ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את פעילות מחזור התא בקרדיומיוציטים לאחר הלידה ולקבוע את גרעינותם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התחדשות הלב, כגון האם קרדיומיוציט באמת מתחלק או שהוא רק מגביר את הפלואידיות שלו או הופך לרב-גרעיני? היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן לדמיין את שלב M של מחזור התא ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה וכי ניתן לזהות גרעיני קרדיומיוציטים על ידי פלואורסצנטיות.

מי שתדגים את ההליך תהיה פטרישיה פרייטג, טכנאית מהמעבדה שלנו. אם משתמשים בזוגות רבייה לא הומוזיגוטיים, זהו תחילה את הלבבות הטרנסגניים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לבדוק את ביטוי האנלין EGFP ו-H2B-mCherry שלהם. ניתן לזהות אותות גרעיניים של אנליין EGFP בקצוות הפרוזדורים על ידי התמקדות דרך שכבות הרקמה שלו.

כדי לבודד את הקרדיומיוציטים, הניחו את המספר המתאים של לבבות בצינורות תגובה של 1.5 מיליליטר המכילים מיליליטר אחד של תערובת אנזימים מערכת דיסוציאציה של לב יילודים וחתכו את הלבבות לחתיכות קטנות בעזרת מספריים. לאחר מכן, העבירו את התמיסה לצינורות תגובה של 15 מיליליטר. הניחו את הצינור במצב כמעט אופקי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ערבבו את הרקמה חמש עד 10 פעמים עם פיפטה של חמישה מיליליטר בסוף הדגירה.

בסוף העיכול השלישי, עצרו את התגובה עם 7.5 מיליליטר של בינוני שניים וסננו את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון. שוטפים את מסננת התאים בשלושה מיליליטר בינוני שניים, מאגדים את הכביסה עם התאים שנאספו ואוספים את התאים באמצעות צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר בינוני לספירה.

לאחר מכן, זרע אחד כפול עשרה עד תאים רביעיים לבאר ב-120 מיקרוליטר של מדיום אחד בצלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות וצנטריפוגה את התאים לפני תרבית הלילה שלהם באינקובטור תרבית תאים. למחרת, רוב הקרדיומיוציטים אמורים לפעום. לפני תחילת הטרנספקציה, נגב את הספסל ואת כל חומרי הטרנספקציה בתמיסת טיהור RNAse כדי להסיר כל RNAse.

כאשר כל החומרים מוכנים, הוסיפו 20 מיקרוליטר של תערובת siRNA טרייה שהוכנה לכל באר והחזירו את התאים לחממה למשך 48 שעות. לאחר יומיים, החלף את הסופרנטנט בכל באר ב -120 מיקרוליטר של בינוני אחד והחזיר את התאים לחממה למשך 24 שעות נוספות לפחות. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS, ואחריו קיבוע בתמיסת פורמלדהיד 4% למשך 20 דקות.

כדי לנתח את התאים על ידי מיקרוסקופ וידאו קונפוקלי, העבירו את הצלחת לשלב המיקרוסקופ הקונפוקלי והפעילו את תוכנת ההדמיה. פתח את הגדרות A1plus וסמן את תיבות הערוץ הראשון, השני, השלישי והרביעי. בתפריט הנפתח, הגדר את הערוץ הראשון ל-DAPI, הערוץ השני ל-eGFP, הערוץ השלישי ל-RFP והערוץ הרביעי ל-Cy5.

לחץ על מתח הערוץ והשתמש בסרגלי ההחלקה כדי להגדיר את המתח ל-80 עבור כל ערוץ. השתמש בסרגלי ההחלקה כדי להגדיר את ההיסט לאפס ולחץ על כפתור הבית כדי לכוון את חור הסיכה למצב הבית. הגדר את גודל הסריקה ל-1024 על 1024 פיקסלים בתפריט הנפתח.

