מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד יציבות חלבון תוך-תאית וחוץ-תאית בעוברי דגי זברה חיים. זה מושג על ידי תיוג חלבון מעניין עם חלבון פלואורסצנטי הניתן להמרה לצילום, ועל ידי הזרקת mRNA, קידוד ההיתוך כמו גם צבע פלואורסצנטי לעוברי דג הזברה. לאחר מכן, חלבון ההיתוך הניתן להמרה עובר צילום, אשר מסמן את החלבון.

בדוגמה זו, חלבון ההיתוך מופרש ואז הדעיכה בעוצמת הקרינה המומרת בפוטו תוך-תאי וחוץ-תאי מנוטרת לאורך זמן ומצוידת בפונקציה יורדת באופן אקספוננציאלי על מנת לקבוע את מחצית החיים התוך-תאית והחוץ תאית של חלבון ההיתוך. התוצאות מראות את היציבות in vivo של חלבוני היתוך הניתנים להמרה על סמך הדעיכה באות הפלואורסצנטי לאורך זמן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה התאית וההתפתחותית.

לדוגמה, כיצד יציבות משפיעה על חלוקת החלבון וזמינותו. אנו משתמשים בתוכנה EP שלנו לניתוח נתוני FD DP. EP זמין באופן חופשי בדף האינטרנט שלנו לאחר יצירת mRNA מכוסה בקידוד קידוד חלבון היתוך להמרה של תמונה ירוקה לאדום מעניין, העברת כ-31 עוברי דג זברה בשלב התא לזכוכית בקוטר חמישה סנטימטרים או צלחת פטרי מפלסטיק מצופה ורד אגר המכילה כשמונה מיליליטר של מדיום עוברי.

מוסיפים למנה שני מיליליטר של תמיסת מלאי פרו ניי שהוכנה והופשרה בעבר ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות. מלאו רמקול זכוכית במדיום עוברי ותוך הימנעות מחשיפת העוברים לאוויר או לפלסטיק, העבירו את העוברים לכוס על ידי הטיית צלחת הפטרי תוך הטבילה במדיום. לאחר שהעוברים התיישבו בתחתית הכוס, שפכו את רוב המדיום והשתמשו במדיום טרי כדי להחליף אותו בזהירות.

המערבולת הקלה של המדיום הטרי תגרום לעוברים לאבד את הקוריון המוחלש שלהם. לאחר חזרה על הכביסה, השתמש בפיפטה PEs מזכוכית עם קצה להבה כדי להעביר את העוברים המצופים לכלי הזרקה מצופה אגרוז. לאחר מכן יש להזריק את ה-mRNA וגדיל Alexa 4 88 DExT של שלושה קילודלטון ישירות למרכז התא כדי להבטיח פיזור אחיד של mRNA וצבע.

לאחר תחילת המחשוף, העבירו את העוברים המוזרקים לבאר מצופה אגרוז של 1% עד 2% של צלחת פלסטיק מלאה בעובר, מדיום, ודגרו בחושך בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עד שהעוברים מגיעים לשלב הכדור המאוחר עם מיקרוסקופ סטריאו, זהו אחד עד חמישה עוברים בריאים והשתמשו בפיפטה PEs מזכוכית עם קצה להבה כדי להוציא אותם מהצלחת. הוצא בעדינות את העוברים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה המכיל כמיליליטר אחד של נקודת התכה נמוכה של 1% במדיום עוברי אחד x danios. לאחר מכן, משוך את העוברים בחזרה לתוך הפיפטה יחד עם כמה ארוס.

לאחר מכן הוציאו בעדינות את העוברים והעוברים על הכיסוי. צלחת תחתית זכוכית. כדי לעשות שימוש חוזר בפיפטת הזכוכית, נקה את שאריות הארוס כדי למנוע סתימה על ידי פיפטינג מהיר של מדיום העובר למעלה ולמטה, תוך עבודה מהירה לפני שהארוס מתמצק.

השתמש בבדיקה מתכתית כדי למקם את העוברים כך שמוט החיה יפנה לזכוכית הכיסוי מתחת למיקרוסקופ הסטריאו. עקוב אחר מיקום העוברים והתאם מחדש לפי הצורך עד שהאגרו מתקשה. כאשר האגרו התמצק, השתמש במדיום עובר אחד x danios כדי למלא את צלחת הזכוכית התחתונה.

