Name: תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: למד מיפוי גורל של תאים בודדים בדגי זברה באמצעות פעילות פוטו בשני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תרומת תאי קדם לסוגי רקמות שונים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ג&#39;יי צ&#39;ן מתן בכלוב והעמסת-dextran פרוטוקול סינתזה. מחקר זה נתמך על ידי מצעד הפרוטות פרס 5-78-FY09, איגוד הלב האמריקאי הפרס 09BGIA2090075, ואת הפרס NIH / NHLBI HL107369 R01-01 אס תודה מיוחדת ג Closson לסיוע במיקרוסקופ שלו.

<ol><li>Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mEosFP-based+green-to-red+photoconvertible+subcellular+probes+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants.</a> Plant physiology. 154, 1573-1587 Forthcoming.</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature. 6, 153-159 (2009).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature protocols. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Watanabe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-organelle+tracking+by+two-photon+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+express%22%5BJournal%5D)">Single-organelle tracking by two-photon conversion.</a> Optics express. 15, 2490-2498 (2007).</li>
<li>Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+embryonic+blood+in+zebrafish%3A+multi-+and+unipotential+lineages+are+segregated+at+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation.</a> Developmental cell. 16, 744-755 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindling+fluorescent+proteins+for+precise+in+vivo+photolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling.</a> Nature. 21, 191-194 (2003).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).</li>
<li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li>
<li>Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gridlock+signalling+pathway+fashions+the+first+embryonic+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery.</a> Nature. 414, 216-220 (2001).</li>
<li>Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+progenitor+for+haematopoietic+and+endothelial+lineages+in+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula.</a> Nature. 443, 337-339 (2006).</li>
<li>Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Labeling+of+Zebrafish+Cells+with+Laser+Uncagable+Fluorescein+Dextran%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran.</a> J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).</li>
<li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiemz%2C+MH+%22Laser-Tissue+Interactions%3A+Fundamentals+and+Applications%22">Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications</a>. , Springer. (2003).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein and gene expression.</a> Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<html> מאמר זה מתאר שיטה צדדי למיפוי תא בודד גורל בהתבסס על photoactivation של בכלוב והעמסת-dextran. משחררות רפרוף של בכלוב והעמסת-dextran בתאים בודדים מושגת באמצעות שני פוטונים הקליטה של ​​לייזר femtosecond מאי טאי מצמידים את המיקרוסקופ LSM 510 META Zeiss confocal. שברחה מכלוב והעמסת-dextran בתאים photoactivated הוא מדמיין במהירות באמצעות הליך פשוט אימונוהיסטוכימיה. בפרוטוקול זה הגל שני הפוטונים קליטה של ​​photoactivation בכלוב והעמסת-dextran הוא 740 ננומטר. אורך גל זה נקבע באופן ניסיוני על ידי photoactivating בכלוב והעמסת-dextran עוברים wildtype מוזרק. גל עירור הלייזר היתה מגוונת 600-800 ננומטר, ועל נוכחות או העדר והעמסת הקרינה שלאחר ההפעלה נקבע איכותית. מצאנו כי 740 ננומטר המיוצר ההפעלה החזקה והעמסת האות הבאה. באופן אידיאלי, 740 ננומטר צריך לעבוד עבור כל מערכות המודל, אך אנו מייעצים בדיקות מגוון רחב של אורכי גל כדי לקבוע את אורך הגל האופטימלי שני הפוטונים עירור למדגם שלך. בשנת עוברים בכלוב והעמסת-dextran wildtype מוזרק, עבור גל שני הפוטונים כל עירור נבדק גם אנחנו מגוונים את הכוח לייזר הממוצע. עבור גל עירור של 740 ננומטר, כוח לייזר ממוצע של 47 mW המיוצר אות והעמסת חזקה על האזור הפעיל בהשוואה נמוך סמכויות לייזר הממוצע. גבוהה סמכויות לייזר הממוצע לא לייצר אותות והעמסת חזק, אבל אבלציה המושרה של הרקמה. מאז לייזר פולסים femtosecond יעילים ב ablating רקמות ביולוגיות 15, אנו ממליצים על קביעת סף ממוצע לייזר כוח