Name: ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: חקור ויזואליזציה של מחזור התא בקרדיומיוציטים לאחר לידה בעכברים טרנסגניים. שיטת מיקרוסקופיית הפלואורסצנציה מאפשרת זיהוי גרעינים ושלב M ברזולוציה גבוהה לחקר מנגנוני התחדשות הלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לס' גרינברג (בון, גרמניה) ולפ' פרייטג (בון, גרמניה) על עזרתם הטכנית.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

ישנה מחלוקת בשאלה האם cardiomyocytes מסוגלים להזין את מחזור התא ולחלק לאחר פציעה ובמהלך הומאוסטזיס רקמות. הערכים של המחזור הבסיסי של cardiomyocytes ניתנו בטווח שבין 1% 1 ו -80% 7. גם לאחר נגע לב, האינדוקציה של פעילות תא מחזור וההדור של cardiomyocytes החדש דווחה באזור הגבול, עם ערכים בין 0.0083% 8 ו 25 - 40% 7. פערים אלה יכולים להיות מוסברים בחלקה על ידי גישות ניסוייות שונות לזיהוי גרעינ...

זיהוי הנכון של גרעיני cardiomyocyte ומעמד מחזור התא הוא בעל חשיבות מכרעת לקביעה ממחזור שריר לב והתחדשות. זה נכון במיוחד עבור שימוש סמנים גרעיניים, כגון pHH3, Ki-67, או אנלוגים תימידין, לזיהוי פעילות מחזור התא. כמו יכולת השגשוג של cardiomyocytes היונק בוגרים הוא קטן מאוד 1, זיהוי שווא של גרעין חיובי עבור סמן הפצת גרעין cardiomyocyte יכול לעשות הבדל מכריע התוצאה של assay התפשטות. יתר על כן, cardiomyocytes נוטה וריאציות של מחזור התא, כגון endoreduplication ו מיטוזה acytokinetic, אשר תוצאת תאי polyploid ו multinucleated ולא חלוקת תא. לשם כך, הפירוש של מכתים נוגדן כנגד סמני מחזור התא משותפים הוא לא מכריע בכל המקרים. כאן, אנו מציגים שיטות הישר forwa<html> הכרה rd של cardiomyocytes עכבר nuclearity שלהם בתאים יליד מבודד וקטעי רקמה עבה שלבי הלידה ומבוגרים על ידי זיהוי חד-משמעי של הגרעינים שלהם. לצורך כך, קו עכבר מהונדס עם ביטוי cardiomyocyte הספציפי של חלבון היתוך מורכב H2B היסטון אדם mCherry תחת השליטה של אמרגן Myh6 (Myh6-H2B-MCH) שמש 2. הכלאות קו העכבר הזה עם קו עכבר מחוון התפשטות מהונדס, שבו הביטוי של חלבון היתוך eGFP-anillin הוא תחת השליטה של ​​האמרגן יקטין עוף בכל המקום עם משפר CMV (CAG-eGFP-anillin), מאפשר בקביעת סטטוס מחזור התא. Anillin פיגומי החלבון מתבטא במיוחד בתאים פעילים-מחזור תא 3, ולוקליזציה subcellular ההפרש שלה במהלך מחזור התא מאפשרת התקדמות מחזור התא חי-מעקב עם רזולוציה גבוהה של M-שלבEF &quot;&gt; 4. לכן, העכברים המהונדסים הכפולים יכולים לשמש כדי להיפלות בין cardiomyocytes מתרבה ואלה עוברים וריאציות מחזור התא. זה מוכיח שימושי במיוחד הקרנה לגילוי חומרי התרמת התפשטות במבחנה.

