תמונה וממשק משתמש להרחבה שבמודל והנתונים גולמיים מוצגים בנפרד. ניתן למצוא את קוד המקור שלה בhttps://github.com/mahogny/Endrov. שלישית, PIVlab, Mכלי ATLAB לvelocimetry תמונת חלקיק דיגיטלי המאפשר למשתמש כמותית ואיכותי לנתח זרימת חלקיקי שדות 17. השימוש בתוכניות זה טעון רישוי MATLAB הכולל עיבוד תמונת ארגז כלים (http://mathworks.com). PIVlab היא תכנית שנועדה לתאר זרימת כמותית. היא מחשבת את חלוקת מהירות, גודל, ערבוליות, סטייה, או הגזירה בתוך זוגות תמונה או סדרה. לשם כך, בין-קורלציה אזורים קטנים של תמונות (&#39;עובר&#39; בשם בסעיף הפרוטוקול) של צמד תמונה לגזור את עקירת חלקיקים הסבירה ביותר. חוצה קשר זה מניב מטריצת מתאם שניתן לנתח בתחום החלל או תדירות או באמצעות מתאם צולב ישיר או שינוי פורייה מהיר (FFT), בהתאמה. הציוד המשמש כאן הוא מיקרוסקופ הפוך מצויד בניפקוב (&quot;ספינינג&quot;) דיסק, EMCCD, 488 ומוצק 561 ננומטר סטנדרטילייזרים של מצב, ו20x אוויר או 40x או 60x תכנית / Apochromat מטרות נפט או מים טבילה. עם זאת, אפשר גם לבצע הדמיה הזמן לשגות עם שיטות הדמיה אחרות, למשל, על נקודה, סכן למעשה או מיקרוסקופיה גיליונות סריקה מבוססת לייזר, מיקרוסקופיה רב-פוטון, כמו גם במיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית בשילוב עם deconvolution או מובנה תְאוּרָה. היתרון של שימוש במערכת דיסק ניפקוב הוא רכישת תמונה מאוד מהר, במיוחד אם מצב הזרמה (תנועה וסריקה של האובייקט בממד z רציף) זמין. בנוסף, כדי לשפר את הרזולוציה, ניתן להשתמש במאריך מגדלת פי 1.5 מול EMCCD.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Motic/VWR</td><td>OT4005S</td><td>מיקרוסקופ סטריאו לדיסקציה והרכבה</td></tr><tr><td>של מיקרוספירות פוליסטירן פוליחרוזים,&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>18329</td><td>הרכבה של עוברים</td></tr><tr><td>20 ומיקרו; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוספירות פוליסטירן פוליסטירן,&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>876</td><td>בעלי חיים בוגרים הרכבה</td></tr><tr><td>0.1 ומיקרו; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>VWR</td><td>631-0902</td><td>הרכבה לבעלי חיים בוגרים</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית 18x18 מ"מ</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td>הרכבה לעובר/מבוגר</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי 24x60 מ"מ</td><td>VWR</td><td>631-1339</td> אזמל <td>הרכבה לעובר</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>233-5455</td><td>נתיחת עובר</td></tr><tr><td>צינורות סיליקון</td><td>VWR</td><td>228-1501</td><td>צינורות לפיפטה</td></tr><tr><td>פה 30 מ"מ PTFE ממברנה מסנן</td><td>NeoLab</td><td>Jul-01</td><td>מסנן לפיפטה</td></tr> פה <tr><td>צינורות נימיים</td><td>VWR</td><td>621-0003</td><td>קצה פיפטה לפיפטה פה</td></tr><tr><td>וזלין</td><td></td><td>רוט E746.1</td><td>עובר/מבוגר הרכבה</td></tr><tr><td>אגר</td><td>רוט</td><td>5210.5</td><td>בעלי חיים בוגרים הרכבה</td></tr><tr><td>אשלגן-די-הידרוגנפוספט</td><td>רוט</td><td>P018.2</td><td>M9 מאגר</td></tr><tr><td>די-נתרן-מימן פוספט</td><td>רוט</td><td>P030.2</td><td>M9 מאגר</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>רוט</td><td>3957.1</td><td>M9 מאגר</td></tr><tr><td>VisiScope מסתובב דיסק קונפוקלי</td><td>מערכות Visitron n</td><td>/a</td><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית</td></tr></tbody></table>

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; c. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

