Name: ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: למד לבטא, לבודד ולטהר חלבונים ביוטיניליים רקומניים לשימושים בביוטכנולוגיה ורקמות עצב. השיטה משתמשת בכרומטוגרפיית אפיניות לבידוד יעיל של חלבונים מסיסים ובלתי מסיסים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר אוניברסיטת אקרון למימון שתמך בעבודה זו.

<ol><li>Itakura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+a+chemically+synthesized+gene+for+the+hormone+somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin.</a> Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).</li>
<li>Goeddel, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+chemically+synthesized+genes+for+human+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).</li>
<li>Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+nanoscale+mimics+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).</li>
<li>Sengupta, D., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+highly+tunable+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).</li>
<li>Kamionka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+therapeutic+proteins+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).</li>
<li>Rao, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outlook+for+protein+engineering+in+crop+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The outlook for protein engineering in crop improvement.</a> Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+in+designing+tailored+enzymes+and+microorganisms+for+biofuels+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).</li>
<li>Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein+engineering+to+immobilization%3A+promising+strategies+for+the+upgrade+of+industrial+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li>
<li>McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immobilization+of+biotinylated+fusion+proteins+NGF+and+Sema3A+utilizing+a+photo-cross-linkable+diazirine+compound+for+controlling+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension.</a> Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).</li>
<li>Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+differences+between+genome+sequences+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22B+strains+REL606+and+BL21%28DE3%29+and+comparison+of+the+E.+coli+B+and+K-12%22%5BJournal%5D)">Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli.</a> B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novagen+pET+System+Manual%22">Novagen pET System Manual</a>. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).</li>
<li>Balbas, P., Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+pBR322+and+protein+expression+systems+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli.</a> Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Dubendorff, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Tucker, J., Grisshammer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+rat+neurotensin+receptor+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J.%22%5BJournal%5D)">Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli.</a> Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).</li>
<li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+peptide+libraries+to+map+the+substrate+specificity+of+a+peptide-modifying+enzyme%3A+a+13+residue+consensus+peptide+specifies+biotinylation+in+Escherichia+coli%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli).</a> Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li>
<li>Anfinsen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+that+govern+the+folding+of+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles that govern the folding of protein chains.</a> Science. 181 (4096), 223-230 (1973).</li>
<li>Villaverde, A., Carrio, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+in+recombinant+bacteria%3A+biological+role+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies.</a> Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).</li>
<li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).</li>
<li>Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+covalently+modified+hydrogel+blend+of+hyaluronan-methyl+cellulose+with+peptides+and+growth+factors+influences+neural+stem%2Fprogenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate.</a> J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).</li>
<li>Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Differentiation+of+Neural+Stem+Cells+in+Macroporous+Photopolymerizable+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>McCormick, A. M., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regenerative+strategies+incorporating+biomolecular+axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).</li>
<li>Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+biotinylation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput biotinylation of proteins.</a> Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).</li>
<li>Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Protein biotinylation.</a> Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).</li>
<li>Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+origins+of+high-affinity+biotin+binding+to+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin.</a> Science. 243 (4887), 85-88 (1989).</li>
<li>Chen, I., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+proteins+with+small+molecules+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).</li>
<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).</li>
<li>Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+immobilization+of+proteins+using+biotin-+and+GST-based+coupling+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies.</a> Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).</li>
<li>Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+biotin+functionalized+QD+assay+for+determining+available+binding+sites+on+electrospun+nanofiber+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).</li>
<li>Cull, M. G., Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+proteins+in+vivo+and+in+vitro+using+small+peptide+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags.</a> Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).</li>
<li>Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+through+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).</li>
<li>Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Custom+design+of+the+cardiac+microenvironment+with+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials.</a> Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).</li>
<li>Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+degradable+tethers+for+controlled+and+cell-mediated+release+of+nanoparticles+in+2-+and+3-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions.</a> Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).</li>
<li>Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+global+stress+gene+regulation+in+response+to+overexpression+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).</li>
<li>Sivashanmugam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+protocols+for+production+of+very+high+yields+of+recombinant+proteins+using+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli.</a> Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Marston, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purification+of+eukaryotic+polypeptides+synthesized+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli.</a> Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).</li>
<li>de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature+on+protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).</li>
<li>Ventura, S., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).</li>
<li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).</li>
<li>Peternel, S., Komel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+nanomaterial+%28inclusion+bodies%29+from+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells.</a> Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).</li>
<li>Garcia-Fruitos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+bodies%3A+a+new+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact.+9%22%5BJournal%5D)">Inclusion bodies: a new concept.</a> Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).</li>
<li>Li, Y., Sousa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+E.+coli+BirA+biotin+ligase+for+in+vitro+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation.</a> Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הנדסת חלבון רקומביננטי היא טכניקה חזקה מאוד שמשתרעת על פני תחומים רבים. זה חסכוני, מתכונן והליך פשוט יחסית, המאפשר הייצור של תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד. חשוב לציין כי עיצוב ולבטא חלבוני מטרה הוא לא תמיד פשוט. ביטוי בסיסי ויציבות חלבון רקומביננטי תלויה בבחירות ספציפיות של וקטור, E. זני coli תא, שנוספו תג פפטיד ופרמטרי טיפוח. קריטריון העיצוב הספציפי שלנו מנצל א מבוסס היטב coli זנים להנדסת חלבונים. בנוסף, וקטור פלסמיד מכיל אמרגן לא...