<table><tbody><tr><td>צלחת פטרי 10 ס"מ</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 ומיקרו; מסננת תאים m</td><td>Becton Dickinson GmbH / Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; צינורית הזרקה, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>20 מד מחט</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>24 בארות</td><td>צלחות Becton Dickinson GmbH / Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-מתיל-בוטאן</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד 37%</td><td>AppliChem GmbH&nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>עצירה תלת-כיוונית</td><td>ב. בראון מדיקל בע"מ</td><td>מזרק 16494C</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל</td><td>ב. בראון מדיקל בע"מ</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני מצומד Alexa-Fluor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>אלפא-אקטינין EA-53, עכבר IgG</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-צלחת תרבית תאים, 96 ובכן, חצי שטח</td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>קולגנז B</td><td>רוש</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryostat CM 3050S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>donkey serum</td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered</td><td>Saline Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>PromoCell,</td> תמיסת פורמלדהיד היידלברג <td></td><td></td></tr><tr><td>(4%)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר, סוג A</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>צינור הארכה היידלברגר</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>הפרין-נטריום</td><td>רציופארם</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ היסטובונד</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s ModifiedDulbecco' s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>סריקת לייזר Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; </td><td></td><td></td>sseldorf</tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG Cy5 (חמור)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>מיני שייקר</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3p</td><td>אמביון / תרמו פישר 4464066</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ביופסיה עובש</td><td>Sakura Finetek / VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide 8-well ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>שלילי בקרה (RNA מקושקש)</td><td>אמביון/תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>ערכת דיסוציאציה של לב ילודים</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td> של סלדורף, NEAA <td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, סרום מופחת</td><td>בינוני Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה אלכוהול פוליוויניל עם DABCO&reg;, אנטי-דהייה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>מיכלים לדוגמא</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית</td><td>גריינר</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה NIS אלמנטים</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. תרכובת</td><td>סאקורה פינטק / VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 יודיד (642/661)</td> <td>מולקולרי בדיקות / ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>נבט חיטה אגלוטינין (WGA) פלואורסצאין עם תווית</td><td>Vector Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>&אלפא;-נוגדן אקטינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ', שטיינהיים</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

קרדיומיוציטים מועדים לשינויים במחזור התא, כגון אנדורדופליקציה (סבבים מתמשכים של סינתזת DNA ללא קריוקינזיס וציטוקינזיס) ומיטוזה ציטוקינטית (קריוקינזיס אך ללא ציטוקינזיס). שינויים לא טיפוסיים כאלה במחזור התא מביאים לתאים פוליפלואידים ורב-גרעיניים ולא לחלוקת תאים. לכן, כדי לקבוע את תחלופת הלב והתחדשותו, יש חשיבות מכרעת לזיהוי נכון של גרעיני קרדיומיוציטים, מספר הגרעינים לתא ומצב מחזור התא שלהם. זה נכון במיוחד לשימוש בסמנים גרעיניים לזיהוי פעילות מחזור התא, כגון אנלוגים של תימידין Ki-67, PCNA או pHH3. כאן אנו מציגים שיטות לזיהוי קרדיומיוציטים וגרעיניותם ולקביעת פעילות מחזור התא שלהם. אנו משתמשים בשתי מערכות טרנסגניות שפורסמו: קו העכברים הטרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, וקו העכבר CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לווריאציות של מחזור התא. בשילוב יחד, שתי המערכות הללו מקלות על חקר התחדשות הלב והפלסטיות.

על מנת לנתח את ההשפעות של miRNAs siRNAs / על פעילות מחזור התא של cardiomyocytes לאחר הלידה במבחנה, cardiomyocytes של עכברים פעמיים מהונדס Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin בודדו על יום לאחר הלידה 3 (P3) ו טרנספקציה עם פעילות וישכנע מחזור התא miR199 5, p27 siRNA, ו siRNA Fzr1. לעומת שליטה שלילית (איור 1 א), את התמונות של miR199- (איור 1B) ו p27- siRNA (תרשים 1C) transf...

כדי להבחין בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא בקרדיומיוציטים, אנו מציגים פרוטוקולים המשתמשים בשני קווי עכברים טרנסגניים: עכברים טרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, ועכברי CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא.

