Name: גדיל DNA עקירת עיר רשתות תגובת השרשת כימית המופק מפלסמיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: למד לייצר שערי DNA לשיכוך גדילים מפלסמידים חיידקיים ולבדוק אותם באמצעות מדידות קינטיקת פלואורסצנציה. שיטה זו מספקת מקור DNA טהור ליצירת שערים יציבים לתכנות מולקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

איורים 1, 2, 3, 4, 6, 8 ולוחות 2, 3, 10, 15, 16 הם שונה מאסמכתא 29. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF-להעניק CCF 1,117,143 וNSF-CCF 1,162,141 לGS). י &#39;-JC נתמכה על ידי מלגות ממשלה הטיוואנית. SDR נתמכה על ידי התכנית הלאומית למדע קרן בוגר מחקר המלגה (GRFP).

<ol><li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat. Chem. 3, 103-113 (2011).</li>
<li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+based+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, 3124-3156 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+strand+displacement+kinetics+using+toehold+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control of DNA strand displacement kinetics using toehold exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 17303-17314 (2009).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475, 368-372 (2011).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+digital+circuit+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scaling up digital circuit computation with DNA strand displacement cascades.</a> Science. 332, 1196-1201 (2011).</li>
<li>Zadegan, R. M., Jepsen, M. D., Hildebrandt, L. L., Birkedal, V., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+fuzzy+and+boolean+logic+gates+based+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Construction of a fuzzy and boolean logic gates based on DNA.</a> Small. 11, 1811-1817 (2015).</li>
<li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314, 1585-1588 (2006).</li>
<li>Zadegan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+4+zeptoliters+switchable+3D+DNA+box+origami%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Construction of a 4 zeptoliters switchable 3D DNA box origami.</a> ACS Nano. 6, 10050-10053 (2012).</li>
<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459, 73-76 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+DNA+strand-displacement+circuitry+with+DNA+tile+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly.</a> Nat. Commun. 4, (1965).</li>
<li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406, 605-608 (2000).</li>
<li>Green, S. J., Lubrich, D., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+hairpins%3A+fuel+for+autonomous+DNA+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">DNA hairpins: fuel for autonomous DNA devices.</a> Biophys. J. 91, 2966-2975 (2006).</li>
<li>Venkataraman, S., Dirks, R. M., Rothemund, P. W., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autonomous+polymerization+motor+powered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">An autonomous polymerization motor powered by DNA hybridization.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 490-494 (2007).</li>
<li>Green, S. J., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+chemomechanical+cycles%3A+a+mechanism+for+autonomous+molecular+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Coordinated chemomechanical cycles: a mechanism for autonomous molecular motion.</a> Phys. Rev. Lett. 101, 238101(2008).</li>
<li>Omabegho, T., Sha, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bipedal+DNA+Brownian+motor+with+coordinated+legs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bipedal DNA Brownian motor with coordinated legs.</a> Science. 324, 67-71 (2009).</li>
<li>Turberfield, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fuel+for+free-running+nanomachines%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA fuel for free-running nanomachines.</a> Phys. Rev. Lett. 90, 118102(2003).</li>
<li>Dirks, R. M., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+amplification+by+hybridization+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Triggered amplification by hybridization chain reaction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15275-15278 (2004).</li>
<li>Seelig, G., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzed+relaxation+of+a+metastable+DNA+fuel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalyzed relaxation of a metastable DNA fuel.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 12211-12220 (2006).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318, 1121-1125 (2007).</li>
<li>Yin, P., Choi, H. M., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+biomolecular+self-assembly+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451, 318-322 (2008).</li>
<li>Chen, X., Briggs, N., McLain, J. R., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+nonenzymatic+circuits+for+high+signal+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 5386-5391 (2013).</li>
