תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים
22 בנובמבר 2014
DNA וחלבונים-במיוחד רצף שכותרתו עם זיקה או קבוצות כתב ניאון באמצעות methyltransferases DNA או חלבון ואנלוגים cofactor סינטטיים. בהתאם לסגולי כקו-הפקטורים של האנזימים, aziridine או אנלוגים cofactor מופעלים כפולים מועסקים תיוג אחת או שני שלבים.
המטרה הכוללת של הניסויים הבאים היא לסמן באופן ספציפי DNA וחלבונים באמצעות מתיל טרנספראזות, המעבירות באופן טבעי את קבוצת המתיל המופעלת ואת הקו-פקטור Sile l methionine הנקרא aome ל-D-N-A-R-N-A. חלבונים או ביומולקולות קטנות. תיוג שלב אחד מושג על ידי החלפת השמטת הקו-פקטור הטבעי בקו-פקטורים סינתטיים המשנים את מהלך התגובה ומובילים לצימוד אנזימטי של כל הקו-פקטור ולכן תיוג קוולנטי של רצף הסובסטרט תיוג ספציפי של מתיל טרנספראז של DNA מודגם עם ה-DNA הספציפי ל-adine methyl transferase, M-B-S-E-C אחד, אשר מחבר את קופקטור Aine שש BAZ לרצף הזיהוי A-G-C-G-A-T המוביל לרצף, במיוחד ביוטיניליזציה, העברה מכוונת של DNA מתיל טרנספראז של קבוצות מופעלות היא שימוש בחלבון תווית ומודגמת באמצעות MTAs סט שבע תשע, המעביר קבוצת פרו פרגו מ-C שמונה אואין לליזין ארבע של היסטון H שלוש.
שאריות הליזין האלקיליות מסומנות כימית על ידי פלואור ששונה באמצעות כימיית קליק מזורזת נחושת, ובכך מובילה לחלבון מסומן במיוחד. יתרון בשימוש בטרנספראזות מת' לתיוג הוא שיש להם פוטנציאל לכוון ישירות למצעים מקומיים. אדגים זאת על ידי התרוממות רוח ביוטית ספציפית לרצף של פלסמיד, DNA מת' טרנספראז, שינוי חלבון מזורז עם הקופקטור האנלוגי zin ומאפשר הכנסה של מגוון רחב של קבוצות מדווחים בשני שלבים.
אדגים זאת על ידי תיוג פלואורסצנטי של החלבון היסון H 3 והצגת תוצאות מסימון H 3 עם ביוטין. בנוסף, ניתן לסנתז בקלות אנלוגים של הפעלת קופקטור כפול על ידי העמסת S ail, el homocysteine, תוצר הקו-פקטור לאחר העברת קבוצת מתיל עם אלכוהולים פעילים שונים. אנלוגים של קופקטור סינתטי מטוהרים על ידי HPLC פאזה הפוכה, ובמקרים מסוימים ניתן אפילו להפריד את ה-epi Mars בגופרית.
DNA מחייך הוא תיוג המושרה על ידי מתיל טרנספראז ספציפי לרצף של DNA. כאן הרעיון מודגם על ידי תיוג PB 3 22 DNA פלסמיד עם שישה קופקטור BAZ Aine, ו-DNA מתיל טרנספראז הספציפי ל-adine. M-B-S-E-C אחד מתחיל ב-6 BAZ ב-20 מעלות צלזיוס.
לאחר המחשבה, תקן את תערובת התגובה על קרח. הוא כולל מיקרוגרם של פלסמיד, 60 מיקרומולר של שישה BAZ ו-10 מקבילים ל-M-B-S-E-C אחד. רצף הזיהוי שלה על ה- DNA במאגר שינוי.
הקפד להוסיף את ששת ה-BAZ וה-M-B-S-E-C אחד אחרון. ודא שאין AME קשור למת' טרנספראז שאתה משתמש בו מכיוון שהקו-פקטור הטבעי יחסום את התיוג. React עבור פקדים.