חלבונים לכסות טווח רחב של ביומולקולות כי הם אחראים לתפקודים ביולוגיים רבים, סופו של דבר מוביל להיווצרות רקמה תקינה וארגון. מולקולות אלה ליזום אלפי איתות מסלולים השולטים עד ויסות ו / או למטה רגולציה של גנים וחלבונים אחרים, שמירה על שיווי משקל בגוף האדם. שיבוש של חלבון יחיד משפיע על אינטרנט זה שלם של אותות, אשר יכול להוביל להתפרצות של הפרעות או מחלות הרסניות. הנדסת חלבונים בודדים במעבדה מציעה פתרון אחד למאבק בתופעות הלוואי הללו ומציע אלטרנטיבה לתרופות מולקולה קטנות. ב1977, גן מקודד רצף סומטוסטטין חומצת אמין 14 היה אחד מפוליפפטידים הראשונים המהונדסים שנוצרו באמצעות ה coli 1. זמן קצר לאחר מכן בשנת 1979, אינסולין שובט בפלסמיד pBR322, שינה, בא לידי ביטוי, ומטוהר 2. מאז, חלבונים רקומביננטיים הרחיבו את השפעתם לשדות מרובים של מילearch כגון חומרים ביולוגיים, אספקת סמים, הנדסת רקמות, Biopharmaceuticals, חקלאות, אנזימים תעשייתיים, דלק ביולוגי, וכו &#39;(לביקורות לראות אזכור 3-8). זה נובע במידה רבה צדדיות שהטכניקה מציעה באמצעות התוספת של moieties היישום הספציפי הכימי או רצפי חלבונים למטרות כוללים, אך לא מוגבלת, לזיהוי חלבון המטרה, ייצוב וטיהור. באמצעות טכנולוגיית ה-DNA רקומביננטי, יכולים לבוא לידי ביטוי חלבונים רקומביננטיים במגוון רחב של מערכות מארח אוקריוטים פרוקריוטים ובכלל זה, צמח, חרק, שמרים, פטריות, חיידקים או יונקים. כל מארח מציע יתרונות שונים, ובדרך כלל את המערכת הטובה ביותר נקבעה בהתבסס על תפקוד חלבון, תשואה, יציבות, עלות כוללת, ויכולת רחבה. תאי חיידקים לעתים קרובות חסרים את מנגנוני השינוי לאחר translational שמארחי אוקריוטים לספק (כלומר glycosylation, גישור דיסולפיד, דואר<html> TC.) 5. כתוצאה מכך, מערכות של יונקים וחרקים בדרך כלל תוצאה של תאימות טובה יותר וביטוי של חלבוני אוקריוטים, אולם המארחים אלה הם בדרך כלל יקרים יותר ו9 זמן רב. לכן, א &#39; coli הוא המארח המועדף עבור מערכת הביטוי שלנו, כי תאים להתרחב במהירות בתנאי גידול זולים ומנגנוני ביטוי הגנטיים הם הבינו 5,9 כן. בנוסף, מערכת זו היא קלה בקנה מידה, למטרות ייצור ותוצאות בחלבונים תפקודיים למרות העדר לאחר translational השינויים 10. E. זן החיידק K12 נבחר בפרוטוקול זה לשיבוט כי זן זה מציע תשואות פלסמיד מצוינות המבוססות על יעילות שינוי גבוהה. בנוסף, א &#39; זן החיידק BL21 מנוצל לביטוי בגלל מתח מארח זה מכיל את גן RNA פולימראז T7 המספק ביטוי חלבון בשליטה ויציבות 11. אוהל &quot;&gt; לאחר בחירת מארח, טיפול נוסף חייב להילקח בבחירת וקטור הביטוי האידיאלי כדי להקל על ביטוי שנבחר ובשליטת חלבון. סינתזת חלבונים רקומביננטיים מתחילה ברצף ה-DNA יעד כי הוא משובט בניהולו של שעתוק T7 bacteriophage ואותות תרגום, ו ביטוי מושרה בתאי מארח המכילים עותקי כרומוזומליות של גן RNA פולימראז T7 12. וקטורים אלה, הנגזרים מpBR322 וקטור פלסמיד (לסקירה ראתה התייחסות 13), נשלטים בחוזקה על ידי אמרגן T7 פותח לראשונה על ידי בוחן ועמיתים 14 ולספק נוסף שליטה באמצעות הכללתו של המפעיל לאק וזה מדכא לאק (lac1) 15,16. להנדסת חלבונים רקומביננטיים, מערכת ביטוי זה מציעה את היכולת להתאים את רצף חומצות אמינו מסוים של חלבון רצוי על ידי החדרת רצפי DNA יעד שונים או כדי ליצור חלבוני היתוך מורכב מתחום שילובים מחלבונים יחיד. בנוסף, חלק מסדרת הווקטור כוללת שינויי תג פפטיד להיות מושם על N או התחנה הסופית C. למטרות העיצוב שלנו, תג היסטידין (שלו) התווסף לרצף יעד DNA לטיהור ורצף biotinylatable 15 חומצת אמינו נכלל לbiotinylation 17,18. בפרוטוקול זה פלסמיד המכיל גן התנגדות אמפיצילין, נבחר לבצע רצפי חלבון היתוך biotinylatable שלנו. הביטוי נשלט בוקטור זה באמצעות אמרגן T7 לאק ומושרה בקלות עם איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). ביטויי מבחן (תרבויות בקנה מידה קטנה) משמשים כדי לקבוע את הנוכחות ומסיסות של חלבון המטרה, שיכול לבוא לידי ביטוי בכל צורה מסיסה או לא מסיס לגבש נהלי טיהור. חלבון מסיס הביע בתוך תא החיידק יעבור קיפול ספונטני כדי לשמור על המבנה המקורי שלו 19. בדרך כלל הילידיםהמבנה הוא חיובי thermodynamically. במקרים