<li>Phillips, A., Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programming+language+for+composable+DNA+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">A programming language for composable DNA circuits.</a> J. R. Soc. Interface. 6, Suppl 4. S419-S436 (2009).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Polo, F., Emmott, S., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+DSD%3A+a+design+and+analysis+tool+for+DNA+strand+displacement+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Visual DSD: a design and analysis tool for DNA strand displacement systems.</a> Bioinformatics. 27, 3211-3213 (2011).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Cardelli, L., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstractions+for+DNA+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Abstractions for DNA circuit design.</a> J. R. Soc. Interface. 9, 470-486 (2012).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+and+modularity+properties+of+a+non-covalent+DNA+catalytic+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robustness and modularity properties of a non-covalent DNA catalytic reaction.</a> Nucleic Acids Res. 38, 4182-4197 (2010).</li>
<li>Ducani, C., Kaul, C., Moche, M., Shih, W. M., Hogberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+production+of+%27monoclonal+stoichiometric%27+single-stranded+DNA+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic production of 'monoclonal stoichiometric' single-stranded DNA oligonucleotides.</a> Nat. Methods. 10, 647-652 (2013).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cloning+of+artificial+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo cloning of artificial DNA nanostructures.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 17626-17631 (2008).</li>
<li>Bhatia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icosahedral+DNA+nanocapsules+by+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Icosahedral DNA nanocapsules by modular assembly.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 4134-4137 (2009).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nat. Nanotechnol. 8, 755-762 (2013).</li>
<li>Arkin, A., Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+functions+in+biochemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Computational functions in biochemical reaction networks.</a> Biophys. J. 67, 560-578 (1994).</li>
<li>Érdi, P., Tóth, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%89rdi%2C+P+%22Mathematical+models+of+chemical+reactions%3A+theory+and+applications+of+deterministic+and+stochastic+models%22">Mathematical models of chemical reactions: theory and applications of deterministic and stochastic models</a>. , Manchester University Press. (1989).</li>
<li>Magnasco, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+kinetics+is+Turing+universal%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Chemical kinetics is Turing universal.</a> Phys. Rev. Lett. 78, 1190(1997).</li>
<li>Oishi, K., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+implementation+of+linear+I%2FO+systems%5BTitle%5D)+AND+%22IET+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biomolecular implementation of linear I/O systems.</a> IET Syst. Biol. 5, 252-260 (2011).</li>
<li>Senum, P., Riedel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-independent+constructs+for+chemical+computation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rate-independent constructs for chemical computation.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Soloveichik, D., Cook, M., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computation+with+finite+stochastic+chemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Computing%22%5BJournal%5D)">Computation with finite stochastic chemical reaction networks.</a> Natural Computing. 7, 615-633 (2008).</li>
<li>Soloveichik, D., Seelig, G., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+as+a+universal+substrate+for+chemical+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA as a universal substrate for chemical kinetics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 5393-5398 (2010).</li>
<li>Tyson, J. J., Chen, K. C., Novak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sniffers%2C+buzzers%2C+toggles+and+blinkers%3A+dynamics+of+regulatory+and+signaling+pathways+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sniffers, buzzers, toggles and blinkers: dynamics of regulatory and signaling pathways in the cell.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 15, 221-231 (2003).</li>
<li>Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-domain+DNA+strand+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Math.+Struct.+Comput.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-domain DNA strand displacement.</a> Math. Struct. Comput. Sci. 23, 247-271 (2013).</li>
