גילוי אינטראקציות חלבון ואפיון תפקוד חלבון באמצעות HaloTag טכנולוגיה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ביעילות קומפלקסים של חלבונים מתאי יונקים. זה מושג על ידי מעבר ראשון של התאים עם מבנה היתוך של תג הילה כדי לבטא את החלבון המעניין. השלב השני הוא לפרוס את התאים וללכוד קוולנטית את קומפלקסי החלבון על שרף באמצעות תג הילה.

לאחר מכן, מתחמי החלבון על השרף נשטפים בעדינות כדי להסיר אינטראקציות לא ספציפיות. השלב האחרון הוא לנטרל את קומפלקסי החלבון מהשרף. בסופו של דבר, משיכות תג הילה משמשות לבידוד וגילוי אינטראקציות חלבון חדשות ממערכות יונקים.

השיטות שנדגים לכם כאן היום יכולות לאפשר תגליות מפתח בתחום הפרוטאומיקה הפונקציונלית, כולל זיהוי אינטראקציות חלבון חדשות וקביעת לוקליזציה של חלבונים בתוך התאים. מבצעים את ההליכים הללו כיום שניים מהמדענים הבכירים שלנו, ג'קי מנדז ואלן ביק. ראשית, עבור כל היתוך או בקרה, הכינו צלחת אחת של 15 סנטימטר עם 30 מיליליטר תאים בשלושה עד ארבעה כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר, או אחד עד 1.2 כפול 10 לשבעת התאים בסך הכל לכל מבנה.

דגרו על התאים למשך 18 עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר הדגירה, העבירו את המבנה עם מגיב הטרנספקציה הרצוי. לאחר 24 עד 48 שעות, לאחר הטרנספקציה, הסר את המדיה ושטוף בעדינות את שכבת התא עם 20 עד 25 מיליליטר PBS קר כקרח, הסר את שטיפת ה-PBS והוסף 25 עד 30 מיליליטר של ארבע מעלות צלזיוס PBS צונן.

לאחר מכן, מגרדים בעדינות את התאים מהצלחת בעזרת מגרד תאים. לאחר שהתאים נאספו לצינורות חרוטיים, צנטריפוגה את הדגימות למשך חמש עד 10 דקות ב-2000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, הניחו את כדוריות התא במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך מינימום 30 דקות או מקסימום שישה חודשים.

עבור כל דגימת היתוך או בקרה, הכינו 18 מיליליטר של מאגר שטיפת שיווי משקל שרף. מערבבים בעדינות את השרף על ידי היפוך הבקבוקון לקבלת מתלה אחיד. עבור כל ניסוי משיכה למטה הוצא 200 מיקרוליטר שרף לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה את הדגימה למשך דקה אחת ב 800 פעמים G.לאחר צנטריפוגה. הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לשרף בתחתית הצינור. לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסף לדגימה 800 מיקרוליטר של מאגר שטיפת שיווי משקל שרף וערבב היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. אחרי.

צנטריפוגה של הדגימה למשך שתי דקות ב 800 פעמים. ז. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט. חזור על השלבים הקודמים פעמיים נוספות בסך הכל שלוש כביסות.

לאחר הפשרת כדורי התא, השעו אותם ב -300 מיקרוליטר של ליזה של יונקים שהוכנו בעבר. חוצץ על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן העבירו לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש והוסיפו שישה מיקרוליטר של קוקטייל מעכב פרוטאז פי 50.

לאחר מכן, הוסף שלושה מיקרוליטרים של RQ אחד DNA והפוך את הדגימה למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר התאים על ידי העברת הדגימה חמש עד 10 פעמים דרך מחט מזרק בגודל 25 או 27. לאחר שהדגימה צנטריפוגה פי 14,000, G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את הליזאט השקוף לצינור חדש והניחו אותו על קרח.

לאחר מכן, הוסף עוד 700 מיקרוליטר של מאגר XTBS אחד שהוכן בעבר לליזט השקוף וערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הסר את השטיפות הסופיות מצינורות השרף המאוזנים שהוכנו בעבר מבלי להפריע לשרף בתחתית כל צינור. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של הליזט המדולל לכל צינור.

דגרו את הדגימות בערבוב על מסובב צינור למשך 15 דקות בחום של 22 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה זו, צינורות השרף למשך שתי דקות ב 800 פעמים G.לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסף מיליליטר אחד של מאגר שטיפת שיווי משקל שרף וערבב היטב על ידי היפוך כל צינור שרף ביד מספר פעמים לאחר צנטריפוגה של צינורות השרף למשך שתי דקות ב 800 פעמים. ז. השלך את הכביסה לאחר ששלבי הכביסה והקודמים חזרו על עצמם שלוש פעמים.