כדי להתכונן להמרת תמונות, כוונו את החממה ל-28 מעלות צלזיוס והניחו טיפה גדולה של שמן טבילה על המטרה כדי להבטיח שסרט השמן בין המטרה לזכוכית הכיסוי לא יישבר כאשר הבמה עוברת למצבי עובר שונים. במהלך ההדמיה בצורה מאובטחת, הנח את צלחת הזכוכית התחתונה על ה-stagה כך שהצלחת לא תזוז כאשר ה-stagז. לאחר מכן בחבילת התוכנה של המיקרוסקופ הקונפוקלי, הגדירו את מיקומו של כל עובר.

התאם את עומק ה-Z עבור כל עובר ונסה לכוון בערך לאותו מישור בכל עובר באמצעות לייזרים 4 88 ו-5 43 ננומטר. רכוש תמונות לפני המרת תמונות. לאחר מכן הגדר את תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לדמות כל אחד מהמיקומים שהוגדרו בעבר עם תנאי ההדמיה המתאימים.

כל 10 או 20 דקות או קורס זמן של חמש שעות לצילום, המירו את מתג חלבון ההיתוך למטרה של פי 10 וחשפו קבוצות של עוברים לאור UV ממנורת הכספית עם מסנן של כ-300 עד 400 ננומטר בתפוקה של 100% למשך שתי דקות. העבר את המיקוד לאורך ציר Z כדי לקדם המרת תמונות אחידה לאחר המרת תמונות. חזור מיד למטרה של 25 x או 40 x וכדי לוודא שהמיקומים שהוגדרו קודם לכן עדיין מדויקים.

אם המנה זזה במהלך המרת תמונה, הגדירו מחדש את מיקומי העוברים. התחל את קורס זמן ההדמיה ואפשר לו לפעול במשך חמש שעות. שימו לב לזמן שחלף בין המרת התמונות לתחילת ההדמיה עבור כל עובר.

מדי פעם בדקו את הניסוי ועקבו אחר רמת המדיום של דניאלה, והוסיפו עוד במידת הצורך. התחל בבדיקה ויזואלית של מערכי הנתונים של מהלך הזמן מכל עובר. השליכו מערכי נתונים מעוברים שמתו במהלך הדמיה שזזו באופן משמעותי, שיש להם רמות נמוכות מאוד של אות המרה לתמונות, או המכילים אזורים של תאים שנראים חריגים ושהפסיקו לנוע ולהתחלק.

באמצעות חבילת התוכנה מבוססת Python, PI F DAP יוצרים מסכה באמצעות האות Alexa 4 88, שהוא תוך-תאי לחלוטין. על מנת להפריד בין אות שהומר צילום תוך-תאי וחוץ-תאי, החל את המסכה על תמונת הערוץ האדום המתאימה כדי למנוע התחשבות בפיקסלים תוך-תאיים. בעת חישוב עוצמה חוץ-תאית ממוצעת למדידת עוצמה תוך-תאית ממוצעת, הפוך את המסכה, הצג את התמונות המסיכות שנוצרו, ובדוק אותן ויזואלית והשליך מערכי נתונים שבהם מסכות אינן מבחינות במדויק בין חלל תוך-תאי לחלל חוץ-תאי.

השתמש ב-PI F DAP כדי לחשב עוצמות פלואורסצנטיות חוץ-תאיות ותוך-תאיות ממוצעות עבור כל תמונה. לאחר מכן התאם את נתוני הקרינה כפי שמוצג כאן על פי ההנחיות בפרוטוקול הטקסט, וחשב את החלבון החוץ-תאי והתוך-תאי. חצי חי טאו משיעור האישור.

פזילת קונסטנס K היא חלבון מופרש הגורם לביטוי של גנים אנדודרמליים מיס במהלך העובריות של דג הזברה. בניסוי זה, העוברים הוזרקו במשותף עם Alexa 4 88 dextan ו-mRNA המקודד DENDRA 2 ועברו בדיקת F DAP. כפי שמוצג כאן, עוצמת האות המומרת בתמונה חוץ-תאית פוחתת עם הזמן.

באמצעות PI F dap, נוצרו פרופילי עוצמה חוץ-תאיים מ-23 עוברים והנתונים הותאמו למודל פינוי מסדר ראשון. התוצאות מצביעות על זמן מחצית חיים ממוצע של 116 דקות. פרופילי עוצמה וחלבון דומים.

מחצית חיים הושגה כאשר המרווחים בין ההדמיה היו 10 או 20 דקות. מה שמרמז על כך שהלבנת תמונות או המרת תמונות בשוגג לא תרמו באופן משמעותי לשינויי עוצמה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בריקבון פלואורסצנטי לאחר המרת תמונות.

למדוד in vivo. זמן מחצית חיים של חלבוני היתוך הניתנים להמרה בעוברי דג זברה חיים.