<li>Angluin, D., Aspnes, J., Eisenstat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+population+protocol+for+fast+robust+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Distrib.+Comput%22%5BJournal%5D)">A simple population protocol for fast robust approximate majority.</a> Distrib. Comput. 21, 87-102 (2008).</li>
<li>Cardelli, L., Csikasz-Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+switch+computes+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">The cell cycle switch computes approximate majority.</a> Sci. Rep. 2, 656(2012).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> J. Comput. Chem. 32, 170-173 (2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. , e253(2007).</li>
<li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+E.+coli+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of E. coli via electroporation.</a> Methods Enzymol. 529, 321-327 (2013).</li>
<li>Nasri, M., Thomas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+the+specificity+of+PvuII+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alteration of the specificity of PvuII restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 15, 7677-7687 (1987).</li>
<li>Dalchau, N., Seelig, G., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+design+of+reaction-diffusion+patterns+using+DNA-based+chemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Computing+and+Molecular+Programming%22%5BJournal%5D)">Computational design of reaction-diffusion patterns using DNA-based chemical reaction networks.</a> DNA Computing and Molecular Programming. , 84-99 (2014).</li>
<li>Scalise, D., Schulman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+modular+reaction-diffusion+programs+for+complex+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Designing modular reaction-diffusion programs for complex pattern formation.</a> Technology. 2, 55-66 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

<html> מאמר זה מתאר שיטה להפקת שערי ndsDNA מפלסמיד דנ&quot;א הטהור ביותר. יתר על כן, פרוטוקול מוצג לאפיון ביצועי שער באמצעות assay קינטיקה הקרינה. נתוני ניסוי מראה כי מערכת הנגזר פלסמיד בביצועיו עמיתו הסינתטי שלה, גם אם המערכת סינתטית מורכבת מחוטים מטוהרים באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד). סביר להניח, הביצועים המשופרים של שערים הנגזר פלסמיד הוא בעיקר בשל גבוה מאוד טוהר של ה- DNA הביולוגי. DNA סינטטי מכיל מגוון של טעויות, במחיקות מסוימות שתגרומנה oligonucleotides של n-1 אורך, וצד מוצרים אלה בדרך כלל לא הוסרו לחלוטין בעמוד או הליכי טיהור כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). שיפורים דומים לאלה שדווחו כאן גם נצפו במחקר קודם של מגבר סיכת ראש זרז שהשתמש בדנ&quot;א המופק ממקורות ביולוגיים 21. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; עם זאת, גם השימוש בשערים הנגזר פלסמיד לא יכולים לחסל לחלוטין טעויות בביצועי השער, שיש לפחות שתי סיבות: ראשונה על מערכת עיכול או חוסר הדיוק לחתוך יכול להוביל לשערים עם יותר מדי ניקס או חתכים בעמדות הלא נכונות. בכל מקרה, שערים נוטים יותר להשתתף בתגובות לא רצויות. בעיות מסוג זה עשויים להיות הקלה על ידי אופטימיזציה של כמות האנזים המשמשת (ראה איור 4). שנית, בניסויים אלה, רוב התשומות וגדילי דנ&quot;א סינטטי עזר היו וכך הכילו מחיקות ומוטציות. באופן עקרוני, יכולים להיות גם השיגו את כל הקלט חד-גדילים וגדילי עזר מ- DNA phagemid דרך עיכול אנזים nicking של הגנום הנגיפי M13 קידוד מראש 26. אולי ביצועי המעגל ניתן לשפר עוד יותר באמצעות ssDNA נגזר מהגנום של החיידקים. בעוד שהשימוש בשערים הנגזר פלסמיד נמצא כדי לשפר את ביצועי מעגל, ניתוחשל הפעמים העלות ועיבוד גילה כי בעוד שהייצור של שערים הנגזר פלסמיד הוא מעט זול יותר (לוח 15), זה לוקח 2-3 פעמים יותר זמן עיבוד בהשוואה להרכבה וטיהור של שערים מoligos המסונתזת מסחרי (לוח 16). העלויות העיקריות של שערים הנגזר פלסמיד הן סינתזת גן והשימוש באנזימי הגבלה. עבור 300 pmole של שערים (15 תגובות מספיק ליום 30 בננומטר), העלות המשוערת להצטרפות שערים היא כ 170 $ ו 200 $ עבור מזלג שערים, להיות הבדל העלות בשל השימוש באנזימים שסחבו שונים. לעומת זאת, הסינתזה הכימית של הגדילים לאותו שער העלויות כ 260 $ כוללים דמי טיהור עמוד. עלות הזמן העיקרית לשערים הנגזר פלסמיד היא בתהליך השכפול, ש, בדיוק כמו סינתזת DNA, יכול להיות במיקור חוץ לחברת סינתזת גן. עם זאת, יש לי שערים לאחר הרכבה, הנגזר פלסמיד היתרון שיכולים בקלות להיות משוכפלים פלסמידים המארחניתן לאחסן nd בצורה של מניות גליצרול בקטריאלי. זה מאפשר לעשות שימוש חוזר בשערים פעמים רבות. במבט קדימה, ביצועים המשופרים של שערים הנגזר פלסמיד יכולים לאפשר מגוון הרבה יותר גדול של התנהגויות דינמיקה מאשר הודגם בניסוי עד כה עם ה- DNA CRNs. לדוגמא, 47,48 עבודה תיאורטית האחרון הציע שדפוסים מרחביים באמצעות התארגנות עצמית במקרו בקנה המידה יכולים להתממש עם CRNs DNA באמצעות מנגנון דיפוזיה תגובה. השיטה המוצגת כאן מספקת נתיב קיימא לבניית הרכיבים המולקולריים שבבסיס לחומרי DNA דפוסים עצמיים כזה. למרות מאתגר, פיתוח מורפולוגיות מאקרו בקנה מידה בדרך לתכנות יהיו השלכות משמעותיות בתחומים החל מחקר בביו-חומרים לרפואת רגנרטיבית.