כמותית לכידת תהליכים התפתחותיים היא חיונית כדי להפיק מודלים ומפתח מכניסטית לזהות ולתאר פנוטיפים מוטציה. כאן פרוטוקולים מוצגים להכנת עוברים וג הבוגר elegans בעלי חיים למיקרוסקופיה זמן לשגות טווח קצר וארוך ושיטות למעקב וכימות של תהליכים התפתחותיים. כל השיטות שהוצגו מבוססות על ג זנים זמינים במרכז לגנטיקת Caenorhabditis ועל תוכנת קוד פתוח elegans שניתן ליישם בקלות בכל מעבדה עצמאית של מערכת מיקרוסקופיה בשימוש. בנייה מחדש של מודל תא-צורת 3D באמצעות IMOD תוכנת דוגמנות, (velocimetry תמונה דיגיטלי חלקיקים זמן נפתר מעקב ידני של מבני subcellular fluorescently שכותרתו באמצעות התכנית רב תכליתי ניתוח תמונת Endrov, וניתוח של זרימת התכווצות בקליפת המוח באמצעות PIVlab כלי לMATLAB) מוצג. הוא דן כיצד גם ניתן לפרוס שיטות אלה לאo ללכוד כמותית תהליכים התפתחותיים אחרים בדגמים שונים, לדוגמא, מעקב תא ושושלת ההתחקות, מעקב של זרימת שלפוחית.

על ידי שימוש בפרוטוקולים 2, 3, ו -4, הזמן לשגות הדמיה של בלוטות מין בג הסוג בר elegans מבוגרים מתבצע (OD58 מתח (UNC-119 () III ed3; ltIs38 [pAA1; עוגה-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)]), מבטא את סמן קרום מאמרגן germline ). התמקדות בתור של בלוטת המין, מודל 3D של תאי הנבט נוצר מנתונים מיקרוסקופ (איור 2). מודל זה מאפשר לנתח שינויים בגודל תא בזמן מעבר התאים יוצר דיסטלי הזרוע הפרוקסימלית, חושף את הארגון של rachis והגודל של אנשי הקשר של תאים ב...

כאן מוצג כיצד לעקוב ולכמת תהליכי התפתחות ב-C. elegans. השיטות המוצגות מבוססות על כלי קוד פתוח הניתנים ליישום בקלות. הוא מודגם כיצד לשחזר מודלים תלת מימדיים בצורת תא, כיצד לעקוב באופן ידני אחר מבנים תת-תאיים וכיצד לנתח זרימת התכווצות קליפת המוח.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

