Name: מדידה של דינמיקה רגישים לכוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: למד כיצד לחקור דינמיקת חלבונים רגישים לכוח בתאים חיים באמצעות שילוב טכניקות פלורסנטיות. שיטה זו מספקת מידע ברזולוציה מולקולרית על תגובת חלבונים לכוחות מכניים במכנוביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמך על ידי פרס הקריירה קרן המדע הלאומית (ה-NSF-CMMI-14-54257) כמו גם מענקים American Heart Association (16GRNT30930019), מכוני הבריאות הלאומיים (R01GM121739-01) זכה ד ר הופמן ברנטון, אזרח מדע קרן בוגרת מחקר לאגודה מוענק קת'רין רוטנברג. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את נוף הרשמי של ה-NSF או NIH.

המחברים אין לחשוף.

השיטה סריג-FRAP מאפשרת מדידה ישירה של חלבון רגישים ל"כוח הפזורים דינמיקה, מאפיין זה היה קשה לחקור ישירות בתוך תאים חיים. הרגישות של חלבון דינמיקה מולקולרית לטעון חיוני לתפקוד החלבון כוח המשדר או מתמר. טעינת נדרש עבור השידור של שניהם שנוצר באופן פנימי, שהוחל מבחוץ כוחות, נקרא mechanotransmission, וזה עבור ההמרה של אותם כוחות לאותות נסתרים מבחינה ביוכימית, שנקרא mechanotransduction. אולם, השינוי בעומס יכול להשפיע על משך הזמן שחלבון נשאר כבול, לכן, פחות זמן חלבון מבלה ברינג טען, פוחתים הסיכויים שהכוח צריך להיות מועבר לחלבונ...