רבים את הפעילות המטבולית של המארח היא לא תורמת לחלבון המטרה, שימת דגש על מערכת שמובילה לייצור חלבון מסיס והיווצרותם של גופי הכללה מורכבים מאגרגטים חלבון לא מסיסים. כך חלבון מטרת denatures, טיוח אותם בדרך כלל פעיל מבחינה ביולוגית 20. ביטויי הבדיקה שניהם טיפסו למעלה, ונהלי בידוד נקבעים על ידי המסיסות של חלבון המטרה. Renaturation נוסף או refolding צעד נדרש לחלבונים בלתי מסיסים. חלבונים רקומביננטיים וכתוצאה מכך יכולים להיות מטוהרים נוסף באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל. בבית של ייצור חלבון רקומביננטי מציע יתרונות עלות על מוצרים מסחריים מאז מיליגרם חלבון המטרה של יכול להיות מבודד לליטר של התרבות העיקרית. רוב הציוד הנדרש זמין במעבדה ביולוגית או כימית טיפוסית. הנדסת חלבונים מאפשרת יצירהשל חלבוני היתוך מותאם אישית עם פונקציות הוסיפו שאינן תמיד זמינים באופן מסחרי. איור 1 מתאר את הנהלים העיקריים מעורבים בחלבונים רקומביננטיים הנדסה. עם מערכת ביטוי זה שיצרנו חלבונים רבים biotinylatable, כגון אינטרפרון גמא, נגזר גורם גדילה של טסיות דם, וחלבון עצם morphogenetic 21-23, אך אנו נתמקד בשני חלבונים שמיועדים להדרכה האקסון, NGF (29 kDa ) וSema3A (91 KDA) 10 (לסקירה ראה התייחסות 24). Biotinylation הוא טכניקה נפוצה לזיהוי, חוסר תנועה ובידוד של חלבונים שכותרתו ניצול האינטראקציה ביוטין-streptavidin הידוע 25-27. בדיקות Biophysical 28,29, biosensors 30, ונקודות קוונטיות ביום 31 בכמה דוגמאות של מערכות המנצלות את הזיקה הגבוהה של נטיה ביוטין-streptavidin עם ד K על סדר 10 -15 M 27. E. יו coliהאנזים פח, בירה, מסייע בקובץ המצורף קוולנטיים של ביוטין לשרשרת צד ליזין נמצאת בתוך ביוטין מתויג רצף 18,32. ביוטין קשירה לחומרים וביומולקולות ייצר אספקה ​​מתמשכת של גורמי גדילה של תאים עבור יישומי הנדסת רקמות מרובים 21,33-35. לכן, הנדסת חלבוני biotinylatable המותאם במיוחד אלה היא כלי רב עוצמה שיכול להתעלות מעל אינטרסים מחקר מרובים.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%</td> <td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>2-הידרוקסיאתילמרקפטן ובטא;-מרקפטואתנול</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 מ"ל</td></tr><tr><td>חומצה אצטית,</td><td>EMD</td> קרחוני <td>AX0073-9</td><td>2.5 ליטר</td></tr><tr><td>אגר</td><td>ביושופ</td><td>AGR001.500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>מלח נתרן אמפיצילין&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9518</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>נגד קצף 204</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A6426</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>Barstar-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 ומיקרו; g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) תאים מוכשרים</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1 מ"ל; Expression Host</td></tr><tr><td>מגיב ברדפורד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>סינון ג'ל סטנדרטי</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 בקבוקונים</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>ביושופ</td><td>GLY001.1</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>גואנידין הידרודיוריד אמיופורממידין הידרוכלוריד</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>His-Pur Ni-NTA שרף</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2.5 ליטר</td></tr><tr><td>אימידזול&nbsp;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 גרם</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>מאגר דגימת Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 מ"ל</td></tr><tr><td>מלח נתרן לאוריל סולפט, משטח נתרן דודציל</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>מרק LB&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L3022</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>NovaBlue תאים מוכשרים