יכולת החיזוי של זיווג הבסיס ווטסון-קריק אפשרה DNA ננוטכנולוגיה הדינמי לצוץ כדרך הניתנת לתכנות לעיצוב התקנים מולקולריים עם תכונות דינמיות 1,2. בפרט, עקירת גדיל DNA - תגובת הכלאת תכנות, תחרותית - הוכיחה את עצמו מנגנון רב עוצמה להנדסת מערכות ה- DNA דינמיות. בתגובת עקירת גדיל DNA, oligonucleotide הנכנס דוחק גדיל קשור בעבר &quot;פלט&quot; משותף מחייב משלים. ניתן לקשר תגובות כגון מרובות יחד לתוך מפלי תגובה רב-שלבים עם רמה גבוהה של שליטה על הסדר והעיתוי של תגובה בודדת שלבים 3. מפלי עקירת גדיל DNA נעשו שימוש כדי ליצור מעגלים דיגיטליים ואנלוגיים מולקולריים 4-7, ננו החלפת 8-10, מנועים אוטונומיים מולקולריים 11-15, ומגברי קטליטי שאינם קוולנטיים 13,16-21. יתר על כן, Dניתן לדמות מכשירי NA באמצעות תגובות עקירת גדיל ומיועדים ליישומים מגוונים באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב 22-24. נכון לעכשיו, ה- DNA מסונתז כימי משמש כחומר העיקרי לננוטכנולוגיה DNA. עם זאת, טעויות בתהליך הסינתזה של DNA, וכתוצאה מכך oligonucleotides מושלם, הם האמינו להגביל את הביצועים של מכשירי ה- DNA דינמיים על ידי גרימת תופעות תגובות שגויות. לדוגמא, תגובות &quot;דליפה&quot; יכולות לגרום לשחרורו של oligonucleotide תפוקה גם בהיעדרו של הדק תגובה. תופעות כאלה הן ברורות ביותר במפלי תגובה עצמן שבו אפילו כמות מזערית של דליפה הראשונית סופו של דבר לגרום להפעלה המלאה של 19,20 המפל. לעומת זאת, תגובות לעתים קרובות אינן מצליחות להגיע לרמה הצפויה של הפעלה כי חלק מרכיבים לא לעורר אפילו בנוכחות של הקלט המיועד 7,25. מבוסס DNA כדי להפוך את הביצועים שלננו-התקנים דומים לעמיתיהם המבוססים על החלבונים הביולוגיים שלהם, מצבי שגיאה כזו צריך להיות מופחת באופן דרמטי. פלסמידים חיידקים או DNA הביולוגי אחר יכולים לשמש כמקור זול יחסית של ה- DNA הטהור ביותר עבור יישומי ננוטכנולוגיה. כמויות גדולות של DNA יכולות להיות שנוצרו על ידי שכפול בחיידקים ויכולות ההגהה הפנימיות של מערכות חיות להבטיח את הטוהר של ה- DNA וכתוצאה מכך. למעשה, כמה מאמרים האחרונים הכירו בשירות הפוטנציאלי של ה- DNA הביולוגי ליישומי ננוטכנולוגיה 21,26-28. עם זאת, הטבע-גדילים כפולים המלאה של פלסמיד דנ&quot;א עד כה אסור שימוש בו כחומר לייצור מכשירי ה- DNA דינמיים, אשר בדרך כלל מורכב מהמספר הרב של oligonucleotides ומכילים שני תחומים פעמים התקועות וחד-גדילים. במאמר האחרון 29 סוגיה זו הייתה ממוענת ואדריכלות שער DNA חדשה שמורכבת בעיקר מגדילי דנ&quot;א כפול חתוכות (ndsDNA) היה להציגד. חשוב לציין, יכולות להיות מתוכננות מערכות שערי ndsDNA שמבינות את הדינמיקה שצוינה על ידי כל רשת פורמאלית תגובה הכימית (CRN) 29. יכולים אפוא לשמש שערי ndsDNA, בעיקרון, כדי ליצור מערכות דינמיות שמפגינות תנודות ותוהו ובוהו, bistability וזיכרון, לוגיקה בוליאנית או התנהגויות אלגוריתמיות 30-38. לדוגמא, אסמכתא. 