גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד אוסטאוקלסטים ממח עצם עכבר במספרים גדולים. זה מושג על ידי קצירת עצמות מעכברים שעברו המתת חסד. לאחר מכן, התאים משוחררים ממח העצם על ידי שימוש במכתש ועלי כדי לרסק את העצמות במאגר עובדות.

לאחר מכן תמיסת מח העצם מונחת על מדיום הפרדת התאים של שיפוע הצפיפות ומתבצעת הפרדת תאים בשיפוע הצפיפות. לבסוף, השכבה המכילה את התאים המעניינים נשאבת והתאים ממוקמים במדיום אינדוקציה של מיקרופאג' מח עצם. בסופו של דבר, מכתים מלכודות משמשים כדי להראות את נוכחותם של מספר רב של אוסטאוקלסטים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מחלות הקשורות לשינוי בתפקוד האוסטיאוקלסט, שיכולות לנוע בחומרתן ממחלת יילודים קטלנית עקב כישלון ביצירת מרחב מח להמטופואיזיס ועד להיתקל בשכיחות גבוהה יותר בפתולוגיות כגון אוסטאופורוזיס מכיוון שהיא מייצרת שיטה אמינה לבידוד מספר רב של אוסטאוקלסטים ממח עצם העכבר. כדי להתחיל, הביאו 10 מיליליטר של הפרדת תאים בצפיפות זמינה מסחרית, בינונית עד טמפרטורת החדר בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. הנח מאגר פקס של 50 מיליליטר בטמפרטורת החדר לשימוש עם מדיום הפרדת התאים של שיפוע הצפיפות.

לאחר הכנת מדיה נוספת והמתת חסד של עכבר C 57 Black Six, על פי פרוטוקול הטקסט, מקם את העכבר על לוח חיתוך והשתמש באתנול 70%. כדי לרסס אותו, קצרו את העין ועמוד השדרה. לאחר מכן הנח את העצמות בעובדות חוצץ על קרח.

לאחר מכן, בעזרת נייר טישו נקי, הסר את השריר והרקמות הרכות מהעצמות. מניחים את העצמות במכתש ועלי עם שלושה מיליליטר של עובדות חוצץ ומועכים אותן בעדינות. לאחר מכן שאפו את הנוזל המוכתם בדם והעבירו אותו דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר.

הוסף חמישה מיליליטר נוספים של חיץ אפקטים לעצם המרוסקת ומועך עוד יותר לפני העברת הנוזל דרך המסננת לצינור של 50 מיליליטר. המשיכו בתהליך זה עד שהנוזל כבר לא מכתים באדום לפני כדור מח העצם ב-200 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבצע הפרדת שיפוע, שאפו את הסופרנטנטים מכדורית התא והשתמשו ב-10 מיליליטר של מאגר פקס כדי להחיות אותם.

תלו את הגלולה, הטו את הצינור החרוטי של מדיום הפרדת התאים בצפיפות טמפרטורת החדר לכ-30 מעלות, והשתמשו בפיפטה חשמלית עם קצה הפיפטה כנגד המשטח העליון הפנימי של הצינור. שכבו לאט את תמיסת מח העצם על המדיום באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ללא האצה או האטה. סובב את השיפוע ב -200 גרם למשך 15 דקות.

לאחר מכן שאפו את השכבה האמצעית העכורה, המכילה את התאים המעניינים והעבירו אותם לצינור חרוטי חדש. הוסף 20 מיליליטר של מאגר פקס קר כקרח כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן השתמש במיליליטר אחד של מדיום מגרה מיקרופאג' מח עצם כדי להשעות מחדש את כדור התא הסופי לאחר ספירת התאים.

הניחו שני מיליליטר של מדיום מגרה מיקרופאג' בכל באר של צלחת 24 בארות. לאחר מכן הוסף 200,000 תאים לכל באר, צפיפות תאים שתבטיח תרבית אוסטאוקלסט מספקת במבחנה. מערבבים בעדינות את הצלחת ומדגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס מבלי להחליף את המדיום למשך שלושה ימים.

לאחר היום השלישי, החלף את המדיום למדיום אינדוקציה אוסטאוקלסט מח עצם והתחל להחליף אותו מדי יום למשך חמישה עד שבעה ימים. בנקודה זו אמורים להיות גלויים אוסטאוקלסטים מרובי גרעינים גדולים. עיין בפרוטוקול הטקסט לצביעה ולבדיקת הספיגה כפי שניתן לראות כאן.

ניתן לאשר מספר גבוה של אוסטאוקלסטים באמצעות מבחן עמיד לטטרט. אוסטאוקלסטים מצביעים פוספוטטים מוצגים כתאים סגולים גדולים עם גרעינים מרובים באמצעות הפרוטוקול המודגם בסרטון זה. מקובל לבודד אוסטאוקלסטים עם עד 30 גרעינים לתא.

שימוש במשטח מינרלי נחשב לשיטת תקן הזהב להערכת פעילות ספיגה של אוסטאוקלסטים במבחנה. באיור זה, מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של פי 10 מדגים אחוז של משטח מינרלי או בורות ספיגה הנוצרים כמתואר בשחור, מה שמאפשר קביעת יכולת הספיגה של אוסטאוקלסטים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד באופן אמין מספר רב של אוסטאוקלסטים ממח עצם העכבר.