החלף את ה-MTAs במים כדי לדמיין שינויים לא ספציפיים בקו-פקטור והוסף מים במקום קופקטור כדי לבדוק אם יש קופקטור טבעי בתרכיז האנזים. כעת מערבבים את התגובות בעדינות עם פיפטה ומדגרים אותן בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה. לקראת סוף הדגירה, תקן תערובת אנדונוקלאז על קרח על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של 10 x טאץ' רקומביננטי, חיץ אחד ל-80 מיקרוליטר מים, ולאחר מכן הוספת 3.3 מיקרוליטר של אנדונוקלאז הגבלה אחד רקומביננטי
.לאחר הדגירה, משוך את התגובות בסיבוב מהיר ולאחר מכן אמת את שינוי ה-DNA לכל אחת מהן. הוסף שני מיקרוליטר של 10 x tak, מאגר אחד ו-28 מיקרוליטר מתערובת האנדונוקלאז. מערבבים את התגובות עם פיפטינג עדין.
כעת דגרו על התגובות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך חצי שעה. לאחר השלמת התגובות, משוך את התמיסה בסיבוב מהיר ואסוף 25 מיקרוליטר מהתגובות לצינורות חדשים. לציטוטים אלה, הוסף 2.4 מיקרוליטר של סטרפטוקוס TTR במאגר של מילימולר אחד לכל מונומר של אדין סטרפט.
עכשיו דגרו על התגובה הזו למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הוסף חמישה מיקרוליטר של שישה x מאגר טעינה לתגובות שהושלמו וגמר 10 מיקרוליטר על ג'ל אגרוס 1% ב-80 וולט למשך כשעה. לאחר מכן דמיין את הרצועות mt A הוא הקיצור של העברה מכוונת של מתיל טרנספראז של קבוצות מופעלות.
בהדגמה זו, המתיל טרנספראז קבע שבע, תשע וקופקטור C מופעל כפול שמונה. Oin משמשים לתיוג ליזין 4 מתוך ההיסטון H 3 שלו. לאחר הפשרת הרכיבים בתיקון קרח 20 תערובות תגובה מיקרוליטר, תמיסת הבדיקה מכילה מאגר שינוי 10 מיקרומולר של היסטון H שלוש והוסיפה 10 מיקרומולר אחרונים של מתיל טרנספראזות בתוספת 600 מיקרומולר של קופקטור.
בצע בקרת אנזים על ידי החלפת מים נטולי יונים ב-C שמונה ON. כמו כן, בצע בקרת קופקטור כדי להמחיש שינויים לא ספציפיים על ידי הכללת 60 מילימולר של ADO met כדי להתחרות בקו-פקטורים הסינתטיים. כעת מערבבים את התגובות עם הדברת צינורות איטית ובודקים את ה- pH שלהם עם רצועות בדיקה. אנלוגים של קופקטור מופעל כפול מאוחסנים בתנאי C.
לכן, ה-pH של תמיסת התגובה שלך יכול להשתנות על ידי הוספת גורם קו-פקטור במידת הצורך בכמויות קטנות של 50 מילי-מולרי נתרן הידרוקסיד כדי להתאים את ה-pH. כעת דגרו את התגובות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים במהלך תיקון הדגירה. ג'ל פולי אקרילאמיד 12% SDS רגע לפני סיום הדגירה, הכינו 20 מיקרוליטר של תערובת חמישה x קליקים המכילה שלושה מילי-מולארי נחושת גופרתי, שלושה מילי-מולארי T-H-P-T-A ליגנד 250 מילי-מולארי, פיתיון נתרן ACO ושישה מילי-מולרי תמרה אזיד.
בתום הדגירה מוסיפים חמישה מיקרוליטרים מתערובת הקליק לכל תגובה ומערבבים את התגובות לאט על ידי ליטוף. הגן על התגובות מפני אור באמצעות נייר כסף ודגר אותן בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר שעה, הסר את עודפי הכלורופורם על ידי זירוז החלבונים.
הוסף לכל תגובה 75 מיקרוליטר מתנול, 18.7 מיקרוליטר כלורופורם ו -50 מיקרוליטר מים ומערבל אותם קצרות לאחר כל הוספה. לאחר הכנת כל צינור, סובב אותם ב -16, 000 גרם למשך חמש דקות. הסר את השלב העליון של ההפרדה מבלי להפריע לשכבת הממשק, המכילה את החלבונים.