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להנחית ויזואליזציה של פעילות מחזור התאים בקרדיומיוציטים לאחר הלידה ולקבוע את רמת הגרעיניות שלהם. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הרגנרציה של הלב, כגון האם קרדיומיוציט באמת מתחלק, או שמא הוא רק מגדיל את הפלואידיות שלו או הופך לרב-גרעיני? היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שניתן להבחין בשלב M של מחזור התאים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, וכי ניתן לזהות גרעיני קרדיומיוציטים באמצעות פלואורסצנציה.את הפרוצדורה תדגים פטרישיה פרייטאג, טכנאית מהמעבדה שלנו. במקרה של שימוש בזוגות רבייה שאינם הומוזיגוטים, זהה תחילה את הלבבות הטרנסגניים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לבדוק את הביטוי של EGFP analin ו-H2B-mCherry. ניתן לזהות את אותות הגרעין של EGFP analyin בצורה הקלה ביותר בשולי העליות על ידי מיקוד דרך שכבות הרקמה שלהן.כדי לבודד את התאי השריר של הלב (cardiomyocytes), העבירו את מספר הלבבות המתאים למבחנות תגובה של 1.5 מיליליטר המכילות מיליליטר אחד של תערובת אנזימים מקיט לפירוק לב של יילודים, וגזרו את הלבבות לחתיכות קטנות באמצעות מספריים. לאחר מכן, העבירו את התמיסה למבחנות תגובה של 15 מיליליטר. הניחו את המבחנה במצב כמעט אופקי בטמפרטורה של 37 degrees celsius למשך 15 דקות, וערבבו את הרקמה חמש עד 10 פעמים באמצעות פפית של חמישה מיליליטר בסיום הדגירה.בסיום העיכול השלישי, עצור את התגובה באמצעות 7.5 milliliters של medium two וסנן את תרחיף התאים דרך מסנן תאים של 70 micron. שטוף את מסנן התאים עם שלושה milliliters של medium two, איסוף נוזל השטיפה יחד עם התאים שנאספו, ואסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. השהה מחדש את המשקע ב-500 microliters של medium one לצורך ספירה.לאחר מכן, זרעו 10⁴ תאים לכל באר ב-120 µL של מצע 1 בלוח בעל 96 באערים עם תחתית שטוחה, וסובבו את התאים בצנטריפוגה לפני גידולם למשך לילה באינקובטור לתרבית תאים. למחרת, מרבית הקרדיומיוציטים אמורים להיות בפעימה. לפני תחילת הטרנספקציה, נגבו את משטח העבודה ואת כל חומרי הטרנספקציה בתמיסת דה-קונטמינציה ל-RNAse כדי להסיר RNAse כלשהו.כאשר כל החומרים מוכנים, הוסיפו 20 µl של תערובת siRNA שהוכנה טרי לכל באר והחזירו את התאים לאינקובטור למשך 48 שעות. לאחר יומיים, החליפו את הנוזל העליון (supernatant) בכל באר עם 120 µl של מצע גידול 1 והחזירו את התאים לאינקובטור ל-24 שעות נוספות לפחות. בתום הדגירה, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן בצעו קיבוע בתמיסת formaldehyde בריכוז 4% למשך 20 דקות.כדי לנתח את התאים באמצעות מיקרוסקופיית וידאו קונפוקלית, העבירו את הפלטה למסגרת של המיקרוסקופ הקונפוקלי והפעילו את תוכנת הדמיה. פתחו את הגדרות ה-A1plus וסמנו את תיבות הבחירה לערוצים אחת, שתיים, שלוש וארבע. בתפריט הנפתח, הגדירו את ערוץ אחת ל-DAPI, ערוץ שתיים ל-eGFP, ערוץ שלוש ל-RFP וערוץ ארבע ל-Cy5.לחצו על מתח הערוץ והשתמשו בסרגלי הגרירה כדי להגדיר את המתח ל-80 עבור כל ערוץ. השתמשו בסרגלי הגרירה כדי להגדיר את ההיסט (offset) לאפס ולחצו על כפתור הבית כדי להעמיד את הפינהול (pinhole) בעמדת הבית. הגדירו את גודל הסריקה ל-1024 על 1024 פיקסלים בתפריט הבחירה.