photoactivation כי ימנע אבלציה רקמות. שני הפוטונים הקליטה מתרחשת בתוך אינטראקציה נפח קטן. כדי להבטיח הפעלה ראויה של בכלוב והעמסת-dextran, התא חייב להיות מובא אל המוקד הנכון. בפרוטוקול לעיל, תאים GFP חיובית היו צילמו בו זמנית תחת אור לבן כדי לאשר להתמקד התא. לכן, רכישת אור לבן, בנוסף לערוצים אחרים מומלץ. לאחר אישור להתמקד התא, פרוטוקול שלנו מציע מגדלת התא הפעיל. גורם זום של 50-70 הוא הציע, עם זאת, ערך זה תלוי בגודל של התא הנבחר. הגדלת זום מבודד את התא הפעיל של תאים סמוכים, ומגביל את אזור הסריקה להפעלת שני הפוטונים. באופן אידיאלי, לסרוק את האזור צריך לכסות שטח גדול של התא. איתור של תאים מופעל יחיד דורש כי מכתים רקע להיות מינימלית. בפרוטוקול immunodetection לעיל חשוב כי המדגם הוא חסום חוסם חיץ במשך 5 עד 6 שעות (שלב 4.13). בעת פיתוח עם NBT / BCIP, שברחה מכלוב והעמסת-dextran צריך להיות גלוי ב 10 עד 20 דקות. אם מכתים רקע חזק, אנו ממליצים זמן ארוך יותר חסימת ושוטף נוספת כדי להסיר את הנוגדן (שלב 4.17). איורים 1 ו -2 לספק תוצאות נציג photoactivation ו immunodetection. באיור 1, מוקדם 1 - ל 2 תאים בשלב עוברי wildtype הוזרקו בכלוב והעמסת-dextran. עוברים הועלו על somitogenesis באמצע ועלה נמוך ההיתוך agarose בכיוון לרוחב. איור 1 (a, b) מתארים brightfield ותמונות הניאון של העובר לפני photoactivation. ראיות כי העובר נשאר שברחה מכלוב באה לידי ביטוי בהעדר והעמסת הקרינה באיור 1 (ב). אזור קטן בתוך somite הופעל עם אורך גל של 740 ננומטר במשך 31 שניות באמצעות כוח לייזר ממוצע של 47 mW, איור 1 (ג; החץ). לאחר ההפעלה, שני הפוטונים משחררות רפרוף של והעמסת-dextran התרחשו כפי שמוצג על ידי הקרינה מאזור מופעל, איור 1 (ד; החץ). הפעלה לא לוותה אבלציה לייזר, כמו רקמת somitic איור נשאר שלם, 1 (ג). איור 2 מדגים את immunodetection שברחה מכלוב של והעמסת-dextran. אזור קטן והמזודרם את הצלחת רוחבי של העובר 10-somite שלב היה photoactivated באמצעות פרמטרים לייזר זהה כאמור באיור 1. העובר גדל ומעובד באמצעות צעדים 4.1 עד 4.20. החץ באיור 2 מאתרת באזור הפעיל, כפי שצוין על ידי הצטברות של משקע כחול. רק המיקום מופעל מזוהה בבירור בלי להתערב מכתים רקע. ההכנה של פתרונות: 1 X PBT (1 L) 100 מ&quot;ל 10 X PBS 2 גרם BSA 10 מ&quot;ל 20% Tween 10 X PBS (1 L) 80 גרם NaCl 2 גרם KCl 6.1 גרם Na 2 HPO 4 1.9 גרם KH 2 PO 4 DDH 2 O ל L 1 עד 7.3 pH Paraformaldehyde 4% (160 מ&quot;ל) Paraformaldehyde 32% (שני בקבוקונים 10 מ&quot;ל) 8 X 20 מ&quot;ל PBS 132 מ&quot;ל DDH 2 O &quot;jove_content&gt; AP חוצץ (50 מ&quot;ל) 1 מ&quot;ל 5 M NaCl 2.5 מ&quot;ל 1 M MgCl 2 5 מ&quot;ל 1 M טריס pH 9.5 250 Tween 20% μL 41.25 מ&quot;ל DDH 2 O פתרון נוגדן (למדגם 1) 5.5 אצטון μL אבקת 40 μL PBT 0.8 LS μL 0.1 μL נוגדן Anti-והעמסת-AP LS 2% (360 μL למדגם 1) 7.2 LS 100% μL 352.8 μL PBT 1 X Danieau מדיה (1 L) ‡ 11.6 mL 5 M NaCl 700 μL 1 M KCl 400 μL 1 M MgSO 4 600 μL 1 M Ca (NO 3) 2 5 מ&quot;ל 1 M HEPES DDH 2 O ל L 1 pH להסתגל 7.6 ‡ Danieau הוא פתרון אידיאלי עבור מלח גידול עוברי דג הזברה dechorionated. מדיה אחרים עשויים לשמש, בתנאי שהם פתרונות איזוטוני עם osmolarity כראוי (~ 300 mOsm עבור דג הזברה) NBT מניות (1 מ&quot;ל) 50 מ&quot;ג Nitro כחול Tetrazolium 0.7 מ&quot;ל אנהידריד לפוראמיד דימתיל 0.3 מ&quot;ל DDH 2 O BCIP מניות (1 מ&quot;ל) 50 מ&quot;ג 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl פוספט 1 מ&quot;ל אנהידריד לפוראמיד דימתיל NBT / BCIP בפיתוח פתרון 1 מ&quot;ל AP חיץ 4.5 NBT μL מניות 3.5 BCIP μL מניות אצטון אבקת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 20 דגים בוגרים להקפיא אותם בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים את הדג הקפוא עם במכתש ועלי לאבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את אבקת דגים לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את צינור חרוטי עם אצטון 100%. וורטקס את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התחתית מקסימום סל&quot;ד במשך 10 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את גלולה אחרת 3 פעמים אצטון 100% ספין התחתית מקסימום סל&quot;ד במשך 10 דקות. עד לשטוף האחרון supernatant אמור להופיע ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף אצטון 100% עד שוב את הכדור ולתת הצינור לעמוד בטמפרטורת החדר. החלקיקים צפופים יותר יהיה להסתפק, ואילו חלקיקי עדין יישארו ההשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג חלקיקים לתוך צינור חדש. Aliquot אבקת פתרון לתוך צינורות נפרדים ולאחסן אותם ב -20 ° C. </li></ol>

