ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים, אדס המפוספס

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות רכיבי שעתוק של תגובת הדיאפאוזה הצילו-תקופתית. בפיקטוס מרפק יתוש משנות השמונים, זה מושג על ידי ייצור דגימות משוכפלות ביולוגית של ביציות דיאפאוזה ולא דיאפאוזה באמצעות טיפולים תקופתיים שונים. כשלב שני, RNA מופק מכל שכפול לריצוף RNA בתפוקה גבוהה.

רצפי ה-RNA מעובדים לאחר מכן באופן חישובי כדי להרכיב אותם לקונגים ולהוסיף להם הערות. בסופו של דבר ניתן להסיק וריאציות בביטוי הגנים בתגובה לתקופות צילום המעוררות דיאפוזה לעומת תקופות צילום שאינן מעוררות דיאפאוזה מ-Reeds MAP למכלול ה-RNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח מיקרו-קרניים, הוא שמשאבים גנטיים קודמים כגון רצף הגנום או מיקרו-מערך, אינם נדרשים כדי לקבל הערכות גלובליות של ביטוי גנים בתגובה למצבי דיאפאוזה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנומיקה האקולוגית, כגון מהו בסיס השעתוק של DPOs או התאמות אקולוגיות מרכזיות אחרות באורגניזמים שאינם מודלים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיכול להיות קשה להשיג כמויות מספיקות של ביציות דיאפאוזה ולא DPOs וניתוח הביואינפורמטיקה במורד הזרם יכול להיות מאתגר. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר שמנו לב שטכנולוגיות ריצוף DNA בתפוקה גבוהה הופכות לזולות יותר והציעו שיטה ניתנת להשגת פרופילי ביטוי גנום שלם באורגניזמים שאינם מודלים לפני תחילת ההליך.

הגדר שני ארונות תקופתיים לצילום עם תאורה ניתנת לתכנות ב-21 מעלות צלזיוס לביטוי דיאפוזה אופטימלי וכ-80% לחות יחסית תכנת ארון אחד לתקופת צילום ללא דיאפאוזה עם מחזור חושך של 16 שמונה אור והשני לדיאפאוזה הגורמת לשמונה מחזורי חושך אור 16 עם האורות דולקים בו זמנית לשני הארונות כדי לסנכרן את הזמן הצירקדי בין תקופות הצילום. לאחר מכן, טבלו ניירות ביצים למספר המתאים של ביצים ב-500 מיליליטר של מים נטולי יונים והוסיפו מיליליטר אחד של מזון כלבים טחון ותמיסת מזון שרימפס מלח. מכסים את המיכל ברשת ומניחים גומייה סביב הרשת כדי לשמור אותה במקומה.

לאחר מכן דגרו את הביצים בארון הצילום של 16 שמונה ימים ארוכים כהים בהירים למשך כ-24 שעות. למחרת, העבירו כ-30 זחלים בוקעים בכל קבוצה לצלחות פטרי בודדות בגודל 10 על 10 על שני סנטימטרים, מלאות ב-90 מיליליטר מים נטולי יונים. כל 48 עד 72 שעות, העבירו את הזחלים לכלי נקי, והאכילו אותם בתמיסת מזון טרי בכל העברה.

לאחר כשישה ימים, יש לרפד את החלק התחתון של שלושה עד ארבעה כלובי מבוגרים לכל טיפול בתקופת צילום בנייר סינון רטוב ולהרטיב את נייר הסינון במספיק מים נטולי יונים כדי להגביר את הלחות המקומית בכלוב תוך הימנעות ממים עומדים. שימו לב לתקופת הצילום, שכפול תאריך ההתחלה של כלוב המספרים ומידע אחר הרלוונטי לניסוי עם סמן קבוע בצד הכלוב. לאחר מכן כל יומיים במשך 10 ימים, העבירו את הפוי לכוסות קטנות של מים נקיים בלא יותר מ-50 פוי לכל 25 מיליליטר מים לתוך כלובי המבוגרים המתאימים לניסוי והניחו צימוקים אורגניים על הרשת העליונה של הכלוב כדי לספק סוכר למבוגרים שהגיחו כדי לעורר את מיקום הביציות ארבעה עד חמישה ימים לאחר ארוחת הדם הראשונה, מלאו כוסות של 50 מיליליטר בצבע כהה מרופדות במגבת נייר לא מולבנת במרקם באמצע הדרך במים נטולי יונים והניחו אחת לכל כלוב כדי לאסוף ולאחסן את הביצים.

החלף את ניירות הביצים בכל כלוב בנייר טרי, הניח את הניירות שהוסרו לאחרונה בצלחות פטרי ואחסן אותם בארון שמונה 16 ימי צילום קצרים כהים בהירים כדי למנוע השפעות מבלבלות על אחסון הביצים. כ-48 שעות לאחר האיסוף, יבשו את ניירות הביצים באוויר הפתוח כך שיהיו רפויים ומעט לחים למגע, אך לא רטובים עד כדי כך שהניירות כהים ממים או מעוררים בקיעה. כדי למדוד את אירועי הדיאפאוזה, רשום את מספר הביצים על כל נייר ביצה.