Novagen</td><td></td><td>69825</td><td>1 מ"ל; שיבוט מארח</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10 חבילה</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 ומיקרו; g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5886-1KG</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S318-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דיאבסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5136-500G</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5011</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Bioshop</td><td>TER409.5</td><td>5 ק"ג</td></tr><tr><td>טטרציקלין הידרוכלוריד</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>טריפטון,</td><td>לבלב EMD</td><td>1.07213.1000</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>תמצית שמרים, EMD מגורען</td><td></td><td>1.03753.0500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>&nbsp; &Auml; KTApurifier10</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td>כולל ערכות ואביזרים</td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי שולחני</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>אנזים MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>מגיע עם מאגרי תגובה ותמיסת ביוטין</td></tr><tr><td>קלטת דיאליזה</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer (חוזק נוסף)</td></tr> <tr><td>צינורות</td> <td>דיאליזהמעבדות ספקטרום</td><td>132127, 132129</td><td>MWCO: 25,000 ו-50,000</td></tr><tr><td>שסתום הסחת זרימה FV-923</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת כימות ביוטין של FluoReporter מדפי</td> צינורות <td>Invitrogen</td><td>1094598</td><td></td></tr><tr><td>Frac-950, מתלה C</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>אספן שברים Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td>כולל ערכות ואביזרים</td></tr><tr><td>סירקולטור מחומם/מקורר&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>דגם 1156D</td></tr><tr><td>תנור חימום קלסר</td><td></td><td>מסדרת FD</td><td>דגם FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>הופסק - מוצר חלופי: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td></tr><tr><td>J-26 XPI Avanti צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>JA 25.50 רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>969329</td><td>כולל בקבוקי פוליפורפילן 1 ליטר</td></tr><tr><td>JS 5.3 רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים זרימה למינרית</td><td>Themo Scientific</td><td>1849</td><td>Forma 1800 סדרה נקייה ספסל</td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט</td><td>TECAN</td><td></td><td>אינסוף M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4-gel אנכי מערכת אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX ג'לים טרומיים</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>כל kDa, מסרק 15 בארות</td></tr><tr><td>Ni-NTA Column</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 מ"ל&nbsp; נפח ECONO-Column</td></tr><tr><td>פלסמיד מיני-פרפ ערכת</td><td>אומגה ביו-טק</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC ספק כוח</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V, 3 A, 300 W</td></tr><tr><td>צינורות קופולימר פוליפרופילן תחתון עגול</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 מ"ל&nbsp; צינורות לרוטור JA 25.50</td></tr><tr><td>רכזי Spin-X UF</td><td>קורנינג</td><td>431488, 431483</td><td>&nbsp; 20 ו -6 מ"ל; MWCO: 10,000 Da</td></tr><tr><td>Subcloning Service</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>שירותי חלבון</td></tr><tr><td>מעבד אולטרסאונד&nbsp;</td><td>קול-פארמר</td><td>18910445A</td><td>דגם CV18</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>דגם G560</td></tr></tbody></table>