הסביבה חוץ-תאי הוא מקור עשיר של סימנים ביוכימיים והן פיזית המכתיבים בהתנהגות התא. בפרט, הטבע הגופני של microenvironment יכולה לתווך תאיים מפתח, כולל צמיחת תאים, העברה של בידול1,2,3,4. Dysregulation של המכניקה של microenvironment הוא מרכיב קריטי למחלות רבות שאין להן עדיין טיפולים נאותים, כגון סרטן5, טרשת עורקים6ו פיברוזיס7. הבנה מלאה של מה תאים להמיר לגירויים פיזיים לאותות נסתרים מבחינה ביוכימית, תהליך הנקרא mechanotransduction, דורש הבהרה של המנגנון המולקולרי תיווכה כוח שידור, לתוך והן התאים ו בתוך מבנים subcellular מרובים.
בתוך מבנים subcellular, חלבונים משתנים כל הזמן איגוד, פעולת ההוצאה מהאוגדן המבוססת על האינטראקציות שלהם עם האיגוד שותפים8. עבור כוחות בהצלחה ישודרו על-פני מרחק פיזי, בטח יש שרשרת רצופה של אינטראקציות חלבון-חלבון, כלומר כי המחזור של חלבון חייבת להיות איטית מספיק לקיים ולשדר לכוח השותף שלה מחייב9. בעוד אינטראקציות חלבון-חלבון כלל מורכבות של מספר שאינו-קשרים הדדיים בין חלבון, האינטראקציה נתפסת לעתים קרובות כמדינה מאוגד יכול העוברות למצב לא מאוגד תחת תנאים שונים10, 11. לאינטראקציה חלבון נתון, זה אפשרי כי כוח יכולים להיות ללא השפעה על חייו של האינטראקציה, המכונה "בונד אידיאלי", להפחית את אורך החיים של האינטראקציה, המכונה "קשר slip," או להגדיל את אורך החיים של האינטראקציה , המכונה "לתפוס בונד"10. לפיכך, יש מערכת יחסים מורכבות בין עומס חלבון חלבון דינמיקה, אשר אנו מתייחסים כאל רגישים ל"כוח הפזורים דינמיקה.
לקראת הבנת ההשפעה של עומס על דינמיקה בונד, בוצעו מספר ניסויים מאוד אינפורמטיבי על רמת מולקולה בודדת. באמצעות חלבונים מבודד, או שברי חלבונים ו טכניקות מניפולציה כגון פינצטה מגנטי, מלקחיים אופטיים מיקרוסקופ כוח אטומי, מחקרים אלה הראו אינטראקציות חלבון רגישים ל"כוח הפזורים עבור מספר הרלוונטיים חלבונים11,12. שניהם אינטגרינים13 ו cadherins14, אשר חשוב עבור יוצרים אינטראקציות מטריצה תא ותא תא, בהתאמה transmembrane חלבונים, הראו שינויים ב- dynamics בשל כדי לטעון. בתוך התא, vinculin הוא גויס בשני talin15 וα-catenin16 באופן תלוי-כוח והוא יכול ליצור קשר לתפוס עם אקטין17, המציינת את תפקיד מכריע עבור vinculin-מוקד הדבקויות (FAs) והן adherens צמתים (AJs ) תחת עומס. מולקולה בודדת מחקרים לאפשר ניתוקה של אינטראקציות חלבון ספציפי להניב פירות ברורה וחד משמעית, אבל הם לא מהווים המורכבות של הסביבה התאית.
ציון דרך ניסויים הראו כי מספר מבנים subcellular, כולל FAs ו AJs, הן mechanosensitive, התערוכה הרכבה משופרת בתגובה נטען שנוצר באופן פנימי או חיצוני שהוחל18,19, 20,21,22. בנוסף, מספר מודלים תיאורטיים הראו כי מכלול mechanosensitive יכול להיות מונע על ידי כוח רגיש חלבון dynamics23,24,25. לבחון הדינמיקות האלה רגישים ל"כוח הפזורים בתוך תאים חיים, ננקטו כמה גישות עקיף. FRAP טכניקות הקשורות לספק מתודולוגיה פשוטה יחסית למדידת חלבון דינאמיקה של תאים26,27,28,29. עם זאת, המדד של עומס חלבון הוגבלה יותר. גישה אופיינית היא להשוות dynamics החלבון בתאים עם ובלי את החשיפה מעכב cytoskeletal להשתמש בהם כדי להפחית הכוללת תא contractility8,30,31. מבחינה מושגית, זוהי השוואה בין לעומס גבוה לבין המדינה עומס נמוך. עם זאת, יש אין כימות של העומס על פני החלבון במצב או, ייתכן שיש לא מכוונות אפקטים הביוכימי של המדכא, כגון אובדן של אתרי קישור מפתח לאורך נימה F-אקטין. גישה אחרת, ספיציפית FAs, כבר למדוד מאמץ כוח מוחלט על המצע על-ידי הפא באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה משוער עומס מולקולרית ולבחון את הקשר עם הדינמיקה של חלבון יחיד בתוך הפא32. בעת גישה זו מאפשרת כימות של הכוח הכולל, אינה מספקת מידע מולקולרי ספציפי. FAs מורכב של מעל 200 חלבונים שונים, רבים מהם יכול לשאת עומס33. לפיכך, מדידת הפלט כוח מוחלט של הפא פוטנציאל מטשטש את האפשרות של מסלולים שידור כוח מרובים, לא אמין לספק מידה של עומס על חלבון ספציפי.
בניגוד גישות הקודם ב- mechanobiology, כניסתו של מתח מבוסס סריג חיישנים מאפשר ישיר מדידה של המון מנוסים על ידי חלבונים ספציפיים בתוך החיים תאים34,35,36. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמשלב מתח מבוסס סריג חיישנים מבוססי FRAP מדד של חלבון דינמיקה. אנו מתייחסים טכניקה זו כאל FRAP סריג. גישה זו מאפשרת את המדידה בו זמנית של עומס חלבון ואת הדינמיקה חלבון, ובכך מאפשר את ההערכה של דינמיקת רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים (איור 1). . כבר, הטכניקה סריג-FRAP הוחל במחקר של הדינמיקות רגישים ל"כוח הפזורים של vinculin חלבון37מקשר מכני. המתח חיישנים פותחו חלבונים רבים הרלוונטיים במגוון מבנים subcellular. לדוגמה, חיישנים פותחו עבור vinculin34 / talin38,39 FAs, cadherins catenins AJs40,41,42, nesprin ב הלינק גרעיניים מורכבים 43, α-actinin44 , filamin36 , שלד התא, ו- MUC-1 ב- glycocalyx45, בין היתר46. בדומה, FRAP הוא שטכניקה נפוץ שימש על mechanosensitive חלבונים בתוך8,הידבקויות מוקד31, צמתי adherens47, קליפת אקטין26, ואת גרעין48. לנוע קדימה, שהטכניקה FRAP סריג צריך להיות בהרחבה החלים על כל אלה חיישנים קיימים או לאחרונה פיתחה חיישנים, המאפשר המידות של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים במגוון רחב של מבנים subcellular והקשרים. למטרה זאת, אנו מספקים נתונים היסטוריים, כללית פרוטוקול ליישום הטכניקה סריג-FRAP ישים במערכות שונות אלו. בתקווה, זה יאפשר מגוון רחב של ניסויים שחקרתי את התפקידים של חלבונים mechanosensitive שונים בוויסות כוח שידור, מתווכים בהתנהגות התא.