29 הפגינו CRN שלוש-תגובה שסיפק יישום מולקולרי של פרוטוקול &quot;קונסנסוס&quot;, סוג של אלגוריתם מחשוב מבוזר 29,39,40. עבודה זו הוצגה לראשונה שימוש חדשני לפורמליזם CRN כ&quot; שפת תכנות &quot;למהירות סינתזת מערכות מולקולריות פונקציונליות (איור 1 א). כאן, פרוטוקול מפורט לנובעים שערי ndsDNA מפלסמיד דנ&quot;א מסופק. הראשון הוא סקירה של תהליך עיצוב הרצף. לאחר מכן, בעקבות הסבר של oligonucleotides איך סינטטי המכילרצפי השער הם משובטים לתוך פלסמידים והרצף אומת ומוגבר באמצעות תרבות חיידקים. לאחר מכן, הוא הראה כיצד ניתן לגזור ndsDNA שערים מפלסמידים על ידי עיבוד האנזימטית (ראה איור 2). לבסוף, שיטה לבדיקת שער התנהגות באמצעות מבחני קינטיקה הקרינה מתוארת. מנגנון תגובה כדוגמא, הפרוטוקול מתמקד בתגובה כימית + B-&gt; B + C קטליטי. מיני A, B, ו- C (&quot;אותות&quot;, איור 1) מתאים לכל מולקולת DNA חד-גדילים שונה. הרצפים של מולקולות אלה הם עצמאיים לחלוטין והגדילים לא מגיבים אחד עם השני באופן ישיר. יש הרצפים של כל האותות שני תחומים שונים פונקציונליים, כלומר, subsequences שפועל יחד בתגובות עקירת גדיל: 1) תחום דריסת רגל קצר (תוויות ת&quot;א, שחפת, TC) המשמש לייזום של r עקירת הגדילeaction, ו -2) תחום ארוך (תוויות, B, C) הקובע את זהות האות. אינטראקציות בין גדילי אות מתווכות על ידי מתחמי חתוכות פעמיים גדילי דנ&quot;א (ndsDNA) שער (נקראים הצטרפו AB ומזלג לפני הספירה) ומינים חד-גדילי עזר (&lt;tr r&gt;, &lt;b tr&gt;, &lt;ג TB&gt; ו- &lt;i TC &gt;). התגובה הרשמית + B-&gt; B + C מתבצע באמצעות סדרה של צעדי תגובת עקירת גדיל, שבו כל צעד תגובה חושף דריסת רגל לתגובה הבאה (איור 1). בדוגמא זו, אותות ו- B הם בתחילה בחינם בפתרון תוך C אות קשור לשער המזלג. בסוף התגובה B ו- C הם בפתרון. באופן כללי יותר, אותות שחייבים שער אינם פעילים ואילו אותות שהם חופשיים בפתרון הם פעילים, כלומר, הם יכולים להשתתף בתגובת עקירת גדיל כקלט. במהלך זמן התגובה ואחריו באמצעות אסטרטגית כתב ניאון (איור 1 ג). בעבודה קודמת 29, זה היה הראה כי מנגנון תגובה זו מבין stoichiometry הנכון אלא גם קינטיקה של תגובת היעד לא רק.