המטרה הכוללת של שימוש בתוכנה לניתוח תמונות ובביולוגיה התפתחותית היא השגת נתונים כמותיים עבור מודלים מכניסטיים של תהליכים ביולוגיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון כיצד ניתן לנתח באופן כמותי פנוטיפים של מוטנטים? היתרון המרכזי של מתודולוגיה זו הוא שהיא מעניקה לחוקרים את היכולת לזהות שינויים בתהליכים ביולוגיים ובתופעות התפתחותיות באופן בלתי מוטה.למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי להפיק תובנות לגבי ההתפתחות והמורפוגנזה של sea elegance, ניתן להחיל אותה גם על אורגניזמי מודל אחרים כגון josepha. את שחזור צורת התא באמצעות IOD תדגים CINA Leman, סטודנטית לדוקטורט במעבדתי. לאחר התקנת תוכנית IM MOD, פתחו את ה-eunuch shell והקלידו Im mod בחלון ה-IM mod. בחרו את הקובץ עם נתוני הגלם המתאימים שמהם תיווצר דגם תלת-ממדי, והשתמשו בחלון המידע כדי לאתר את החלק התחתון והעליון של האובייקטים בחלון ה-zap.בחלון המידע, סמנו שוב את קווי המתאר של התאים על ידי יצירת קונטור ראשון במישור העליון של כל תא, תוך הקפדה על יצירת אובייקט חדש עבור כל תא. לאחר מכן, גללו מטה בציר Z וצרו קונטור חדש עבור כל מישור Z, וביצירה זו צרו אובייקט חדש עבור כל תא. לאחר סימון מספר תאים המתאים למודל, פתחו את חלון תצוגת המודל כדי לבחון את האובייקטים ואת הקונטורים שלהם.לאחר מכן, בסרגל הכלים של תצוגת המודל (model view), בחרו בעריכה (edit) ובאובייקטים (objects). ייפתח חלון העריכה המתאים כדי למדל את כל התאים כאובייקטים מלאים וסגורים. בחרו ברשת (mesh) כסוג נתוני השרטוט ובמילוי (fill) כסגנון השרטוט.לחצו על meshing וסמנו את האפשרות cap. לאחר מכן, בחרו את כל האובייקטים הדרושים ולחצו על mesh. התוכנה תייצר אובייקטים מוצקים מערי המתארים (contours).שנו את קנה מידה Z בחלון התצוגה כדי להתאים את פקטור דגימת ה-Z לפי הצורך. לאחר מכן, תחת תפריט העריכה (edit), בחרו בתצוגה (view) כדי לסובב את האובייקטים התלת-ממדיים, ושמרו תצלומי מסך (snapshots) או סרטונים של התאים כמידת הצורך כדי לעקוב אחר אובייקטים מהקלטות פלואורסצנטיות של צילום רב-זמני (time-lapse). השתמשו תחילה ב-NDR כדי להמיר את הנתונים הגולמיים לקובץ TIFF.לאחר מכן פתח את הקובץ. ב-end drop, בחר באייקון של התצוגה הדו-ממדית (2D viewer) ולחץ על אייקון התאמת הטווח (fit range) כדי להתאים את ההיסטוגרמה תחת תפריט הנתונים (data menu).בחר קובץ, שם, תמונה, סט, ערוץ, והגדר רזולוציית X, Y, Z והזן את ערכי ה-X, Y ו-Z. כדי לסמן את הגרעינים, עבור למישור הרלוונטי ובחר שוב בצופה ה-2D. לאחר מכן בחר lineage מהתפריט הנפתח ובחר new lineage.לחצו וגררו על הגרעין שבו אתם מעוניינים כדי לסמן אותו. לאחר מכן, לחצו לחיצה ימנית על הגרעין ובחרו באפשרות rename particle. מהתפריט הנפתח, הזינו שם לחלקיק ולאחר מכן גררו את סמל החץ כדי לשנות את קוטר המעגל.בשלב הבא, לחצו על האייקון הימני כדי לסמן את המישור המרכזי של הגרעין. לאחר מכן, כדי להתקדם בזמן ובמישור, בחרו את אפשרויות ה-frame וה-Z בסרגל הכלים התחתון והתאימו את המיקום או את גודל העיגול המסמן את הגרעין בהתאם, עד לחלוקת התא הנעקב. כאשר נצפית חלוקת תא, סמנו את גרעיני הבת ולחצו על אייקון החלונות כדי לעבור לתצוגת השושלת (lineage).על הצופה לסמן את שלושת הגרעינים בו-זמנית ולבחור ב-"associate parent" תחת אפשרות השושלת (lineage). לאחר שכל התאים יעקבו, יש ללחוץ על שם הקובץ ולעבור לערוץ. סימון השאריות של חלוקת התא לצורך ניתוח כמותי של זרימה קורטיקלית באמצעות תוכנת סימטריה של מהירות תמונת חלקיקים (particle image velocity symmetry software).טענו את קבצי התמונה החדשים ב-pif lab ובחרו את סגנון הרצף. 1, 2, 2, 3. לאחר מכן, נווטו לספרייה המכילה את רצף התמונות הרצויות.בחרו את התמונות ולחצו על הוספה (add) כדי לייבא את התמונות. לאחר מכן, תחת הגדרות ניתוח (analysis settings), בחרו בהחרגות (exclusions). השתמשו בכפתור מסכת ROI (ROI mask).שרטטו מסכות עבור הפריים הנוכחי כדי להשבית את החלק הבלתי רצוי של התמונות תחת הגדרות הניתוח. שוב, בחרו את הגדרות ה-PIF ובחרו ב-fast Fourier transformation window deformation כאלגוריתם ה-PIF הרצוי. עבור מעבר ראשון, הזינו ערך של 64 pixels לאזור התשאול עם צעד של 32 למעבר השני.הזינו ערך של 32 פיקסלים לאזור התחקור (interrogation area) עם צעד של 16. לאחר מכן, בחרו באפשרות linear מהתפריט הנפתח של עיוות החלון (window deformation) ובחרו בשיטת Gaussian two by three point להערכת הסטה בתת-פיקסל. כעת, בחרו ב-analyze מתפריט הניתוח (analysis menu) ובחרו ב-analyze all frames post-processing, בחרו ב-vector validation מתפריט עיבוד לאחר הבדיקה (post-processing menu) והחילו סף מסנן של סטיית תקן של שבעה לכל הפריימים מתוך תפריט הגרפים (plot menu).בחרו פרמטרים נגזרים. שנו את הנתונים, ולאחריהם את הווקטורים, את מספר הפיקסלים לפריים, והתאימו את רמת החלקות של הווקטורים ואת מסנן התדרים הגבוהים (high pass filter). לאחר החלת התאמות אלו על כל הפרייםים, הגדירו את הפרייםים בשימוש מאחד עד הסוף.לבסוף, לחצו על כפתור calculate mean vectors כדי למדוד את הווקטורים הממוצעים של כל הפריימים המתמקדים בכיפוף של הגונדה של בוגרי C elegance מסוג wild type שצולמו כפי שהודגם הרגע. מודל תלת-ממדי של תאי הנבט נוצר מנתוני המיקרוסקופיה, המאפשר ניתוח של השינויים בגודל התאים המתרחשים בזמן שהתאים עוברים מהזרוע הדיסטלית לזרוע הפרוקסימלית של ה-cus באמצעות מיקרוסקופיה של צילום רצף בזמן (time-lapse) בשני צבעים. המודלים שהתקבלו באמצעות חלבוני היתוך של היסטון ומיאוזין שאינו של השריר ב-NDR ממחישים את התבנית הסטריאוטית של חלוקת תאים וירושה של שאריות.יתרה מכך, מנתוני הקווים, ניתן להפיק בניסוי זה את המסלולים עבור כל תא L ושארית של חלוקת תא, ואת המתאם לתזמון חלוקת התא. ביצעו מיקרוסקופיית time-lapse לטווח קצר ברזולוציה זמנית גבוהה של cortical non-muscle myosin two כדי להעריך הבדלים בדינמיקה של זרימה מקטבת קורטיקלית ביןו Embryos מסוג wild type לבין Embryos שבהם נושל ה-row gtpa activating protein RGA three, כפי שצפוי. הזרימה ב-Embryos מסוג wild type הייתה בעיקר לאורך הציר הארוך של ה-embryo.בעוד שהזרימה בעובר RGA בעל הפרעה ל-RNA הייתה ניצבת לציר זה, כפי שניתן לראות בקלות מניתוח ה-PIP. ברגע שנשלטת הפעולה, ניתן לבצע פלגומנטציה ידנית של עצמים מורכבים ומעקב אחר תאים במהלך ההתפתחות העוברית בתוך מספר שעות אם הדבר נעשה כהלכה, בעת ניסיון לבצע מעקב אחר תאים ועצמים. חשוב לזכור להגדיר רזולוציה זמנית מתאימה כדי לא לאבד את העצם במהלך הניתוח באמצעות שלושת הכלים המתוארים כאן.ניתן לבצע גם ניתוח סטטיסטי כדי לענות על שאלות הנוגעות לשונות או פשוט כדי להשוות בין עוברים שונים. הטמעת תוכנה לניתוח כמותי של תמונות מאפשרת לנו ולביולוגים התפתחותיים אחרים לחקור מנגנונים מורפוגנטיים של התפתחות ברמת פירוט חסרת תקדים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להחזיק בהבנה טובה לגבי השימוש במערך מגוון של כלי תוכנה לביצוע ניתוח כמותי של תמונות.