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> CMNB-בכלוב והעמסת SE </td><td> Invitrogen </td><td> C20050 </td></tr><tr><td> 10 kDa Aminodextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1860 </td></tr><tr><td> זבה Desalt טור ספין </td><td> לנקב </td><td> 89889 </td></tr><tr><td> התכה נמוכה agarose </td><td> Amresco </td><td> 0815-100 גרם </td></tr><tr><td> נתרן borate </td><td> Amresco </td><td> 1131117-100 גרם </td></tr><tr><td> Tricaine Methylsulfonate / MS222 </td><td> מחקר אורגניקס </td><td> 1347A </td></tr><tr><td> Anti-והעמסת-AP </td><td> רוש </td><td> 11376622 </td></tr><tr><td> חסימת חיץ </td><td> רוש יישומית למדעים </td><td> 11 096 176 001 </td></tr><tr><td> Maleic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> MO375-500 גרם </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 15714 </td></tr><tr><td> NBT </td><td> סיגמא </td><td> טבליות של 250-I8377 </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> PI-34040 </td></tr><tr><td> Microinjector </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> PLI-2000 </td></tr><tr><td> LabTek החדרים coverglass שקופיות </td><td> Nalge Nunc הבינלאומי </td><td> 155380 </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Invitrogen </td><td> AM2544 </td></tr><tr><td> כבש בסרום </td><td> Invitrogen </td><td> 16070096 </td></tr><tr><td> LSM 510 META NLO </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> 20X 0.8 NA האוויר apochromatic אובייקטיבי </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> מסנן צהוב שקוף </td><td> תיאטרון בית בע&quot;מ </td><td> Roscolux מסנן צבע סדין: 312 </td></tr></tbody></table>