<table><tbody><tr><td>תערובת מאסטר PCR בנאמנות גבוהה עם מאגר HF</td><td>NEB</td><td>M0531S</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>PstI-HF</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td></td></tr><tr><td>גיבסון הרכבה מאסטר מיקס</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>מרק נהדר, שונה</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0918-250G</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין ספין מיני-פרפ ערכת (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Nb.BsrDI</td><td>NEB</td><td>R0648L</td><td></td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>NEB</td><td>R0607L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בלוקים גנומיים דו-גדיליים</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 פלואורומטר</td><td>Horiba / Jobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי קוורץ סינתטיים&nbsp;</td><td>Starna</td><td>23-5.45-S0G-5</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל QIAGEN QIAGEN</td><td></td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>עמודי שדרה פלסמיד</td><td>BioBrick</td><td>E0240-pSB1A2</td><td>פלסמיד מספר עותק גבוה עם עמידות לאמפיצילין. ניתן למצוא את הרצף מ-http://parts.igem.org</td></tr></tbody></table>

גדיל dna עקירת עיר רשתות תגובת השרשת כימית המופק מפלסמיד

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

ננוטכנולוגיה של DNA דורשת כמויות גדולות של DNA טהור ביותר כחומר הנדסי. DNA פלסמיד יכול לענות על צורך זה מכיוון שהוא משוכפל בנאמנות גבוהה, מוגבר בקלות באמצעות תרבית חיידקים וניתן לאחסן אותו ללא הגבלת זמן בצורה של מלאי גליצרול חיידקים. עם זאת, האופי הדו-גדילי של DNA פלסמיד עיכב עד כה את השימוש היעיל בו לבניית ננו-מבנים או התקנים של DNA המכילים בדרך כלל תחומים חד-גדיליים או מסועפים. בעבודה שנערכה לאחרונה, נמצא כי שערי תזוזה של גדיל DNA דו-גדילי (ndsDNA) יכולים להיות מקורם ב-DNA פלסמיד. להלן פרוטוקול המפרט כיצד ניתן לקודד ביעילות את שערי ה-ndsDNA הללו בפלסמידים וניתן לגזור אותם מהפלסמידים באמצעות מספר קטן של שלבי עיבוד אנזימטיים. כמו כן ניתן פרוטוקול לבדיקת שערי ndsDNA באמצעות מדידות קינטיקה פלואורסצנטיות. ניתן להשתמש בשערי NdsDNA כדי ליישם רשתות תגובה כימית שרירותיות (CRNs) ובכך לספק נתיב לשימוש בפורמליזם CRN כשפת תכנות מולקולרית מנחה. כדי להדגים טכנולוגיה זו, נבנה מפל תגובה רב-שלבי עם קינטיקה קטליטית. יתר על כן, הוכח כי רכיבים שמקורם בפלסמיד מתפקדים טוב יותר מרכיבים זהים המורכבים מ-DNA סינתטי.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לגזירת שערי תזוזה של גדילי DNA מפלסמידים ובדיקתם באמצעות מדידות קינטיקה פלואורסצנטיות. ניתן להרכיב שערים באופן מודולרי למערכות מרובות רכיבים כדי להעריך את ההתנהגות של רשתות תגובה כימית פורמליות (CRN), מה שמדגים שימוש חדש ב-CRNs כשפת תכנות מולקולרית.