לחצו על optimize כדי לפתוח את חלון הגדרת הגודל של XYZ וסמנו את תיבת perfect voxel תחת ה-suggested step Z. בחרו בעדשה 20x וכווןנו את עוצמות הלייזר עד שהתמונה לא תהיה עם חשיפות חסרות או חריגות. לאחר שכל הפרמטרים נקבעו, פתחו את תפריט acquire. בחרו ב-scan large image ולאחר מכן בחרו ב-current position is at top left corner תחת area.לאחר מכן, הגדירו את מספר השדות בצירים X ו-Y לשלוש על שלוש ולחצו על scan. כדי להגדיר את מספר גרעיני התאי השריר של הלב (cardiomyocyte nuclei), לחצו על measure, לאחר מכן על manual measurement ועל counts. בחרו את הגרעינים בעלי אות H2B-mCherry, ובכך סמנו וספרו אותם.לאחר מכן, בחרו את התאים החיוביים ל-alpha-actinin כדי לקבוע את מספר הקריוציטים. כדי לספור את הקריוציטים בשלבי G1, S, G2 בעלי אותי EGFP analin גרעיניים, בחרו ב-measure, manual measurement ו-counts. סמנו את הגרעינים המבטאים EGFP analin ו-H2B-mCherry באמצעות לחיצה, וספרו ידנית את הקריוציטים בעלי אותי EGFP analin הספציפיים למטוזה, כגון טבעות כיווץ וגופי ביניים (mid-bodies).לאחר מכן, לחצו על measure, manual measurement, ו-counts, וסמנו את התאים השריריים של הלב (cardiomyocytes) בעלי אותות EGFP analin ספציפיים למיתוזה, אותות ציטופלזמיים, טבעאות כיווץ (contractile rings) וגופי אמצע (mid-bodies). בהשוואה לבקרה השלילית, תאי לב שעברו טרנספקציה של miRNA ו-siRNA מראים השראה של פעילות מחזור התא. תאי לב המבצעים אנדורפליקציה (endoreduplication) מראים ביטוי של EGFP analin גרעיני בלבד, בעוד שתאי לב הנמצאים בתהליך של חלוקת תאים מראים ביטוי של EGFP analin בלוקליזציות טיפוסיות לשלב M.לאחר עיכול אנזימטי של רקמת הלב במכשיר לנגנדורף (Langendorff apparatus), ניתן להפריד מכנית את העליות והחדרים ולנתח אותם באופן עצמאי, מה שמאפשר ויזואליזציה של קרדיומיוציטים ונטריקולריים טרנסגניים של H2B-mCherry עם מספר גבוה של קרדיומיוציטים דו-גרעיים חיוביים ל-H2B-mCherry. לעומת זאת, רוב הקרדיומיוציטים אטריאליים הם חד-גרעיים. העיכול האנזימטי אינו מביא לאוכלוסייה של 100% תאים בודדים, מה שחושף תבנית של פסי רוחב (cross-striation) על ידי צביעת alpha-actinin, ובכך מסייע להבחין בין קרדיומיוציטים דו-גרעיים, המאופיינים בתבנית רציפה של פסי רוחב, לבין זוגות תאים (cell doublets).כדי לנתח את מדד הבי-נוקלאציה (bi-nucleation) של קרדיומיוציטים בפרוסות עבות, יש לסרוק ידנית את הערימה (stack) מכיוון שהגרעינים לאו דווקא נמצאים במישור Z אחד, כאשר צביעה ב-wheat germ agglutinin מאפשרת את זיהוי גבולות התא. שחזורים בתלת-ממד של פרוסות מקובעות מלבבות של עכברים טרנסגניים בוגרים מאפשרים זיהוי וספירה אוטומטית של גרעינים בצורת וו (hooks), גרעינים צבועים וגרעינים חיוביים ל-H2B-mCherry, כדי לקבוע את הפרופורציה של גרעיני קרדיומיוציטים בתנאים פיזיולוגיים בתוך הרקמה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים את דיסוציאציית הלב תוך שעתיים עד שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד באופן רציף כדי לשמור על חיוניות התאים לאורך כל הניסוי. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לסרוק microRNAs או חומרים קטנים אחרים כדי לבחון את השפעתם על השראה של פרולפרציה בתאי שריר לב (cardiomyocytes) לאחר הלידה.

