מעקב אחר שינויים בהשפעת סמים בסחר פוסט-הפנמת קולטן על ידי ניתוח Colocalizational

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך כמותית את הקולוקליזציה המרחבית של זוגות מטרה, במקרה זה, בחינת סחר בקולטנים המושרה על ידי סמים. זה מושג על ידי טיפול בתאים חיים בתרבית עם תרופה כדי לגרום לסחר בקולטנים משתנים. כשלב שני, תיוג חיסוני כפול של קולטני המטרה ותאי הסחר התוך-תאיים מאפשרים לוקליזציה מרחבית של זוגות המטרה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית רב-ערוצית.

ניתוח קולוקליזציה כמותי משמש למדידת הנטייה של קולטני המטרה ותאי המטרה להימצא באותו מקום. התוצאות מראות שינויים בסחר בקולטנים בעקבות טיפול תרופתי המבוסס על קולוקליזציה של קולטנים ותאי סחר תוך-תאיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו קולוקליזציה של שכבת-על, הוא שהיא מספקת מדדים כמותיים של קולוקליזציה, מה שמאפשר ניתוחים חזקים בהרבה ועיצובים ניסויים מורכבים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי סחר בקולטנים, ניתן ליישם אותה גם על שינויים בקולוקליזציה המרחבית של כמעט כל שני חלבונים בתאים מתורבתים. כדי להתחיל בהליך זה, הסר את מצע הגידול המקורי והחלף אותו במדיום המכיל את התרופה המעניינת בריכוז הנבחר. לאחר מכן, דגרו את התאים בתנאי הגידול המקוריים למשך הטיפול הנבחר.

לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים בעדינות עם מיליליטר אחד של מאגר כביסה בכל פעם שלוש פעמים. תקן את התאים עם 300 מיקרוליטר של 4%para פורמלדהיד ב-0.1 PBS מולארי למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים שוב עם מיליליטר אחד של מאגר כביסה בכל פעם שלוש פעמים.

לאחר מכן, דגרו את התאים ב-300 מיקרוליטר של חיץ חוסם למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את התאים עם נוגדנים ראשוניים ב-300 מיקרוליטר של מדלל נוגדנים למשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים בעדינות עם מיליליטר אחד של מאגר כביסה בכל פעם שלוש פעמים.

לאחר מכן, דגרו על התאים עם נוגדן משני מצומד לפלואור ב-300 מיקרוליטר של נוגדנים מדלל למשך שעה אחת של טמפרטורת החדר והגנו על התאים מפני אור. לאחר שעה יש לשטוף את התאים בעדינות עם מיליליטר אחד של מאגר כביסה בכל פעם שלוש פעמים. כדי להסיר את החלקת הכיסוי מצלחת 24 הבארות החזק את הצלחת של 45 מעלות.

הנח את קצהו של זוג מלקחיים עדינים בקצה העליון של החלקת הכיסוי במקום בו הוא פוגש את רצפת הבאר. לאחר מכן הטה בעדינות את החלקת הכיסוי במאגר הכביסה הרחק מרצפת הבאר. החלקת הכיסוי תנוח על קיר הבאר, שם ניתן להסיר אותה בקלות בעזרת מלקחיים.

לאחר מכן הרכיב את החלקות הכיסוי כשהתאים פונים כלפי מטה על שקופיות מיקרוסקופ עם מדיום הרכבה נגד דהייה באמצעות מטרת הגדלה גבוהה פי 100. ראשית, אתר תא מייצג להדמיה באמצעות אפי פלואורסצנטי. לאחר מכן, הגדר את הגדרות לכידת התמונה הקלט תמונות tiff לא דחוסות של שמונה סיביות מכל ערוץ מסומן כדי לדמות כל ערוץ ברצף ולבצע בממוצע ארבע עד שש סריקות עבור התמונה הסופית.

לאחר מכן עבור לנתיב ההדמיה הקונפוקלי והתמקד במישור Z דרך מרכז התא. בצע אופטימיזציה של עוצמת הלייזר של חור הסיכה ומתח צינור מכפיל הצילום והיסט עבור כל ערוץ. רשום הגדרות אלה והשתמש באותן הגדרות להדמיית כל התאים המסומנים עבור כל זוג יעד נתון.

באותו שכפל תאי איתור הבא להדמיה עם מטרת הגדלה גבוהה. באמצעות אפי פלואורסצנטי, עבור לנתיב ההדמיה הקונפוקלי והתמקד במישור Z דרך מרכז התא אם זמין. השתמש בפונקציית חיתוך זום תוכנה כדי להגביל את אזור הסריקה לתא המבוקש. אחר־כך.

צלם תמונות עבור כל ערוץ עם תווית באמצעות ההגדרות שנקבעו קודם לכן, וחזור על ההליכים כדי לדמות 15 תאים או יותר לכל תנאי לכל שכפול. כדי להבטיח איסוף מספיק של דגימות. בהליך זה, פתחו את זוג התמונות של תא בתמונה J.השתמשו בפקודה 'ערוצי מיזוג צבעי תמונה' ליצירת תמונת RGB.

ואז צייר סביב התא המעניין. השתמש בתוסף image j הקולוקליזציה של SC כדי לכמת את הקולוקליזציה של המטרות בתא שנבחר. הקלט את מידת הקולוקליזציה הרצויה וחזור על ההליך עבור כל תא תמונה.

לאחר מכן, חשב את הממוצע של ערכי הקולוקליזציה המוקלטים של תנאי הבקרה הנפוצים של כל שכפול של כל תנאי תיוג. הכפל את האמצעים במינוס אחד כדי להפיק את ההיסט עבור כל שכפול בכל תנאי תיוג. לאחר מכן הוסף את ההיסט עבור כל שכפול בכל תנאי תיוג לכל ערך לוקליזציה בעותק משוכפל זה.

זה ינרמל את הנתונים כך שמדד הקולוקליזציה הממוצע עבור תנאי הבקרה הנפוץ הוא אפס בכל שכפול של כל תנאי תיוג. לאחר מכן, כל הנתונים מכל השכפולים של כל מצב תיוג יאפשרו ניתוח של שינויים בקולוקליזציה על פני שכפולים מוצגים כאן התרבויות העיקריות של נוירונים חושיים של גרעיני שורש גב שנחשפו לטיפולים תרופתיים ממושכים וחריפים. התאים סומנו אז כחיסונים לקולטני דלתא אופיואידים וסמן של אנדוזומים ממוחזרים עם זוגות נוגדנים משניים ראשוניים מובהקים וצולמו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית רציפה של שני ערוצים.

בנוסף לקולוקליזציה וניתוח כמותיים לאחר מכן, תמונות מייצגות אלה עובדו כדי ליצור מפות קולוקליזציה של צבעים כוזבות המוצגות כאן. ציוני הקולוקליזציה הממוצעים עבור קולטני דלתא אופיואידים וסמנים של אנדוזומים מוקדמים הממחזרים אנדוזומים וקולטני ליזוזומים עם כל תא מושווים בין קבוצות המקבלות טיפולים תרופתיים חריפים שונים ונצפו שינויים הנגרמים על ידי תרופות בסחר בקולטנים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לרכוש מיקרוגרפים עקביים באיכות גבוהה כדי לאפשר ניתוח כמותי תקף.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניתוח קולוקליזציה כמותית.