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

היכולת דיפרנציאלי תווית תאים בודדים יש השלכות חשובות בביולוגיה התפתחותית. למשל, לקבוע כיצד היווצרות הדם, הלימפה, כלי הדם שושלות להתעורר עוברים לפתח מחייב מיפוי גורל השושלת העתקה של תאים מבשר מובחן. לאחרונה, חלבונים photoactivatable הכוללים: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, קאךה 4-7, pKindling 8, KikGR 9, 10 קיבלו אינטרס רחב כמו בדיקות מעקב התא. ספקטרום הקרינה של החלבונים האלה רגישים ניתן להמיר בקלות עם עירור UV, המאפשר אוכלוסייה של תאים כדי להבחין בין אלה סמוכים. עם זאת, photoefficiency של החלבון הפעיל עלול להגביל בטווח הארוך מעקב תא 11. כחלופה חלבונים photoactivatable, בכלוב והעמסת-dextran כבר בשימוש נרחב במודל מערכות העובר 7, 12-14. באופן מסורתי, כדי uncage והעמסת-dextran, עירור UV מבית המנורה הקרינה או לייזר יחיד UV פוטון נעשה שימוש, אולם מקורות כגון להגביל את הרזולוציה המרחבית של photoactivation. כאן אנו מדווחים פרוטוקול מפת גורל, זכר השושלת, וכדי לזהות תאים תווית אחת. תאים יחיד בעוברים הזריקו בכלוב והעמסת-dextran הם photoactivated עם קרוב אינפרא אדום פעימות לייזר המופק לייזר femtosecond טיטניום ספיר. לייזר זה נהוג בכל שני הפוטונים מיקרוסקופים confocal כמו מיקרוסקופ 510 LSM NLO META בשימוש בנייר זה. מאז רקמות ביולוגיות שקופה קרינה אינפרא אדום הקרוב 15, קטניות הלייזר יכול להיות ממוקד עמוק ללא משחררות רפרוף תאים מעל או מתחת למישור המוקד נבחרים בתוך העובר. לכן, שאינו ליניארי שני הפוטונים קליטה מושרה רק במוקד גיאומטריים uncage והעמסת-dextran בתא בודד. כדי לזהות את התא המכיל שברחה מכלוב והעמסת-dextran, אנו מתארים פרוטוקול פשוט אימונוהיסטוכימיה 16 במהירות כדי להמחיש את התא הפעיל. פרוטוקול הפעלה וזיהוי המוצג במאמר זה הוא צדדי יכול להיות מיושם על כל מערכת מודל. הערה: חומרים כימיים המשמשים פרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלה המצורפת בסוף המאמר.