<table><tbody><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA</td><td>תרמו פישר</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>16% מדעי</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית</td> פרפורמלדהיד <td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>60x מטרה NA1.35</td><td>אולימפוס</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>שלב אוטומטי</td><td>H117EIX3</td><td></td> <td>מדעית קודמת</td></tr><tr><td>מראה דיכרואית מותאמת אישית</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>T450 / 514rpc</td></tr><tr><td>מותאם אישית mTFP1 מסנן פליטה</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET485 / 20m</td></tr><tr><td>מותאם אישית mTFP1 מסנן עירור</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET450 / 30x</td></tr><tr><td>מותאם אישית Venus מסנן עירור</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET514 / 10x</td></tr><tr><td>DMEM-gfp מדיום הדמיה של תאים חיים</td><td>Sapphire</td><td>MC102</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D5796</td><td>עם L-גלוטמין ונתרן ביקרבונט</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין,</td><td>קורנינג</td> אנושי <td>47743-654</td><td></td></tr><tr><td>שקופית כיול FRAPPA</td><td>Andor</td><td></td><td>מסופקת יחד עם יחידת FRAPPA</td></tr><tr><td>מערכת FRAPPA עם 515 ננומטר לייזר</td><td>אנדור</td><td></td><td></td></tr> עם <tr><td>תחתית זכוכית צלחות פלואורו</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>HEK293-T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hexadimethrine Bromide, Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>בעל גלוקוז גבוה Dulbecco Modified Eagle's</td><td>Medium Sigma Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>JMP Pro תוכנה</td><td>SAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda 10-3 גלגלי סינון ממונעים</td><td>מכשירי סאטר</td><td>LB10-NW</td><td></td></tr><tr><td>LambdaLS מנורת קשת עם 300 W נורת קסנון ללא אוזון</td><td>מכשירי סאטר</td><td>LS / OF30</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB תוכנה</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>תרמו פישר</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph עבור מערכת מיקרו לחות אולימפוס אולימפוס</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ביופטקס</td><td>130708</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ סדרן תאים</td><td>בקמן קולטר</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>מחמם אובייקטיבי</td><td>בינוני Bioptechs</td><td>150819-13</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>תרמו פישר</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>סיגמא אולדריץ</td><td>' D8537</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G מעטפה פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pRRL וקטור</td><td></td><td></td><td>מתנה מד"ר קאם לאונג (אוניברסיטת קולומביה)</td></tr> <tr><td>psPax2 אריזת פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 מצלמה</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT/XF צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>יציב Z Stage Warmer</td><td>Bioptechs</td><td>403-1926</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פליטת ונוס</td><td>Semrock</td><td>FF01-571/72</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

תאים לחוש ולהגיב רמזים פיזי בסביבה שלהם על-ידי המרת גירויים מכניים אותות נסתרים מבחינה ביוכימית בתהליך הנקרא mechanotransduction. שלב חיוני ב- mechanotransduction הוא העברת הכוחות בין סביבות חיצוניים ופנימיים. לשדר הכוחות, חייב להיות מתמשך, רצופה הפיזי הצמדה שנוצרו על ידי סדרה של אינטראקציות חלבון חלבון. אינטראקציה חלבון נתון, עומס מכני יכול לקבל שום השפעה על האינטראקציה, להוביל מהר יותר השיוך של האינטראקציה, או אפילו לייצב את האינטראקציה. הבנת איך מולקולרית עומס מכתיב מחזור חלבונים בתאים חיים יכולים לספק מידע יקר ערך על מצב מכני של חלבון, בתורו שחקרתי את תפקידו ב- mechanotransduction. קיימות טכניקות למדידת dynamics רגישים ל"כוח הפזורים חלבון או חוסר מדידות ישירה של עומס חלבון או להסתמך על המדידות שבוצעו מחוץ להקשר הסלולר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להתאוששות העברה-זריחה פורסטר תהודה אנרגיה לאחר photobleaching (סריג-FRAP) טכניקה, אשר מאפשר את המדידה של חלבון רגישים ל"כוח הפזורים הדינמיקה בתוך תאים חיים. טכניקה זו ישימה פוטנציאלי על כל חיישן מתח מבוסס סריג, בקידום המחקר של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבון במגוון מבנים subcellular, סוגי תאים שונים.