tracking-quantifying-developmental-processes-c-elegans-using-open

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

פתחנו מערכת מיקרוסקופ מעקב וידאו שיעור שיכול להקליט...

מעקב סי אלגנס ומדידת התנהגות

סרטון זה מתאר את השימוש בתוכנת וידאו ומעקב כדי להקליט תנועת תולעים בזירה. הפרוטוקול לדוגמה מודד את ההשפעה של חשיפה לאתנול על תנועת תולעים.

ג. אלגנס מעקב אחר תנועה: שיטה להערכת תנועה בתולעים

שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה...

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

התפשטות דמוית פריון של אגרגטים חלבוניים התגלתה לאחרונה כמעורבת במחלות ניווניות רבות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש בנמטודה C. elegans כמערכת מודל לניטור התפשטות חלבון ולחקירת תופעות דמויות פריון.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

כאן, אנו מציגים מסגרת להתייחס הגבלות תזונתיות מגוון רחב ביטוי גנים ואת תוחלת החיים. אנו מתארים פרוטוקולים עבור הגבלות תזונתיות מגוון רחב, הדמיה כמותית של ביטוי גנים תחת הפרדיגמה הזו. אנחנו עוד חלוקה לרמות ניתוחים חישובית לחשוף שבבסיס תכונות עיבוד המידע של מעגלים גנטי מעורב חישה מזון.

כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב C . elegans

אנו מתארים פרוטוקולים עבור באמצעות פלטפורמת מעקב נמטודות רחב שדה-of-view (WF-NTP), המאפשרת אפיון פנוטיפי תפוקה גבוהה של אוכלוסיות גדולות של Caenorhabditis elegans. פרוטוקולים אלה ניתן לאפיין שינויים התנהגותיים עדינים זנים מוטציה או בתגובה טיפול תרופתי באופן מדרגי במיוחד.

אוטומטיות התנהגותית ניתוח של גדול C. elegans אוכלוסיות שימוש רחב שדה-of-view מעקב פלטפורמה

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

מחקר זה מציג פרוטוקולים עבור שתי גישות ניתוח פעילות לוקומוטור חצי אוטומטי ב C. elegans קומפלקס I מחלות גז-1(fc21) תולעים, כלומר, ZebraLab (בדיקת תפוקה בינונית) ו- WormScan (בדיקה בעלת תפוקה גבוהה) ומספקים ניתוח השוואתי בין מגוון רחב של שיטות מחקר לכימות התנהגות נמטודה ותפקוד עצבי שרירי משולב.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

חקור מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב-C. elegans באמצעות כלי קוד פתוח. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של פנוטיפים מוטנטיים ומודלים תלת-ממדיים של תאים.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב

גלה סרטונים נוספים