תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע מיפוי גורל ומעקב אחר שושלת של תאים בודדים נבחרים בעוברי דג הזברה. זה מושג על ידי צימוד כימי של פלואורסצאין בכלוב לדקסטרן במשקל מולקולרי גבוה. לאחר מכן, דקסטרן הפלואורסצאין המוכן בכלוב מוזרק מיקרו לעוברי דג הזברה, אשר לאחר מכן מופעל בתאים נבחרים באמצעות ספיגת שני פוטונים.

לאחר הפעלת הפוטו של העוברים, מבוצעת אנליזה אימונוהיסטוכימית לאיתור דקסטרן הפלואורסצאין הלא מזווג על מנת למפות את התאים המופעלים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע את תרומת השושלת ולוקליזציה של הרקמות של התאים הבודדים המופעלים בצילום. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית, הוא שניתן להשתמש בה כדי לתייג באופן דיפרנציאלי תאים בודדים למיפוי אמונה.

שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית כגון כיצד תאי מבשר לא ממוינים יכולים לתרום לסוגי רקמות שונים, הדגמה חזותית היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הרכבת העובר והפעלת הצילום על סמך תיאור טקסט בלבד. לפני שמתחילים, סנתז דקסטרן פלואורסצאין בכלוב ואחסן אותו בצינורות מכוסים בנייר כסף. לאחר מכן הזרקת מיקרו לעוברים בשלב התא אחד עד שניים עם הכלוב המסונתז פלואורסצאין דקסטרן.

לאחר שהעוברים הגיעו לשלב ההתפתחות המתאים, יש לצפות אותם. לאחר מכן הרכיבו את העוברים המצופים באווירוס נמס נמוך להפעלת צילום. כאשר התעורר התמצק עומס תוכנת LSM חמש 10

הנח מסנן צהוב שקוף בנתיב אלומת האור הלבנה ולאחר מכן בחר סרוק תמונה חדשה ולחץ על התחל מצב מומחה. בחר את לשונית הלייזר, הפעל את מגהץ הארגון ואת מקורות הלייזר mi tai. הגדר את אורך הגל של מי טאי לשבעה 40 ננומטר.

לאחר מכן, בחר בכרטיסייה תצורה. הגדר את תצורות הנתיב האופטי עבור יון הארגון ולייזר mi tai. לאחר מכן בחר את הכרטיסיה סריקה.

שנה את המטרה ל 20 כפול 0.8. הגדר את מהירות הסריקה המקסימלית על ידי לחיצה על מקסימום, הגדרת מצב, שיטה ומספר לקו, ממוצע ואחד בהתאמה תחת לשונית הערוצים, בטל את הבחירה בכל מקורות הלייזר למעט ה-mi tai. לאחר מכן, הנח מד מתח בנתיב האלומה האופטית, ולאחר מכן בחר בלחצן con כדי להפעיל סריקה רציפה.

כוונן את אחוז השידור עד שמד ההספק קורא הספק לייזר ממוצע של 47 מילי-וואט. לאחר מכן עצור את הסריקה על ידי בחירה בלחצן העצירה תחת הכרטיסייה ערוצים. בטל את הבחירה במקור הלייזר מי טאי ובחר את מגהץ הארגון.

לאחר מכן בחר שוב את כפתור ה-XY המהיר מתחת ללשונית הערוצים, כוונן את חור הסיכה. זהה רווח, הגביר היסט והגביר שוב עבור לייזר הברזל ארגון כדי להשיג את איכות התמונה הטובה ביותר. באמצעות בקר הבמה, מצא והתמקד בתא להפעלה, ולאחר מכן לחץ על כפתור העצירה באמצעות כלי החיתוך, חתוך את התא המופעל כך שמקדם החיתוך תחת לשונית המצב יציג 50 עד 70.

לאחר מכן עצור את הסריקה על ידי בחירה בלחצן העצירה תחת לשונית הערוצים. בטל את הבחירה בלייזר יון ארגון ובחר בלייזר הטאי שלי בלשונית המצב. הגדר את מהירות הסריקה ל-31.46 שניות.

לאחר מכן בחר בכפתור היחיד כדי להתחיל את הסריקה להפעלת שני הפוטונים של דקסטרן הפלואורסצאין הכלוא בכלוב של התא שנבחר. לאחר ההפעלה, עבור ללשונית הערוצים וכעת בטל את הבחירה בלייזר mi tai ובחר מחדש את לייזר יוני הארגון. לאחר מכן, תחת מצב, הגדר את גורם הזום לאחד. הבא.

תחת כותרת המהירות, לחץ על מקסימום כפתור כדי להגדיר את מהירות הסריקה המהירה ביותר. כדי לסקור את האזור המופעל עם תמונה, בחר מהיר xy. לאחר מכן בחר את לשונית הערוצים והתאם את חור הסיכה וזהה שוב, בדוק שהאזור המופעל על ידי צילום אינו מסולק בלייזר.

לאחר הכנת הצילום, העוברים המופעלים לזיהוי חיסוני של פלואורסצאין דקסטרן לא מזווג על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר בכתב היד המצורף. שטפו את העוברים שש פעמים ב-PBT ופעמיים במאגר AP. לאחר מכן העבירו את העוברים לתשע צלחות באר במאגר AP.

לאחר מכן, שאפו את מאגר ה-AP והוסיפו N-B-T-B-C-I-P. עצור את התפתחות הכתם N-B-T-B-C-I-P על ידי שאיבת תמיסת N-B-T-B-C-I-P. לאחר מכן שטפו את העוברים ב-PBT.

כעת שחזרו את העוברים ונערו אותם על פלטפורמה מסתובבת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן חזור על הכביסה PBT פעמיים נוספות. לבסוף, הרכיבו את העוברים ב-0.6% התכה נמוכה ורכשו תמונות של התאים המופעלים באמצעות מיקרוסקופ מורכב זקוף.

באיור זה, תמונת שדה בהיר המוצגת משמאל ותמונה פלואורסצנטית המוצגת מימין של עובר דג זברה מוזרק מיקרו פלואורסצאין דקס בכלוב לפני הפעלת הצילום. כפי שמוצג כאן, העובר הופעל בתמונה באחד הסומיטים המסומנים על ידי החץ באיור השדה הבהיר משמאל עם אורך גל של שבעה 40 ננומטר, זמן סריקה של 31 שניות ועוצמת לייזר ממוצעת של 47 מילי-וואט. באיור מימין לאחר הפעלת הצילום ניתן לראות פלואורסצנטיות מהדקסטרן הפלואורסצאין הלא מזווג באיור זה.

צביעה חיסונית של פלואורסצאין דקסטרן לא מיושן מתוארת אזור קטן בצלחת הרוחבית, מזודרם של 10. אז עובר שלב הקרדית הופעל באמצעות אותם פרמטרי לייזר כמו באיור הקודם באמצעות הליך הזיהוי החיסוני. ניתן לזהות את האזור המופעל כפי שמצוין כאן על ידי החץ, עם צביעת רקע מינימלית בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע אנליזות נוספות כגון צביעה חיסונית לסמנים ספציפיים לרקמות שונות על מנת לאפיין טוב יותר את מיקומם וגורלם של תאים מסומנים. באמצעות טכניקה זו, היא סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של כלי הדם לחקור את מקור העורקים בתאי אב ורידיים בהתפתחות עוברי דג הזברה. אל תשכח שכאשר עובדים עם ריאגנטים כימיים כגון NBT ו-BCIP, הם עלולים להיות מסוכנים ביותר ותמיד יש ללבוש כפפות.