סריג-FRAP מורכב של השילוב של שתי טכניקות פלורסנט, דאגה, FRAP. כפי התמקדנו השפעת עומס חלבון, השתמשנו מתח מבוסס סריג חיישנים34,46. חיישנים אלה מבוססים בדרך כלל על מתח חישה מודול בהיקף של שני חלבונים פלורסנט, כגון mTFP1 ו- VenusA206K, המחוברים באמצעות מקשר (linker) flagelliform (איור 1 א'). כאשר המודול ממוקמת בין ראש ולא זנב של חלבון, זה אפשר למדוד את העומס המופעל על פני החלבון. בעת ניתוח הנתונים סריג, מ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בו זמנית של פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת מתח חיישנים שימדדו עומס חלבון ושחזור פלורסצנטיות לאחר photobleaching למדוד דינמיקה חלבון המאפשר מדידת כוח רגיש דינמיקה חלבונים בתאים חיים.

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום המכונוביולוגיה, כגון כיצד כוחות מועברים ומו חשים בתוך תאים, כמו גם בין תאים וסביבתם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת גישה למידע בקנה מידה מולקולרי לגבי האופן שבו חלבונים מגיבים לכוחות מכניים בתוך ההקשר המקומי של התא החי. למרות שיטה זו הוחלה במיוחד על לימוד וינקולין חלבון הידבקות המוקד, זה יכול להיות מיושם גם חלבונים אחרים רגישים מכנית, כגון טאלין, cadherins או nesprin.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו הגדרת הדמיה נכונה קשה אך הכרחי להצלחת הניתוח. התחל הליך זה עם ביטוי יציב של מבנה חיישן המתח בסוג התא הרצוי, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי להכין מצעים עבור זריעת תאים, לרכוש ארבע מנות 35 מילימטר זכוכית תחתית.עבודה במכסה המנוע של תאים, בצינור חרוט 15 מיליליטר, לעשות ארבעה מיליליטר של 10 מיקרוגרם למיליליטר fibronectin בתמיסת מלח סטרילית פוספט-buffered, או PBS. בעדינות להפוך את הצינור פעם אחת לערבב ולתת את הפתרון לשבת במשך חמש דקות במכסה המנוע של תא התרבות. ואז פיפטה מיליליטר אחד של פתרון פיברונקין על כל צלחת עם תחתית זכוכית.השאירו את תספורת הפיברונאטין על הכלים למשך שעה בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. ואז לספירה את פתרון פיברונאטין ולשטוף פעם אחת עם PBS. השאירו מיליליטר אחד של PBS על הכלים עד התאים מוכנים לזרוע.לאחר ספירת התאים, זרע 30, 000 תאים על כל צלחת זכוכית מצופה fibronectin עם המדיה המלאה המתאימה עבור נפח סופי של 1.5 מיליליטר. אפשר לתאים להתפשט במשך ארבע שעות לאחר הזריעה. שעתיים של התפשטות, שאפו את מדיית הצמיחה ושטוף פעם אחת במדיה הדמיה.השאירו 1.5 מיליליטר של אמצעי ההדמיה. חמם את המיקרוסקופ כמתואר בפרוטוקול הטקסט לפני תחילת הכיול. כדי לכייל את לייזר FRAP, פתח תחילה את חלון תצורת הלייזר.קבעו את הגדרת התאורה להגדרות תאורת FRAP המתאימות לחשיפת לייזר לדגימה. לאחר מכן הגדר את הגדרת התאורה להגדרות התאורה המתאימות להדמיה רק של פלואורופור המקבל. בחר את המטרה לכיול תחת הגדרת מערכת קואורדינטות.בטל את הסימון של לחץ ידנית על נקודות כיול וסמן את האפשרות הצג תמונות במהלך הכיול. הגדר את זמן השתהות ל- 10,000 מיקרו-שניות ואת מספר הפולסים ל- 100. עכשיו למקם את שקופית הכיול, עשוי אתידיום ברומיד אטום בין שקופית זכוכית להחליק כיסוי, לתוך מתאם הבמה עם צד החלקת המכסה למטה.השתמש בהגדרות התאורה של המקבל כדי להתמקד על פני השטח של השקופית, הניתנים לזיהוי כמישור המוקד עם האות הבהיר ביותר. פגמים קטנים ב ציפוי יהיה גלוי כדי לסייע בהתמקדות. הזז את השקופית לאזור עם פלואורסצנטיות אחידה לאורך מישור ההדמיה.