לאחר מכן טבלו לחלוטין את הניירות הבודדים בצלחת פטרי של 90 מיליליטר עם כ-80 מיליליטר מים נטולי יונים. כדי לעורר את בקיעתם, הוסיפו כ-0.25 מיליליטר של תמיסת מזון, ולאחר 24 שעות, העבירו את צלחת הפטרי על משטח שחור. כעת הניחו מקור אור בצד אחד של האור, הזחלים יתרחקו מהאור, מה שיאפשר ספירה ברורה של הפרט הראשון בזחלי הכוכבים.

השתמש בפיפטה כדי להסיר כל זחל לאחר הספירה כדי למנוע ספירה חוזרת של פרטים. לאחר מכן מניחים את ניירות הביצים בצלחת פטרי חדשה לייבוש אדום. לאחר ספירת אצווה שנייה של אבקועים שבוע לאחר מכן, הניחו את ניירות הביצים עם הביצים הנותרות שלא בקעו בצלחות פטרי חדשות של 90 מיליליטר עם כ-80 מיליליטר של תמיסת הלבנה טרייה ודאגו שהניירות יהיו שקועים לחלוטין בתמיסת ההלבנה.

השאירו את הניירות מתחת למכסה אדים למשך הלילה ואז למחרת השתמשו במיקרוסקופ אור כדי לספור את מספר הביצים שלא בקעו. אם ביצית עוברה, היא תציג צבע אוף-ווייט כאשר העיניים מופיעות כשתי נקודות שחורות קטנות זו מול זו בצד הגב. כדי להתחיל, נקו בזהירות את הספסל עם תמיסת טיהור RNA כדי להסיר שאריות נוקלאזות וכדי למנוע פירוק RNA.

לאחר מכן, השתמש במברשת שיער גמל כדי להבריש לפחות 400 ביצי יתושים המכילות עוברים מתפתחים בזמן ההתפתחות. נקודת עניין במטחנות זכוכית. במכסה אדים מוסיפים מיליליטר אחד של טריול וטוחנים את הביצים עד שהן נמעכות לחלוטין, ולאחר מכן מבצעים את מיצוי ה-RNA בטריול, ואחריו משקעי איזופרופנול לפי הוראות היצרן.

כעת השתמש עד מיקרוליטר אחד של D ns לכל עד 10 מיקרוגרם RNA בתגובה של 50 מיקרוליטר למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, דגרו את התגובה בחמישה מיקרוליטרים של מגיב השבתת DNA מושהה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מערבול בעדינות את המתלה שלוש פעמים במהלך תקופת הדגירה.

לאחר מכן צנטריפוגה של תמצית ה-RNA למשך 1.5 דקות ב-10,000 פעמים G ו-Eloqua, ה-RNA המכיל סופרנטנטים לתוך צינורות טריים לריצוף. לבסוף, עיין בטקסט הנלווה לפרטים כיצד לעבד את נתוני הרצף של הדור הבא המתקבלים מקריאה, הכנה, הרכבה והערות ועד לניתוח ביטוי דיפרנציאלי. באיור ראשון זה, הפלואורומטריה של שתי דגימות RNA מייצגות מראה שתי רצועות בכ-2000 נוקלאוטידים.

ה-RNA הריבוזומלי של החרק 28 s מורכב משתי שרשראות פולינוקלאוטידים המוחזקות יחד על ידי קשרי מימן המופרעים בקלות על ידי חימום קצר או חומרים השוברים קשרי מימן. שני המרכיבים המתקבלים הם בערך בגודל זהה ל-RNA ריבוזומלי של 18 שניות בדגימת ה-RNA השנייה, ניתן לראות רמות גבוהות של פירוק בניסוי מייצג זה. הטיפול התקופתי הצילום בקבוצה מייצגת של יתושי אלבופיקטוס הביא לאירועי דיאפאוזה גבוהים ביתושים שגודלו ביום קצר ולאירועי דיאפאוזה נמוכים ביתושים שגודלו ביום ארוך.

למרות שהייתה שונות מסוימת בין השכפולים, למשל, קבוצת היום השני הקצר הראתה אירועי דיאפאוזה נמוכים יותר מאשר השכפולים האחרים. מכלול טריניטי של קריאות מנורמלות דיגיטלית הביא ל-76,377 קוניגים עם אורך קוניג ממוצע של 1020 3.1 ואורך קונטי מקסימלי של 20,892. שימו לב שהתפלגות אורכי קונטי מוטה מאוד לכיוון קונטיגים קצרים יותר.

זה אופייני להרכבת טרנסקריפטום של Denovo. בגרף אחרון זה, ניתוחי הביטוי הדיפרנציאלי מזרימת עבודה דומה של עוברים שגודלו בתנאים מעוררי דיאפאוזה ב-11 ו-21 ימים לאחר מיקום הביציות חושפים 3,128 גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין שתי תקופות הזמן הללו. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שישה עד שמונה חודשים מניתוח אינפורמטיקה אלוהית של יצירת רקמות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי יש לוודא הצלחה בכל שלב לפני המעבר לשלב הבא. לדוגמה, ודא שתנאי הניסוי יצרו DPAs וביציות שאינן דיאפוזה לפני בדיקת תקינות ה-RNA בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון R-T-P-C-R כמותי או ניתוח גנומי השוואתי כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לרקמות או להתפתחות, ביטוי ספציפי של הגנים המעניינים ו/או תהליכי אבולוציה מולקולרית.

אל תשכח שעבודה עם טריול עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בכפפות, מעיל מעבדה ומכסה אדים בעת ביצוע הליך זה.