כעת הוסף 56.3 מיקרוליטר מתנולים, השלב התחתון והמערבולת. לאחר מכן, סובב את זה כלפי מטה כדי לגלול את החלבון ולהשליך את הספינאט. לאחר מכן מוסיפים 56.3 מיקרוליטר מתנול.
שוב, מערבולת. חזור על הסיבוב ושחזר את הכדורים. הניחו לכדורים להתייבש בצינורותיהם, ללא כיסוי ומכוסים בנייר נטול מוך.
מאוחר יותר ממיסים את החלבונים ב -20 מיקרוליטר של מאגר טעינה SDS עם צבע טעינה. שוטפים את קירות הצינור עם המאגר כדי לאסוף את הגלולה. לאחר מכן דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
לאחר שהצינורות קראו לטמפרטורת החדר, הקדישו אותם לזמן קצר כדי למשוך את תוכנם ולדמיין את החלבונים לפי דף SDS. הפעל ב -120 וולט למשך כ- 90 דקות. תגובת החיוך בוצעה עם ה-DNA methyl transferase M-B-S-E-C אחד, המשנה את שאריות האדנין השניות בתוך רצף ה-A-T-C-G-A-T הדו-גדילי ויש לו אתר זיהוי אחד בפלסמיד PBR 3 2 2, המסומן באדום לבדיקת תיוג פלסמיד.
PB 3 2 2 אותגר עם ההגבלה הרקומביננטית ENDONUCLEASE T one, שיש לה שבעה אתרים ב-PB 3 22 המסומנים בירוק, אחד מהם כלול באתר M-B-S-E-C אחד. כאשר מתרחש תיוג, יש להגן על אתר זה מפני מחשוף בג'ל. זה אושר.
שבר חדש עם 683 זוגות בסיסים הופיע והדגים כי היה תיוג באתר M-B-S-E-C אחד. זה נראה רק בנתיב הבדיקה, שהוא נתיב שלוש. הספציפיות של תגובת התיוג הודגמה על ידי שינוי ניידות חשמלית.
עם הוספת אדין סטרפט, הניידות החשמלית של שבר זוג הבסיסים 683 המסומן בביוטין התעכבה. בעוד שהניידות של השברים ללא ה-M-B-S-E-C אתר אחד לא השתנתה, או תיוג דו-שלבי של מצעי מתיל טרנספראז עם שמונה אנלוגים מופעלים כפולים. נעשה שימוש בהיסטון H שלושה ליזין ארבעה מתיל טרנספראז סט שבע תשע, וקופקטור C שמונה ON הקטן.
אלקטרופורזה של ג'ל שימשה לזיהוי פלואורסצנטי רק בנתיב הבדיקה. נתיב 1 הראה פס פלואורסצנטי המתאים להיסטון H 3 המצביע על כך שהשרשרת הצדדית של הקו-פקטור הועברה באופן ספציפי והחלבון המותאם סומן ב-Tamara Flora.Four. כתם ESI משמש כבקרת טעינה.
כל הנתיבים הראו את אותה כמות חלבון. ניתן לתייג מצעי מתיל טרנספראז גם בתגובות ביוטין עם ביוטין שמקורו ב-AZI. במקום פלואור נבדקו על ידי כתמים מערביים עם חזרת פרוקסידאז.
תיוג מוצלח וספציפי של עדן מצומד נראה לאחר צפייה בסרטון זה. אתה צריך להבין היטב כיצד לתייג DNA ורצף חלבון, במיוחד עם טקסט זיקה, כוח פלואור או תוויות אחרות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי אחרים met והאנלוגים שלו רגישים לטמפרטורה.
טפל בהם תמיד על קרח ואחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. סינתזתי הפעלה כפולה. אנלוגים אחרים של MET עם קבוצת הכתבים כבר מובנים בשרשרת הצדדית והשתמשו בהם כדי לתייג באופן ספציפי DNA בשלב אחד.
אני נרגש במיוחד מהסיכוי לשלב אנזימים שונים וקבוצות דיווח למיפוי DNA באמצעות טכניקות של מולקולה בודדת. חיוך ו-NEC גמישים מאוד, וכמעט כל קבוצה כימית יכולה להיות מועברת לא רק ל-DNA ולחלבונים, אלא גם ל-RNA וקטנה באמצעות העברות מת' מתאימות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה מתמקד בתיוג ספציפי של רצף DNA וחלבונים באמצעות מתיל-טרנספראזים. על ידי שימוש באנלוגים סינתטיים של קו-פקטור, החוקרים משיגים תיוג של צעד אחד או שניים של מצעים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
- כימיה של חלבונים
רקע
- מתיל-טרנספראזים מעביר באופן טבעי קבוצות מתיל מופעלות למצעים.