לחץ על צור הגדרה עבור הכיול הראשון או על הגדרת העדכון עבור הכיולים הבאים. התוכנה תאתר את תהליך הכיול, תלבין ותזהה באופן אוטומטי את מיקום הנקודה הלבנה. להבטיח כיול מוצלח על ידי הערכת התמונה הסופית, אשר תהיה רשת של שלוש על שלוש נקודות מולבן כי צריך להיות מופץ באופן שווה בפוקוס.שמור את תמונת הכיול לעיון עתידי. הסר את שקופית הכיול ואחסן בבטחה. הכיול צריך להתבצע לפני תחילת כל ניסוי, אך אין צורך לבצע אותו בין דגימות.הכינו את מערך המיקרוסקופיה להדמיית תאים חיים, רצוי עם שלב מחומם ואובייקטיבי, כמו גם בקרת פחמן דו חמצני. אפשר לצייד במשך 20 דקות. עכשיו למקם את אחת הדגימות שנוצר של תאים המבטאים את חיישן המתח לתוך מחזיק מיקרוסקופ להדמיה.אפשר לתאים לצייד במשך 10 דקות. כדי להבטיח את בריאותם של התאים בתמונה, לשמור על הטמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס בתא ההדמיה. השתמש במשאבה פריסטולית כדי להעביר 5%פחמן דו חמצני לח מעל הדגימות ב 15 מיליליטר לדקה כדי לשמור על ה- pH.פתח את הכלי רכישה רב-ממדית, או MDA, והגדר אותו עם פרמטרי דימות FRET, כולל ערכות המסננים השונות. שמור מד"א זה בתיקיה הניסיונית בשם MDA_FRET_date. הגדר מד"א נוסף עם פרמטרי הדמיית FRAP, כולל ערכות המסננים השונות, הגדרות Timelapse ואת היומן לדופק את הלייזר לאחר רכישת טרום אקונומיקה.שמור מד"א זה בתיקיה הניסיונית בשם MDA_FRAP_date. בסרגל הכלים בחלק העליון של המסך, בחר יומן, התחל הקלטה. פתח את חלון מד"א, טען MDA_FRET_date המדינה ולחץ על רכוש.לאחר מכן טען MDA_FRAP_date המדינה ולחץ על רכוש. בסוף הרכישה, בסרגל הכלים בחלק העליון של המסך, בחר יומן, הפסק הקלטה. שמור יומן זה בתיקיה הניסיונית בשם FRETFRAP_date והוסיף אותו לסרגל כלים לגישה נוחה.סגור את חלון מד"א. נווט בדגימה באמצעות רכישת התמונה תחת רכישה, רכישה עם זמן חשיפה מינימלי ומסנן צפיפות נייטרלית כדי לזהות את תאי העניין. הגדר פוקוס אוטומטי רציף על-ידי ניווט להתקנים, מוקד.התמקד ידנית בדגימה עד להגעה למישור ההדמיה הנכון. לחץ על הגדר מוקד רציף והמתן להתאמת המערכת. לאחר שהמערכת מתאימה את עצמה, לחץ על התחל התמקדות רציפה.לאחר מכן מצא תא המבטא את חיישן המתח עם לוקליזציה ברורה למבנה מעניין והצמד תמונה. צייר אזור מלבני של עניין, או ROI, כדי להדגיש היכן להלבין. אחסן מיקום זה של ROI.עכשיו לאתחל FRETFRAP_date יומן, אשר יתחיל את הרכישה של תמונות FRET, ואחריו אתחול של timelapse FRAP. חזור על שלבים אלה עד לרכש של 10 עד 15 ערכות תמונות. לאחר מכן נתח את נתוני FRET-FRAP כמפורט בפרוטוקול הטקסט.להלן תוצאות מייצגות להדמיית FRET של חיישן המתח של הוינקולין, לאחר פילוח ומסכות לבידוד הידבקויות מוקדיות. וריאציה מרחבית של עומס וינקולין ניתן לראות על פני התא. הדמיה וניתוח FRAP יכולים להיות מושפעים מיציבות הידבקות מוקד.הידבקות מוקד כי הוא translocating במהירות במהלך תקופת ההדמיה יכול להיות קשה לעקוב במדויק. לעתים קרובות זה מצוין על ידי עקומת FRAP המכילה הפסקות ובלתי ניתן להפרכה. עבור וינקולין מסוג פראי, יש מתאם הפוך בין עומס החלבון לקצב התחלופה, המציין כי וינקולין התייצב בכוח.הצגת מוטציה בווינקולין כדי להשפיע על הכריכה שלה טאלין תוצאות היפוך של המתאם, המציין כי וינקולין שאינו מסוגל לאגד טלין הוא התערער בכוח. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין דגימות כראוי, להבטיח כי התאים מבטאים את החיישן ברמות אנדוגני ולבחור פרמטרי הדמיה בזהירות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו immunofluorescence, מדידת דינמיקה בקנה מידה תאי או תאים מאתגרים עם מעכבים שונים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד חלבון העניין אינטראקציה עם רכיבים תת תאיים אחרים כדי לתאם את התגובה לכוח.