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים biotinylated להתחדשות רקמת עצב

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

הנדסת חלבונים רקומביננטיים ניצלה חיידקי Escherichia מערכות (E. coli) ביטוי לכמעט 4 עשורים, והיום ה coli הוא עדיין אורגניזם מארח בשימוש נרחב ביותר. הגמישות של המערכת מאפשרת התוספת של moieties כגון תג ביוטין (עבור אינטראקציות streptavidin) וחלבונים תפקודיים גדולים יותר כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק או חלבון אדום דובדבן. כמו כן, השילוב של חומצות אמינו לא טבעיות כמו chelators יון מתכת, קבוצות פונקציונליות ייחודי תגובתי, בדיקות ספקטרוסקופיות, ומולקולות הקניית לאחר translational שינויים אפשר מניפולציה טובה יותר של תכונות חלבון ופונקציונליות. כתוצאה מכך בטכניקה זו יוצרת חלבוני היתוך להתאמה אישית שמציעים כלי משמעותי לתחומי מחקר שונים. באופן ספציפי יותר, רצף חלבון biotinylatable כבר שולב לתוך חלבוני יעד רבים בגלל האינטראקציה זיקה הגבוהה בין ביוטין עם avidin וstreptavidin. תוספת זו סייעה בשיפור זיהוי וטיהור של חלבונים מתויגים, כמו גם לפתוח דרך ליישומים משניים כגון מיון תא. לכן, מולקולות שכותרתו ביוטין להראות השפעה גוברת ונרחבת בתחומים bioindustrial ויו. לצורך המחקר שלנו יש לנו מהונדס חלבוני היתוך biotinylated רקומביננטי המכילים גורם עצב צמיחה (NGF) וsemaphorin3A (Sema3A) אזורים פונקציונליים. יש לנו דיווח בעבר כיצד חלבוני היתוך biotinylated אלה, יחד עם רצפי חלבון פעילים אחרים, יכולים להיות קשורים לחומרים ביולוגיים להנדסת רקמות ומטרות רגנרטיבית. פרוטוקול זה מתאר את היסודות של חלבוני biotinylatable ההנדסה בקנה מידת מיליגרם, ניצול וקטור T7 Lac מושרה וא מארחים coli ביטוי, החלו משינוי בהיקף של למעלה וטיהור.

<html> שיבוט וביטוי מבחן כאשר ציפוי מבוצע כראוי, מושבות מבודדות אחת צריכה טופס כדי להגדיל את הסיכוי של מריטת תאי חיידקים הפכו משובט (איור 2 א). עם זאת, אם יותר מדי תאים הם מצופים, הצלחות מודגרת יותר מדי זמן ב-C ° 37 או שינוי הוא בספק, מושבות עשויות לכסות את הצלחת אגר או ליצור אגרגטים גדולים יותר של תאים (2B דמויות ו2C). במהלך ביטוי בדיקה, NGF וSema3A היו מושרה ראש...

יש לפתח חלבוני היתוך biotinylatable יישומים פוטנציאליים רבים בתחומים שונים של מחקר. הנדסת חלבון רקומביננטי היא הליך ישר קדימה כי הוא חסכוני, המספק תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד.