visualization-cell-cycle-variations-determination-nucleation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הקמנו פרוטוקול לזירוז של cardioblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות לב האדם תפקודי הלב וכלי הדם cardiomyocytes עבור התיקון.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

גרעינים לב מבודדים באמצעות שקיעה צפיפות immunolabeled עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) כדי לזהות ולמיין גרעינים cardiomyocyte ידי cytometry הזרימה.

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

תאי גזע pluripotent, או גזע pluripotent (שב"ס) תאים עובריים או מושרה, מהווים מקור חשוב של תאים מובחנים אדם, כוללים שריר לב. כאן, אנו נתמקד באינדוקצית לב של תאי iPS, מראים כיצד להשתמש בם כדי להשיג cardiomyocytes האנושי מתפקד באמצעות פרוטוקול המבוסס על גופי embryoid.

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

המאמר מתאר את המתודולוגיה מפורטת להבחין ביעילות תאי גזע pluripotent אנושיים לשריר לב על ידי באופן סלקטיבי ויסות מסלול Wnt, ואחרי ניתוח cytometry זרימה של סמני התייחסות להעריך הומוגניות וזהותה של האוכלוסייה.

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

מוטציות המובילות למומי לב מולדים מפיקות תועלת מחקירה in vivo של מבנה הלב במהלך ההתפתחות, אך מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה בלב העוברי של העכבר הם מאתגרים מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים שיטת אימונופלואורסצנציה וניתוח תמונה חזקה להערכת מבנים ספציפיים לקרדיומיוציטים בלב העכבר המתפתח.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

כימות תחלופת הקרדיומיוציטים הוא מאתגר. הפרוטוקול המתואר כאן תורם תרומה חשובה לאתגר זה בכך שהוא מאפשר כימות מדויק ורגיש של יצירת גרעיני ניאו-קרדיומיוציטים וגרעיני פלואידיה.

הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

אנו מתארים פרוטוקול להדמיה נפחית של תאים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי עמוק בתוך לבבות עובריים שלמים ולאחר לידה. תוך שימוש בשיטות ניקוי רקמות בשילוב עם צביעה שלמה, ניתן לדמות תאים בודדים עם תווית חלבון פלואורסצנטי בתוך לב עוברי או לאחר לידה בצורה ברורה ומדויקת.

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

בשיטות מקובלות ליזום בידול מצטבר המבוסס השעית לב של פלוריפוטנטיים אדם נובע תאים (hPSCs) הם הטרידו עם ההטרוגניות תרבות ביחס גודל וצורה המצרפי. כאן אנו מתארים שיטה חזקה לבידול לב העסקת microwells ליצור שבשליטת הגודל hPSC אגרגטים בתרבית בתנאים לקידום לב.

אופטימיזציה גודל המצרפי Microwells עבור מבוססי השעיה בידול לב של תאי גזע אנושיים pluripotent

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירה וכימות של תת-סוגים לבביים מגוונים שתוכנתו מחדש באמצעות אספקה מתווכת רטרו-וירוס של Gata4, Hand2, Mef2c ו-Tbx5.

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

מטרת עבודה זו היא לפתח שיטה לבודד באופן רקרדיומיוקיטים מהלב הבוגר ים למדוד תוכן DNA וגרעין.

בידוד של קרדיומיוציטים מלבבות קבועים עבור אימונוציטוכימיה וניתוח פלוידי

קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים (hiPSC-CMs) מציעים חלופה לשימוש בבעלי חיים לבדיקת רעילות לב פרה-קלינית. מגבלה לאימוץ נרחב של hiPSC-CMs בבדיקת רעילות פרה-קלינית היא הפנוטיפ הלא בשל, דמוי העובר של התאים. מוצגים כאן פרוטוקולים להבשלה חזקה ומהירה של hiPSC-CMs.

בדיקת קרדיוטוקסיות בתפוקה גבוהה באמצעות מונושכבות קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם בוגרים

חקור ויזואליזציה של מחזור התא בקרדיומיוציטים לאחר לידה בעכברים טרנסגניים. שיטת מיקרוסקופיית הפלואורסצנציה מאפשרת זיהוי גרעינים ושלב M ברזולוציה גבוהה לחקר מנגנוני התחדשות הלב.

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

גלה סרטונים נוספים