גילוי אינטראקציות חלבון ואפיון תפקוד חלבון באמצעות HaloTag טכנולוגיה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד ביעילות קומפלקסים של חלבונים מתאי יונקים. זאת על ידי הטרנספקציה הראשונית של התאים עם קונסטרוקט של חלבון מאחובר ל-halo tag כדי לבטא את חלבון העניין. השלב השני הוא ליסו של התאים ולכידה קוולנטית של קומפלקסי החלבונים על שרף באמצעות ה-halo tag.

בשלב הבא, שוטפים בעדינות את קומפלקסי החלבונים הנמצאים על השרף כדי להסיר אינטראקציות שאינן ספציפיות. השלב הסופי הוא אלוטציה של קומפלקסי החלבונים מהשרף. בסופו של דבר, משתמשים ב-halo tag pull downs כדי לבודד ולגלות אינטראקציות חלבוניות חדשות ממערכות של יונקים.

השיטות שנדגים לכם כאן היום יכולות לאפשר תגליות מרכזיות בתחום הפרוטאומיקה התפקודית, כולל זיהוי של אינטראקציות חלבון חדשות וקביעת מיקום החלבון בתוך תאים. את הפרוצדורות הללו מבצעים היום שני מדענים בכירים שלנו, ג'קי מנדס ואלן ביק. ראשית, עבור כל היתוך או בקרה, הכינו צלחת אחת של 15 סנטימטר עם 30 מיליליטר של תאים בריכוז של 3 עד 4 כפול 10⁵ תאים למילליטר, או 1 עד 1.2 כפול 10⁷ תאים בסך הכל לכל מבנה.

דגרו את התאים למשך 18 עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2. לאחר הדגירה, בצעו טרנספקציה של ה-construct באמצעות ריאגנט הטרנספקציה הרצוי. לאחר 24 עד 48 שעות מהטרנספקציה, הסירו את המצע ושטפו בעדינות את שכבת התאים עם 20 עד 25 milliliters של PBS קר בקרח; הסירו את ה-PBS שבאמצעות השטיפה והוסיפו 25 עד 30 milliliters של PBS מקורר ל-4 °C.

לאחר מכן, גרדו בעדינות את התאים מהצלחת באמצעות גורד תאים. לאחר איסוף התאים לתוך מבחנות קוניות, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה למשך חמש עד 10 דקות ב-2000 ×g ובטמפרטורה של 4°C. לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), העבירו את משקעי התאים לטמפרטורה של 80-°C למשך 30 דקות לפחות או עד שישה חודשים לכל היותר.

עבור כל דגימת מיזוג או דגימת ביקורת, הכין 18 milliliters של תמיסת שטיפה להשוואת שרף. ערבב בעדינות את השרף על ידי היפוך המבחנה כדי לקבל סספנסיות אחידה. עבור כל ניסוי pull down, העבר 200 microliters של שרף למבחנה מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter.

סבבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 800 ×g. לאחר הסבוב, הסירו בזהירות את העליון (supernatant) מבלי להפריע לשרף בתחתית המבחנה. לאחר השלכת העליון, הוסיפו 800 µL של בופר שטיפה להשאת שרף לדגימה וערבבו היטב על ידי הפיכת המבחנה מספר פעמים. לאחר מכן.

סבב של צנטריפוגציה לדגימה למשך שתי דקות ב-800 ×g. יש להסיר בזהירות ולהשליך את העליון. חזור על השלבים הקודמים פעמיים נוספות, לסך הכל שלושה שטיפות.

לאחר הפשרת כדוריות התאים, השהה אותן ב-300 µL של באפר ליזיס לממליאים שהוכן מראש, באמצעות פיפוט מעלה ומטה. לאחר מכן, העבר אותן למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה והוסף 6 µL של תערובת מעכבי פרוטאז בריכוז 50x.

לאחר מכן, הוסיפו 3 µL של RQ one DNAs והפכו את המדגם למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, בצעו ליזה של התאים על ידי העברת המדגם 5 עד 10 פעמים דרך מחט של מזרק בכיול 25 או 27. לאחר צנטריפוגה של המדגם ב-14,000 ×g למשך חמש דקות ב-4 °C, העבירו את הליזט הצלול לפחפחית חדשה והניחו אותה על קרח.

בשלב הבא, הוסיפו 700 microliters נוספים של XTBS buffer שהוכן מראש אל הליזט הצלול וערבבו היטב באמצעות פיפוט מעלה ומטה. הסירו את השטיפות האחרונות מתוך מבחנות הרזין שהוזנו והושוו מראש, מבלי להפריע לרזין בתחתית כל מבחנה. לאחר מכן, הוסיפו מילליטר אחד של הליזט המדולל לכל מבחנה.