הוסף מיליליטר אחד של מאגר שטיפת שיווי שרף לצינורות לאחר דגירה של הדגימות ב-22 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות עם סיבוב מתמיד, צנטריפוגה את צינורות השרף למשך שתי דקות ב-800 פעמים G והשליך את השטיפות. בשלב זה, החייאה משהה את השרף מכל דגימה ב-50 מיקרוליטר של מאגר פליטה SDS. לנער את הצינורות בטמפרטורת החדר בעזרת שייקר צינור מיקרו צנטריפוגה אוטומטי למשך 30 דקות.

לאחר צנטריפוגה למשך שתי דקות ב-800 פעמים G.העבירו את ה-EITs לצינורות טריים לניתוח עבור כתם מערבי או ג'ל כתם כסף טען חמישה עד 10 מיקרוליטר מהדגימות על ג'ל דנטורציה SDS לספקטרומטריית מסה. אחסן 40 מיקרוליטר מכל דגימה במינוס 20 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי. בכוס כיסוי עם שמונה תאים לכל חלבון היתוך או לוחית בקרה, 400 מיקרוליטר של תאי HELOC במדיה המתאימה להם בכל באר בצפיפות של אחד עד שניים כפול 10 עד חמישי תאים למיליליטר.

לאחר דגירה של התאים במשך 18 עד 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, העבירו אותם עם מגיב הטרנספקציה הרצוי לאחר 18 עד 24 שעות, לאחר טרנספקציה יש לדלל את ליגנד TMR אחד עד 200 במדיה התאית המתאימה. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר מתמיסה זו לכל באר ומערבבים בעדינות. לאחר מכן, דגרו על התאים הטרנספטנטיים המכילים את הליגנד למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

בסיום, שאפו מהמדיה המכילה את הליגנד והחליפו אותה ב-500 מיקרוליטר של המדיה המתאימה חסרת ליגנד תג היתוך חלבון, שהוזהר מראש ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר שהשלב הקודם חזר על עצמו פעמיים בסך הכל שלוש כביסות. החזירו את התאים לחממה למשך 30 דקות.

לאחר הדגירה של 30 דקות יש לשאוב את המדיה ולהחליף ב-500 מיקרוליטר של מדיה מתאימה, שחוממה מראש ל-37 מעלות צלזיוס. בעקבות תמונה זו, נצפה התאים במיקרוסקופ המשתמשים בפרמטרי הרכישה המתאימים באמצעות הפרוטוקול halo, BRD four וביטוי בקרת תג הילה. ניתן לזהות ביטוי חלבון היתוך גם באמצעות כתמים מערביים עם נוגדנים נגד תג הילה או נוגדנים לחלבון הפיתיון.

ג'ל כתמי כסף של שכפולים ביולוגיים של Halo BRD four ומשיכות בקרה מדגימים יכולת שחזור גבוהה ומראים חלבונים המקיימים אינטראקציה עם חלבון BRD 4. השפע הגבוה של רכיבים מ-PTF B CDK nine ו-Cyclin T כמו גם החלבון BRD 9 מאשר לכידה ספציפית של ארבעה קומפלקסים של BRD. הג'לים הראו חלבונים אחרים שזוהו כאינטראקטורים פוטנציאליים של BRD 4.

כדוגמה נוספת, בוצעו בידודים מורכבים עם חלבון Halo HD one. במקרה זה, נעשה שימוש בפרוטאז TEV כדי לבקע באזור מקשר בין תג Halo ל-H DAC אחד ולשחרר כמויות משמעותיות של חלבון הפיתיון HD one. כפי שנצפה.

דגימות HD one pulldown הראו רמות גבוהות של פעילות HD one, אשר עוכבה על ידי מעכב HDA saha. כדי להדגים עוד יותר את הספציפיות, לא נצפתה עיכוב HDA עם מעכב משפחת סירטואין EX 5 27 ולא זוהה אות באמצעות מאגר בלבד. תאי He A שהועברו עם Halo BRD 4 ו-Halo HDAC אחד סומנו באופן פלואורסצנטי עם TMR.

הדמיית ליגנד הראתה כי שניהם התמקמו בגרעין והוכיחו כי התג לא שינה את הלוקליזציה התאית הפיזיולוגית של שותפיו לאיחוי. אז בעקבות הליך זה, ניתן לזהות ולנתח את החלבונים המבודדים ושותפיהם האינטראקטיביים באמצעות מגוון שיטות אנליטיות כגון ספקטרומטריית מסה וכתמים מערביים.