measurement-force-sensitive-protein-dynamics-living-cells-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגים את השימוש בספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות כדי לזהות את האינטראקציה בין חלבוני פני התא במגעים בין תאי התא. על ידי ביטוי קולטן ההידבקות הטרנסממברנה של עניין המסומן בחלבון פלואורסצנטי וערבוב שתי אוכלוסיות תאים שונות המכילות שתי תוויות פלואורסצנטיות מופרדות ספקטרלית, האינטראקציה הטרנסית בין קולטנים של שני תאים שכנים בעלי פלואורסצנטיות בצבעים שונים מוערכת באמצעות מתאם צולב בתנודות של עוצמת הפלואורסצנטיות.

ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה של חלבונים במגעים עם תאים

הסרטון מדגים שיטה להערכת כוחות קולטן המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון באמצעות ננו-חלקיקי זהב מעוגני פוליאתילן גליקול ובדיקות מתח של סיכות שיער DNA. אינטראקציות תאי T חיוביים ל- CD8 מעוררות התפתחות בדיקה, פולטות פלואורסצנטיות בעוד שגדילי נעילה מקיימים את האות לכימות הכוחות המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון.

שימוש בבדיקות מתח מבוססות DNA כדי להעריך את כוחות הקולטן המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

אנו מתארים טכניקה למדידה בו-זמנית של קינטיקה של קשירת קולטן-ליגנד יחיד מווסתת כוח והדמיה בזמן אמת של איתות סידן בלימפוציט T יחיד.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

לאחרונה פותחו מספר חיישני כוח מבוססי FRET, המאפשרים רזולוציה ספציפית לחלבון של כוח תוך-תאי. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש באחד מהחיישנים הללו, המיועד לקישור של החלבון הקומפלקס Nesprin-2G Nesprin-2G כדי למדוד את כוחות האקטומיוזין על קומפלקס ה-LINC הגרעיני.

פרוטוקול באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) חיישנים ביולוגיים -force למדוד כוחות מכניים ברחבי המכלול הגרעיני LINC

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) בין שתי מולקולות פלואורופור יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבונים בתא החי. כאן, פרוטוקול מסופק כיצד למדוד FRET בתאים חיים על ידי זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

מאמר זה מציג שיטה לניתוח spatiotemporal של נייד, מולקולה אחת Förster העברת אנרגיה תהודה (smFRET) מבוסס בדיקות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. ערכת הכלים החדשה שפותחה מאפשרת לקבוע עקבות זמן smFRET של בדיקות נעות, כולל היעילות הנכונה של FRET ואת העמדות המולקולריות, כפונקציות של זמן.

ניתוח ספטיוטמפורלי דו-ממדי אוטומטי של בדיקות FRET ניידות בעלות מולקולה אחת

למד כיצד לחקור דינמיקת חלבונים רגישים לכוח בתאים חיים באמצעות שילוב טכניקות פלורסנטיות. שיטה זו מספקת מידע ברזולוציה מולקולרית על תגובת חלבונים לכוחות מכניים במכנוביולוגיה.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

גלה סרטונים נוספים