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתכנן, לבטא ולהבודד בהצלחה חלבונים ביוטיניליים רקומביננטיים, שניתן לשלב במגוון יישומים כגון גששים (probes), חיישנים, הובלת תרופות והנדסת רקמות. מטרה זו מושגת תחילה על ידי טרנספורמציה של הפלסמיד שתוכנן בהתאמה לתא מאכסן חיידקי באמצעות תרביות בקנה מידה קטן, ולאחר מכן השראת ביטוי של חלבון המטרה. בשלב הבא, נקבעים נוכחותו ומסיסותו של חלבון המטרה על מנת להגדיר את נהלי הניקוי המתאימים.לאחר מכן, הגדילו את קנה המידה של הפרוצדורה כדי להפיק כמויות גדולות יותר של חלבון המטרה, אשר מבודדות לאחר מכן באמצעות טכניקות של כרומטוגרפיית זיקה. לבסוף, החלבונים מטוהר ומרוכזים עבור יישומים ואנליזות המשך. בסופו של דבר, תוצאות של SDS page ו-FPLC מאששות כי חלבונים רקומביננטיים בודדו וטוהרו בהצלחה, והחלבונים נבחנים בהמשך לבדיקת תפקודיות.היתרון המרכזי של הנדסת חלבונים רקומביננטיים הוא היכולת לייצר כמויות רבות או כמויות בסדר גודל של מיליגרמים של חלבונים בעיצוב מותאם אישית, כדי לענות על דרישות מדעיות מדויקות. לדוגמה, ניתן להוסיף פונקציונליות חדשה לחלקים מחלבונים אלו כדי להקנות להם תכונות חדשות. היום נראה לכם כיצד ניתן לבצע ביוטיניציה לקצוות של חלבונים ספציפיים, ואנו משתמשים בכך כדי לקבע או לעגן חלבונים אלו למשטחים באופן ספציפי, במטרה להנחות תפקודי תא כגון צמיחת נוירונים או התמיינות נוירונלית.אנשים שאינם מנוסים בטכניקה זו לא צפויים להיתקל בקושי רב בעת ביצוע הפרוטוקולים לבידוד חלבון במצב טבעי (native) או במצב שאינו טבעי (non-native). שלבים רבים הם זהים, אך הם דורשים באפר ספציפי המורכב עבור תנאים טבעיים או תנאים שאינם טבעיים. יש להקדיש תשומת לב מדוקדקת לפרטים במהלך השלבים הראשוניים.שלבי הטרנספורמציה ובדיקת הביטוי יבטיחו תפוקה גבוהה של חלבון במהלך תהליך הגדלת הקנה (scale up) הסופי בשלב מאוחר יותר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא חשובה, שכן היא מראה כיצד ניתן להפיק חלבונים רקומביננטיים באמצעות ציוד וחומרים פשוטים במעבדה. באמצעות שימוש בתגובת אצווה (batch reaction) פשוטה, מגדלים את המדיום שווה-ערך ומדיום הצמיחה בקנה מידה מוביל, ובכך מפיקים 10 מיליגרם חלבון לכל תרבית ראשית.בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקות כרומטוגרפיה ולהדגימן כדי להראות כיצד חלבונים עוברים טיהור נוסף ליישומים עוקבים. היום, אליסיה, סטודנטית לתואר שני במעבדת Cinema, תדגים את ההליך. לאחר שיבוט ובדיקת ביטוי של חלבון המטרה הרצוי, והגדלה של תרבית של 20 milliliters במהלך הלילה: בהתאם לפרוטוקול הכתוב, שפכו את תרבית הלילה אל תוך 1.8 liters של מצע גידול סטרילי עם ampicillin והשתמשו בפיפטת פסטור כדי להוסיף שש עד שמונה טיפות של anti foam 2 0 4 סטרילי. הניחו את התרביות במקבץ מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, והעבירו אוויר דחוס לתוך התרביות באמצעות אבני אוורור דרך מסנן של 0.2 micron. כאשר התרבית מגיעה ל-OD 600 של 0.7 עד 0.8, הוסיפו 1 millimolar IPTG ובצעו השראה למשך ארבע שעות ב-37 degrees Celsius או במהלך הלילה ב-18 degrees Celsius, בהתאם לשאלה האם החלבון נמצא בחלק המומס או הבלתי מומס בבדיקת הביטוי.ניסויים לאיסוף התאים, העברת התרבית לבקבוקי צנטריפוגה של ליטר אחד, וסבב בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-14,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. שפכו את העל-נוזל (supernatant) ובעזרת שפכטל דק, העבירו את משקע החיידקים לשני מבחנות של 50 mL. השקיעו את התאים שנית על ידי צנטריפוגה למשך מספר דקות לפני אחסון המשקעים בטמפרטורה של 80- °C.לביצוע בידוד של חלבון שאינו טבעי עבור חלבון בלתי ממיס, יש להוסיף לכל pellet קפוא של e coli כ-20 milliliters של lysis, wash buffer, ולבצע vortex וניעור כדי להומוגניзировать את התגסוּס ולהיפטר מכל גושי חומר גדולים.לאחר דגירה ב-mutator למשך לילה, התמיסה תיראה כמרקה צמיגית. סבבו את המרקה בצנטריפוגה במהירות של 20,500 ×g בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה נקייה והשליכו את המשקע לצורך בידוד חלבון טבעי.ששופו את הכדורים (pellets) בבופר ליזיס לנפח סופי של 30 milliliters, כאשר הכדור המשושף נמצא על קרח. כוון את הסוניקטור לאמפליטודה של 30% עם פולס של 30 שניות פעילות ו-30 שניות מנוחה, ובצע סוניקציה למשך חמש דקות. הניעו את המבחנה למעלה ולמטה במהלך הסוניקציה כדי לפרק לחלוטין את כדור התאים.סנטריפוגו את ת сусפנזיה ב-20,500 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון למבחנה נקייה והשליכו את המשקע. כדי לבצע כרומטוגרפיית זיקה על חלבון מבודד שאינו טבעי, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת שרף nickel NTA לכל מבחנת סנטריפוגה והדגירו במיקסר או בניעור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות.שפכו את תרחוף השרף לתוך עמודת זיקה והמתינו עד שהתמיסה תטפטף דרך שסתום העצירה באופן מלא לכלי איסוף הפסולת. הוסיפו 10 milliliters של בופר שטיפה למבחנה הצנטריפוגית כדי להסיר שאריות שרף, והוסיפו את התמיסה לעמודה לאחר שהתמיסה הקודמת טפטפה החוצה. השתמשו במוט בחישה מזכוכית כדי לערבב את השרף והמתינו לסיום הטפטוף לפני הוספת שטיפה נוספת.בשלב הבא, השתמש ב-10 milliliters של תמיסת שטיפה כדי לחזור על שטיפת מבחנת הצנטריפוגה והעבר אותה לעמודה. לאחר מכן, בצע שמונה שטיפות נוספות של העמודה עם 10 milliliters של תמיסת שטיפת ליזיס לכל שטיפה. לאחר השלמת השטיפות, סגור את הברז (stop cock) והחלף את כוס הפסולת במבחנת צנטריפוגה של 50 milliliter.הוסיפו 15 milliliters של באפר אלוציה לעמודה, ערבבו את הסורבנט והמתינו חמש דקות. לאחר מכן, פתחו את הברז ואספו את ה-EIT לפני חזרה על הפעולה עם 15 milliliters נוספים של באפר אלוציה לניקוי חלבון טבעי. לאחר הוספת סורבנט nickel NTA לתמיסת החלבון, דגרו במכשיר ערבוב בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius למשך שעה אחת לפחות.לאחר שטיפת העמודה 10 פעמים באמצעות בופר שטיפה, הוסף חמישה מיליליטר של בופר אלואוציה והדגה את שרף הניקוי למשך חמש דקות לפני שימוש במבחנה נקייה לאיסוף רוב ה-EIT; בזמן שה-EIT מטפטף מהעמודה, הוסף 90 µL לכל באר של ריאגנט Bradford לתוך פלטת 96 בארות שקופה. לאחר כל אלואוציה של חמישה מיליליטר עם בופר, אפשר ל-10 µL מהתמיסה לטפטף מהעמודה אל תוך באר המכילה 90 µL של ריאגנט Bradford. המשך עם ה-EEU עד שלא יזוהה יותר חלבון לצורך דיאליזה או Rena.העבירו כל EIT של החלבונים לתוך נקבים לדיאליזה ובצעו דיאליזה מול הבאפר המתאים, פעם אחת למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 4 °C לפני ההחלפה לבאפר המתאים. פעמים שנית ללילה בטמפרטורה של 4 °C. השתמשו במרכזי ספין (spin concentrators) כדי לרכז את החלבונים שעברו דיאליזה לנפח של פחות מ-5 mL, ובמידת הצורך טהרו אותם יותר באמצעות כרומטוגרפיה של הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography) באמצעות atin eight.על פי פרוטוקול הטקסט, במהלך ביטוי ניסיוני, NGF ו-SE three A הותו первое למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 °C, ואנליזת SDS page קבעה ששני החלבונים נמצאו בפרקציה הממיסה. רמת ביטוי החלבון נראתה סבירה, ולכן נבדקה ביטוי ניסיוני נוסף עם השראה למשך לילה בטמפרטורה של 18 °C. ביטוי ה-NGF השתפר בפרקציה הממיסה, בעוד שלא נצפה הבדל ניכר ב-SEMA three.NGF בודד בתנאים נטיביים ובתנאים שאינם נטיביים והועבר בעמודת FPLC לצורך טיהור. למרות ש-NGF נמצא בחלק הממיס במהלך בדיקת הביטוי, בידוד נטיבי הניב תפוקה נמוכה הן בהשראה ב-37 degrees Celsius והן בהשראה ב-18 degrees Celsius. עם זאת, תפוקה גבוהה יותר של NGF התקבלה באמצעות בידוד שאינו נטיבי עם רנטורציה.כתוצאה מכך, NGF בודד בתנאים שאינם טבעיים (non-native). לאחר השראה למשך לילה בטמפרטורה של 18 °C, בידוד שאינו טבעי לא הביא לייצור של SEMA 3A, לעומת בידוד טבעי שהניב 8.61 ± 3.1 מיליגרם לכל תרבית ראשית של 2 ליטרים. לפיכך, SEMA 3A הושרה למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 °C ובודד באמצעות פרמטרי בידוד טבעיים.נאספו שיאי FPLC, ודגימות של NGF ו-SEMA three A נותחו באמצעות SDS page. שיאי חלבון נוספים שנמצאו בפלט ה-FPLC עבור SEMA three A נאספו ונותחו באמצעות SDS page, ונמצא כי אינם שוכנים באזור המשקל המולקולרי של SEMA three a. פרקציות אלו הן ככל הנראה תוצרי פירוק, מכיוון שלא הפגין התנהגות תפקודית במערכי בדיקה מבוססי תאים, בניגוד ל-SEMA three.שיא מסומן כאן. לאחר ביסוס ושליטה בחלבון רקומביננטי, בידוד וטיהור אמורים לקחת מספר ימים בלבד אם הם מבוצעים כהלכה. עם זאת, שלבי טרנספורמציה ראשוניים של חיידקים ושלבי ביטוי ניסיוניים אורכים זמן רב יותר על מנת לזהות כראוי את מסיסות החלבון.לאחר קביעת המסיסות, ניתן לאחסן ספרייה של החיידקים שעברו טרנספורמציה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. בנוסף, לאחר ביטוי החלבון, ניתן לאחסן משקעים של e coli אף הם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לבידוד וניסויים נוספים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לוודא שהבופרים סטריליים והוכנו טרי, כדי למנוע מפרוטאזות לגרום לדנטורציה ולפירוק של החלבונים.יש להכין ולסטריליז את תמיסורי הבידוד מדי ארבעה עד שישה שבועות, ואת תמיסורי הדיאליזה יש להכין ביום שלפני הבידוד. יש לוודא שעמודי N-I-N-T-A ו-FPLC נקיים בהתאם לפרוטוקולי היצרן, וזאת כדי למנוע זיהום צולב של חלבונים ביוטינולים מרובים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הביטוי, הבידוד והטיהור של חלבונים ביוטינולים בעיצוב מותאם אישית באמצעות מערכת ביטוי של מאחס חיידקי.תהליך זה דומה למה שנעשה הן באופן מדעי והן באופן מסחרי, בקנה מידה קטן וגדול. לפיכך, יש לו יישום רחב.