נקישה אופטימיזציה כדי לפתוח את חלון הגדרת גודל XYZ ולסמן את תיבת הווקסל המושלמת תחת השלב המוצע Z.בחר את המטרה פי 20 והתאם את עוצמות הלייזר עד שהתמונה לא תהיה תת-חשיפת או חשיפת יתר. לאחר שכל הפרמטרים הוגדרו, פתח את תפריט הרכישה. בחר סרוק תמונה גדולה ולאחר מכן בחר מיקום נוכחי נמצא בפינה השמאלית העליונה מתחת לאזור.

לאחר מכן הגדר את מספר השדות ב-X ו-Y לשלושה על שלוש ולחץ על סריקה. כדי להגדיר את מספר גרעיני הקרדיומיוציטים, לחץ על מדידה, מדידה ידנית וספירה. בחר את הגרעינים עם אותות H2B-mCherry ובכך סמן וספור אותם.

לאחר מכן, בחר את התאים החיוביים לאלפא-אקטינין כדי לקבוע את מספר הקרדיומיוציטים. כדי לספור את הקרדיומיוציטים בשלב G1, S, G2 עם אותות אנלין EGFP גרעיניים, בחר מדידה, מדידה ידנית וספירה. סמן את גרעיני הביטוי של אנלין EGFP ו-H2B-mCherry בלחיצה וספור ידנית את הקרדיומיוציטים עם אותות אנלין EGFP ספציפיים למיטוזה כגון טבעות התכווצות ואמצע גוף.

לאחר מכן, לחץ על מדידה, מדידה ידנית וספירה ולחץ על הקרדיומיוציטים עם אותות אנלין EGFP ספציפיים למיטוזה, אותות ציטופלזמטיים, טבעות התכווצות ואמצע גוף. בהשוואה לבקרות השליליות, הקרדיומיוציטים הטרנספטנטיים של miRNA ו-siRNA מדגימים אינדוקציה של פעילות מחזור התא. קרדיומיוציטים המבצעים אנדורדפליקציה מציגים ביטוי אנלין EGFP גרעיני בלבד, בעוד שקרדיומיוציטים העוברים חלוקת תאים מציגים ביטוי אנלין EGFP בלוקליזציות אופייניות לשלב M.

לאחר עיכול אנזימטי של רקמת הלב במנגנון לנגנדורף, ניתן להפריד את הפרוזדורים והחדרים באופן מכני ולנתח אותם באופן עצמאי, מה שמאפשר הדמיה של קרדיומיוציטים חדריים טרנסגניים H2B-mCherry עם מספר גבוה של קרדיומיוציטים דו-גרעיניים חיוביים H2B-mCherry . לעומת זאת, רוב הקרדיומיוציטים הפרוזדוריים הם חד-גרעיניים. עיכול אנזימטי אינו מביא לכך שאוכלוסיית תאים בודדים ב-100% חושפת דפוס של צלב על ידי צביעת אלפא-אקטינין, מה שמקל עוד יותר על ההבחנה בין קרדיומיוציטים דו-גרעיניים כדפוס מתמשך של סטריאציה צולבת והכפלות תאים.

כדי לנתח את אינדקס הדו-גרעיני של קרדיומיוציטים בפרוסות עבות, יש צורך לגלול ידנית דרך הערימה מכיוון שהגרעינים אינם בהכרח נמצאים בתוך מישור Z אחד, כאשר צביעת נבט חיטה אגלוטינין מאפשרת זיהוי התא borders. 3D שחזורים של פרוסות קבועות של לבבות עכברים טרנסגניים בוגרים מאפשרים זיהוי וספירה אוטומטית של ווים, מוכתמים, וגרעינים חיוביים של H2B-mCherry כדי לקבוע את שיעור גרעיני הקרדיומיוציטים בתנאים פיזיולוגיים בתוך הרקמה. לאחר השליטה, ניתן להשלים את דיסוציאציה של הלב תוך שעתיים-שלוש אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד באופן רציף כדי לשמור על כדאיות התאים לאורך כל הניסוי. בעקבות הליך זה, ניתן לסנן מיקרו-רנ"א או חומרים קטנים אחרים עבור השפעותיהם הגורמות להתפשטות בקרדיומיוציטים לאחר הלידה.