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

ליכולת לסמן באופן דיפרנציאלי תאים בודדים יש השלכות חשובות בביולוגיה התפתחותית. לדוגמה, קביעת האופן שבו תאים המטופויטיים, ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע מיפוי גורל ומעקב שושלת של תאים בודדים נבחרים בעוברים של דגי זברה. דבר זה מושג על ידי צימוד כימי של פלואורסצאין כלוב (caged fluorescein) לדקסטראן בעל משקל מולקולרי גבוה. לאחר מכן, הפלואורסצאין דקסטראן הכלוב שהוכן מוזרק במיקרו-הזרקה לעוברים של דגי זברה, ולאחר מכן מופעל פוטו-כימית בתאים נבחרים באמצעות ספיגה של שני פוטונים.לאחר הפעלה פוטואופטית של העוברים, מבוצע ניתוח אימונוהיסטוכימי לגילוי הפלואורסצאין-דקסטראן ששוחרר מהכלוב (uncaged) כדי למפות את גורל התאים שהופעלו. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע את תרומת השושלת ואת המיקום הרקמתי של תאים בודדים שהופעלו פוטואופטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית, הוא שניתן להשתמש בה כדי לסמן באופן דיפרנציאלי תאים בודדים לצורך מיפוי גורל.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון האופן שבו תאי מקור לא מובחנים יכולים לתרום לסוגים שונים של רקמות. הדגמה ויזואלית היא קריטית, מאחר ששלבי קיבוע העובר והפוטו-אקטיבציה קשים ללמידה על בסיס תיאור טקסטואלי בלבד. לפני התחלת העבודה, סנתזו caged fluorescein dextran ואחסנו אותו במבחנות מכוסות בנייר אלומיניום. לאחר מכן, בצעו מיקרו-הזרקה לעוברי שלב תא אחד עד שניים של ה-caged fluorescein dextran שסונתז.לאחר שהעוברים הגיעו לשלב הפיתוח המתאים, יש לצפות אותם. לאחר מכן, יש להטמיע את העוברים המצופים באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה לצורך הפעלה פוטואקומיסטית. כאשר האגרוז התמצב, יש לטעון את תוכנת ה-LSM 510.הנח מסנן צהוב שקוף במסלול קרן האור הלבן, לאחר מכן בחר בסריקת תמונה חדשה (scan new image) ולחץ על מצב מומחה (start expert mode). בחר בלשונית הלייזר (laser), והפעל את מקורות הלייזר argon ion ו-mi tai. הגדר את אורך הגל של ה-mi tai ל-740 nm.בשלב הבא, בחרו בלשונית ה-config. הגדירו את תצורות הנתיב האופטי עבור ה-argonne ion וה-mi tai laser. לאחר מכן, בחרו בלשונית ה-scan.שנו את העדשה לאובייקטיב של 20x0.8. הגדירו את מהירות הסריקה המקסימלית על ידי לחיצה על max set mode method והגדרת המספרים ל-line ו-mean בהתאמה תחת לשונית channels; בטלו את הבחירה בכל מקורות הלייזר למעט ה-mi tai. לאחר מכן, מקמו מד הספק (power meter) במסלול הקרן האופטית, ובחרו בכפתור con כדי להפעיל סריקה רציפה.כווננו את אחוז ההעברה עד שמד ההספק יראה הספק לייזר ממוצע של 47 milliwatts. לאחר מכן, הפסיקו את הסריקה על ידי לחיצה על כפתור העצירה תחת הלשונית channels. בטלו את הבחירה במקור הלייזר mi tai ובחרו ב-argonne iron.לאחר מכן, בחרו שוב בכפתור fast XY תחת לשונית הערוצים (channels), וכווננו את הפינהול (pinhole). כווננו את ה-Detect gain, את ה-amplify a offset ואת ה-amplify שוב עבור לייזר הארגון (Argonne iron laser) כדי להשיג את איכות התמונה הטובה ביותר. באמצעות בקר הבמה, אתרו ומקדמו את התא שברצונכם להפעיל, ולאחר מכן לחצו על כפתור העצירה (stop). בעזרת כלי החיתוך (crop tool), חתכו את התא המופעל כך שגורם החיתוך (crop factor) תחת לשונית המצב (mode) יציג ערך של 50 עד 70.לאחר מכן, הפסיקו את הסריקה על ידי לחיצה על כפתור העצירה (stop) תחת לשונית הערוצים (channels). בטלו את הבחירה בלייזר ארגון (argon laser) ובחרו בלייזר My Tai תחת לשונית המצב (mode). הגדירו את מהירות הסריקה ל-31.46 שניות.לאחר מכן, בחרו בכפתור הבודד כדי להתחיל את הסריקה להפעלה דו-פוטונית של ה-caged fluorescein dextran בתא הנבחר. לאחר ההפעלה, עברו ללשונית הערוצים (channels), בטלו כעת את הבחירה בלייזר ה-mi tai ובחרו שוב בלייזר הארגון (argon ion laser). לאחר מכן, תחת מצב (mode), הגדירו את מקדם הזום ל-1. לשלב הבא.תחת כותרת המהירות (speed), לחצו על כפתור ה-max כדי להגדיר את מהירות הסריקה המהירה ביותר. כדי לבחון את האזור שהופעל פוטו-כימית, בחרו ב-fast xy. לאחר מכן, בחרו בלשונית הערוצים (channels), כווןנו את ה-pinhole ובצעו גילוי (detect) פעם נוספת, ובדקו שהאזור שהופעל פוטו-כימית לא עבר אבלציה בלייזר.לאחר הכנת העוברים המופעלים פוטו-כימית לזיהוי אימונו-פלואורסצנטי של fluorescein dextran ששוחרר מכלוב (uncaged), בהתאם לפרוטוקול המפורט בכתב היד המצורף, שטפו את העוברים שש פעמים ב-PBT ופעמיים בבופר AP. לאחר מכן, העבירו את העוברים ללוחיות בעלות תשעה בארות המכילות בופר AP.שאיפ את בופר ה-AP והוסף N-B-T-B-C-I-P. עצור את התפתחות הצביעה של ה-N-B-T-B-C-I-P על ידי שאיפת תמיסת ה-N-B-T-B-C-I-P. לאחר מכן, שטוף את העוברים ב-PBT.כעת הוציאו את העוברים ונערנו אותם על פלטפורמה מסתובבת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חזרו על השטיפה ב-PBT פעמיים נוספות. לבסוף, קבעו את העוברים ב-0.6% low melting agarose ורכשו תמונות של התאים שהופעלו פוטו-כימית באמצעות מיקרוסקופ קומפוזיט אנכי.באיור זה מוצגת תמונת שדה בהיר (brightfield) משמאל ותמונת פלואורסצנציה מימין של עובר דג זברה שהוזרק לו במיקרו-הזרקה גדיל של fluorescein dextran כלוב לפני הפעלה פוטו-כימית. כפי שמוצג כאן, העובר הופעל פוטו-כימית באחד הסומיטים המסומן בחץ בתמונת השדה בהיר משמאל, באורך גל של 740 nanometers, זמן סריקה של 31 seconds, והספק לייזר ממוצע של 47 milliwatts. בתמונה מימין ניתן להבחין בתוצרי פלואורסצנציה של ה-fluorescein dextran ששחרר מהכלוב לאחר ההפעלה הפוטו-כימית.צביעה אימונית של פלואורסצאין דקסטראן שאינו כלוא מוצגת באזור קטן בלוח הצדי, בבלסטוֹדֶרמה של עובר בשלב סומיט ה-10. הפוטוריבואקטיבציה בוצעה באמצעות אותם פרמטרי לייזר כפי שהוצגו באיור הקודם, תוך שימוש בפרוצדורת זיהוי אימונית. ניתן לזהות את האזור שהופעל, כפי שמסומן כאן על ידי החץ, עם צביעת רקע מינימלית לאחר ביצוע פרוצדורה זו.ניתן לבצע ניתוחים נוספים, כגון צביעה אימונוהיסטוכימית לסמנים ספציפיים לרקמות שונות, על מנת לאפיין טוב יותר את מיקומם וגורלם של התאים המסומנים. שימוש בטכניקה זו סולל את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של כלי הדם לחקור את מקורם של תאי פרוגניטור עורקיים בוורידים בעוברים של דגי זברה בהתפתחות. זכרו כי בעבודה עם ריאגנטים כימיים כגון NBT ו-BCIP, אלה עלולים להיות מסוכנים ביותר ויש להשתמש תמיד בכפפות.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