expression-isolation-purification-soluble-insoluble-biotinylated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

סרטון זה מדגים את הבידוד של חלבונים תוך-תאיים ותוך-תאיים מתרבית אסטרוציטים. תרבית האסטרוציטים מונחת על קרח כדי לעכב אנדוציטוזה, ואז חלבוני פני התא מסומנים בריאגנט ביוטינילציה. התאים עוברים ליזה כדי לשחרר את החלבונים הביו-טיניליים שעל פני התא ואת החלבונים התוך-תאיים שאינם ביוטינילטים. לבסוף, חרוזים מצופים סטרפטווידין משמשים להפרדת חלבוני פני התא הביוטיניליים מהחלבונים התוך-תאיים.

בידוד חלבונים תוך-תאיים ותוך-תאיים מתרבית אסטרוציטים

סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

תחבורת axonal של BDNF, גורם neurotrophic, היא קריטית להישרדות והתפקוד של כמה אוכלוסיות נוירונים. כמה הפרעות ניווניות מסומנות על ידי שיבוש של מבנה ותפקוד עצב. אנחנו הדגמנו את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי.

הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי

צפיפות שונה צנטריפוגה מבוססי מתודולוגיה שיפוע מבוסס נוצל לבודד תאים אפיתל מ רקמה Rhipicephalus רקמת microplus . משטח חלבונים הקשורים היו biotinylated ו מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin עבור יישומים במורד הזרם.

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

מוצג כאן הוא פרוטוקול המשלב במערכת התרבותית העצבית-אנדותל ושיתוף תרבות מטבולית והתאגדות המטבולית של sialoglycan עם קבוצות פונקציונליות bioorthogonal כדי להרחיב את גזע הגוף העצבי ואת התאים מחולל מותג התווית שלהם סיליגליקורופנס להדמיה או ניתוח המסה-ספקטרומטריה של סמני שטח התא.

זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור ביוכימית מחוץ למבחנה המשתמשת בתוויות ביוטין שעשוי להיות מתאים באופן נרחב עבור לימוד אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה.

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאים HEK293 באופן חסכוני ומטוהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. לאחר מכן BDNFavi באופן ישיר מונו-biotinylated עם בירה אנזים בשפופרת. Bdn, ו מונו-biotinylbdni שמירה על הפעילות הביולוגית שלהם בהשוואה BDNF זמין מסחרית.

פרוטוקול משופר כדי לטהר ו מונו ישירות-Biotinylate BDNF בתוך צינור ללימודי סחר בתאי הסלולר בנוירונים

הפרוטוקול מציג שיטה להצמדה קוולנטית in vivo של ביוטין לחלבונים על סמך קרבתם לביוטין ליגאז המותך לחלבון מעניין. שינוי זה מאפשר העשרה סלקטיבית של החלבונים באמצעות חרוזי סטרפטווידין לפי הצורך במחקרי אינטראקציה עם חלבונים.

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

למד לבטא, לבודד ולטהר חלבונים ביוטיניליים רקומניים לשימושים בביוטכנולוגיה ורקמות עצב. השיטה משתמשת בכרומטוגרפיית אפיניות לבידוד יעיל של חלבונים מסיסים ובלתי מסיסים.

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

גלה סרטונים נוספים