דגרו את הדגימות תוך ערבוב על רכז צינורות (tube rotator) למשך 15 דקות בטמפרטורה של 22 °C. לאחר מכן, סובבו את צינורות השרף בצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-800 ×g. לאחר השליכה של הנוזל העליון (supernatant), הוסיפו 1 mL של בופר שטיפה להשוואת שרף (resin equilibration wash buffer) וערבבו היטב על ידי היפוך ידני של כל צינור שרף מספר פעמים, ולאחר מכן סובבו את צינורות השרף בצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-800 ×g. השליכו את השטיפות לאחר שחזרו על שלבי השטיפה והסבב הקודמים שלוש פעמים.

הוסיפו מיליליטר אחד של בופר שטיפה להשравת שרף למבחנות לאחר דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 22 °C למשך חמש דקות תוך סיבוב רציף, סנטריפוגו את מבחנות השרף למשך שתי דקות ב-800 ×g והשליכו את השטיפות. בשלב זה, השביו את השרף מכל דגימה ב-50 µL של בופר אלואציה של SDS. נערה את המבחנות בטמפרטורת החדר באמצעות מנער מבחנות אוטומטי למיקרו-סנטריפוגה למשך 30 דקות.

לאחר סרטיפוגציה של שתי דקות ב-800 ×g, העבירו את ה-EITs למבחנות נקיות לצורך אנליזה. עבור western blot או צביעת כסף, טענו 5 עד 10 µL מהדגימות על ג'ל SDS דנטורציה עבור ספקטרומטריית מסות. שמרו 40 µL מכל דגימה בטמפרטורה של 20°C- לאנליזות עתידיות. בלוח זכוכית עם שמונה תאים עבור כל חלבון מאוחד (fusion protein) או לוח ביקורת, הוסיפו 400 µL של תאי HELOC במצע המתאים לכל תא, בריכוז של 1 עד 2 × 10⁵ תאים ל-mL.

לאחר דגירה של התאים למשך 18 עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C ו-5%CO2, בצע טרנספקציה באמצעות ריאגנט הטרנספקציה הרצוי. 18 עד 24 שעות לאחר הטרנספקציה, דלל את הליגנד TMR ביחס של 1:200 במצע התאים המתאים. לאחר מכן, הוסף 100 µL מתמיסה זו לכל באר וערבב בעדינות. לאחר מכן, דגור את התאים שעברו טרנספקציה ומכילים את הליגנד למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 °C ו-5%CO2.

עם הסיום, שאבו את המצע המכיל את הליגנד והחליפו אותו ב-500 µL של המצע המתאים ללא ליגנד של תגית חלבון מותח, אשר חומם מראש ל-37 °C. לאחר שהשלב הקודם חזר על עצמו פעמיים, לסך הכל שלושה שטיפות, החזירו את התאים לאינקובטור למשך 30 דקות.

לאחר דגירה של 30 דקות, שאבו את המצע והחליפו אותו ב-500 microliters של מצע מתאים, שחומם מראש ל-37 degrees Celsius. לאחר מכן, דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ תוך שימוש בפרמטרי רכישה מתאימים; תחת הפרוטוקול של halo, BRD4 ובקרת ביטוי של halo tag ניתן להבחין בביטוי. ניתן לזהות ביטוי של חלבוני היתוך גם באמצעות Western blots עם נוגדנים ל-halo tag או נוגדנים לחלבון הפיתיון (bait protein).

צביעת כסף של ג'לים של רפליקטים ביולוגיים של Halo BRD four ושל pulldowns של ביקורת מדגימה הדירות גבוהה ומראה חלבונים המקיימים אינטראקציה עם חלבון ה-BRD four. השכיחות הגבוהה של רכיבים מ-PTF B CDK nine ו-Cyclin T, כמו גם של חלבון ה-BRD nine, מאששת לכידה ספציפית של קומפלקסי BRD four. הג'לים הראו חלבונים נוספים שזוהו כאינטראקטורים פוטנציאליים של BRD four.

כדוגמה נוספת, בוצעו בידודים מורכבים עם החלבון Halo HD one. במקרה זה, נעשה שימוש ב-TEV protease כדי לבצע שסע באזור המקשר (linker) שבין תג ה-Halo לבין H DAC one, ובכך שוחררו כמויות משמעותיות של חלבון הפיתיון HD one, כפי שנצפה.

מדגמי pulldown של HD one הראו רמות גבוהות של פעילות HD one, אשר עוכבה על ידי מעכב ה-HDA שנקרא saha. כדי להוכיח ספציפיות נוספת, לא נצפתה עיכוב HDA עם מעכב משפחת ה-sirtuin שנקרא EX 5 27, ולא זוהה אות כאשר נעשה שימוש במאפר (buffer) בלבד. תאי He A שעברו טרנספקציה עם Halo BRD four ו-Halo HDAC one סומנו באופן פלואורסצנטי באמצעות TMR.

דימוי ליגנדים הראה כי שניהם ממוקמים בגרעין, והוכיח כי התג לא שינה את הלוקליזציה התאית הפיזיולוגית של השותפים למיהוץ. לפיכך, בעקבות הליך זה, ניתן לזהות את החלבונים המבודדים ואת השותפים למסלול האינטראקציה שלהם ולנתח אותם בהמשך באמצעות מגוון שיטות אנליטיות, כגון ספקטרומטריית מסות ו-western blotting.