פרוטוקול זה מתווה דרך התווית להתחקות אחר גורלו של קבוצות קטנות של דג הזברה עוברים התאים באמצעות UV-משחררות רפרוף של והעמסת בכלוב, ואחריו הר שלם immunolabeling כדי להגביר את האות והעמסת את שברחה מכלוב.

Lineage תיוג של תאים דג הזברה עם לייזר Uncagable והעמסת dextran

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

דג זברה מהונדס lck:eGFP אקספרס GFP מאוד לימפוציטים מסוג T, השתמשו ללמוד פיתוח תא T ו לוקמיה לימפובלסטית חריפה. הקו הזה יכול לשמש כדי מחקר B תאים, אשר אקספרס lck ברמות נמוכות. פרוטוקול זה מתאר טיהור תאי B ממאיר, שאינם ממאירים של דג זברה lck:eGFP .

בידוד Malignant ותאי B Non-Malignant מ lck:eGFP דג זברה

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

במאמר זה אנו מתארים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה, לצורך ניתוח ריצוף RNA חד-תאי.

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

למד מיפוי גורל של תאים בודדים בדגי זברה באמצעות פעילות פוטו בשני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תרומת תאי קדם לסוגי רקמות שונים בביולוגיה התפתחותית.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

גלה סרטונים נוספים