- אנלוגים סינתטיים של קו-פקטור יכולים לשנות את נתיב התגובה.
- תיוג ספציפי לרצף הוא קריטי לחקר ביו-מולקולות.
- תיוג יכול למקד מצעים טבעיים ביעילות.
מטרת המחקר
- להדגים את השימוש במתיל-טרנספראזים לתיוג ספציפי של DNA וחלבונים.
- לחקור את הפוטנציאל של אנלוגים סינתטיים של קו-פקטור בתגובות אנזימטיות.
- להציג מגוון של קבוצות רפורטר דרך קטליזה של מתיל-טרנספראז.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש ב-aziridine וב-אנלוגים של קו-פקטור מופעל כפלית לתיוג.
- יישום של קו-פקטור ביאוטינילי ב-DNA מתיל-טרנספראז.
- כימיה של קליק קטליזית על ידי נחושת לתיוג חלבונים.
- ביאוטיניליזציה ספציפית לרצף של DNA פלסמיד.
תוצאות עיקריות
- תיוג מוצלח של צעד אחד של DNA באמצעות מתיל-טרנספראזים ספציפיים.
- הדגמה של תיוג חלבונים באמצעות העברה אנזימטית של קבוצות.
- הכנסת קבוצות רפורטר מגוונות דרך תיוג של שני צעדים.
- פוטנציאל למקד מצעים טבעיים ביעילות מוצג.
מסקנות
- מתיל-טרנספראזים הם כלים יעילים לתיוג ספציפי לרצף.
- קו-פקטורים סינתטיים מרחיבים את היכולות של תיוג אנזימטי.
- גישה זו יכולה לשפר את חקר האינטראקציות הביו-מולקולריות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Sequence-specific labeling of nucleic acids and proteins using methyltransferases and cofactor analogues enables precise, covalent modification of target biomolecules. This approach supports target validation and assay development by providing a direct readout of enzyme-substrate interactions. It enhances predictive confidence in early discovery by allowing functional interrogation of methylation-dependent pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of methyltransferase substrate specificity and pathway interrogation.
- Operational Value: Provides a direct, sequence-specific readout for validating enzyme activity.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking of epigenetic targets through covalent labeling of native substrates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, covalent labels for high-confidence detection of methyltransferase activity.
- Operational Value: Enables standardized assay formats using biotin or fluorescent reporters for downstream detection.
- Scalability: Supports multiplexing via distinct cofactor analogues and reporter groups for parallel target profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Labels native histone and DNA substrates, enabling biomarker-aligned readouts in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Confirms on-target activity of epigenetic modulators in preclinical models.
- Pathway Clarification: Maps methylation-dependent signaling cascades through site-specific protein and nucleic acid labeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a functional readout for methyltransferase activity, supporting lead identification and preclinical validation through direct substrate labeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling covalent labeling of known methylation sites on DNA and histone proteins.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via biotinylation or fluorescence labeling for compound effect assessment.
- Analytics: Generates detectable modifications (e.g., streptavidin shift, fluorescence) that allow comparison of enzyme activity across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by labeling native substrates in chromatin and plasmid systems relevant to epigenetic regulation.
- Enterprise Reuse: Platform technology adaptable across DNA, RNA, protein, and small molecule targets using interchangeable cofactor analogues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epigenetic regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and covalent signal stability for longitudinal tracking.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in epigenetic drug discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on direct, enzyme-specific labeling evidence.
Implementation Considerations
- Expertise in enzymology, protein purification, and cofactor handling required.
- Need for temperature-controlled storage (-20°C) and ice-based handling of labile cofactor analogues.
- Requirement for detection systems such as streptavidin-based gels or fluorescence imaging.
- Adaptation considerations for different methyltransferases and substrate contexts (DNA, RNA, protein).
- pH sensitivity of reactions may require adjustment with sodium hydroxide during setup.