גדיל DNA עקירת עיר רשתות תגובת השרשת כימית המופק מפלסמיד

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגזור שערי תזוזה של גדילי DNA מפלסמידים חיידקיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בפלסמיד חיידקי כמקור טהור ביותר ליצירת שערי DNA חזקים. מדגימים הליך זה עמיתיי סם דיפ ואנוכי: להתחיל בייצור המוני ולאחר מכן לבודד שערי DNA המכילים באמצעות ערכות בידוד DNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה ובהתאם להוראות היצרן בעקבות ellucian.למדוד את ריכוז ה-DNA של הפלסמיד בטכניקות סטנדרטיות. לאחר מכן עכל את ה-DNA על ידי הוספת ארבע יחידות של אנזים ההגבלה PV U2 HF עבור כל מיליגרם של הפלסמיד. לאחר מכן, הוסף לדגימה שני נפחים שווים של אתנול מוחלט קר כקרח.דגרו את התערובת במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות כדי לזרז את ה-DNA. לאחר מכן גלולה את ה-DNA המשקע על ידי צנטריפוגה של הדגימה ב-10, 000 עד 14, 000 פעמים G ואפס מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הסר את ה- SNAT והוסף לדגימה 1000 מיקרוליטר טמפרטורת החדר 95% אתנול.לאחר מכן הפוך את הדגימה 10 עד 15 פעמים לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-10, 000 עד 14, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בסיום, הסירו את הסופרנטנט וייבשו את הדנ"א באוויר על ספסל למשך 10 עד 20 דקות. כאשר מוציאים את הסופרנטנט מהדנ"א המשקע, היזהרו לא להפריע לגלולה, אחרת התשואה תפחת משמעותית.לאחר הייבוש, השעו מחדש את כדור ה-DNA בעד 200 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז ומערבולת כדי לערבב. הוספת יותר מ-200 מיקרוליטר מים בדרך כלל תגרום לדגימה לדלל לשימוש. בניסויים קינטיים, מדוד את ה-DNA המושעה באמצעות ספקטרופוטומטר בהתאם להוראות היצרן.לאחר מכן הוסף ארבע יחידות של האנזים החריץ M-B-B-S-R-D אחת למיקרוגרם אחד של פלסמיד, והוסף את מאגר האנזים המתאים. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לעכל את שערי המפרקים. לאחר מכן, עכל את שערי המזלג על ידי הוספת שמונה יחידות של אנזים החיתוך NT BST mb אחת למיקרוגרם אחד של פלסמיד ומאגר האנזים המתאים.דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה. כדי להכין את המדווחים הפלואורסצנטיים תחילה יש להשעות ולכמת את הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן מערבבים 10 מיקרוליטר מהגדיל התחתון של הכתבים עם 13 מיקרוליטר של גדיל המרווה העליון במאגר טריס אצטט EDTA עם 12.5 מילימולר של מגנזיום.כדי להבטיח שכל הצומח, ארבעה גדילים מסומנים מרווים, יש להוסיף עודף של 30% מהגדיל המסומן. לאחר מכן, אניל הכתב C קומפלקס באמצעות מחזור תרמי. מצננים את הדגימה מ-95 מעלות צלזיוס ל-20 מעלות צלזיוס בקצב של מעלה צלזיוס אחת לדקה.בסיום, אחסן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס לאחר הכיול. התחל את מדידות הקרינה על ידי הגדרת בקר הטמפרטורה ל-25 מעלות צלזיוס בזמן שהטמפרטורה מתייצבת. הגדר את הפרמטרים המתאימים למדידות קינטיקה בתוכנת רכישת הנתונים.לאחר פתיחת התוכנה עבור הפלואוריומטר הספקטרלי, הגדר את רוחב ההחלקה ל-2.73 ננומטר הן עבור מונוכרום העירור והן עבור הפליטה. לאחר מכן הגדר את זמן האינטגרציה ל-10 שניות עבור כל נקודת זמן 62 והגדר את זמן המדידה הכולל ל-24 שעות. לבסוף, הגדר את אורכי גל העירור והפליטה כך שיתאימו ליער הצומח ששימש בניסוי.לאחר מכן, הוסף 410.2 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ו-52.8 מיקרוליטר של 10 תוספות מאגר EDTA אצטט המכיל 125 מילימולר של מגנזיום לתא קוורץ סינתטי. הוסף גם שני מיקרוליטרים של גדילי פולי T של 300 מילי-מולאר, ולאחר מכן מערבל את תא הקוורץ הסינתטי למשך 10 עד 15 שניות. הבא אחריו בתשעה מיקרוליטר של גדילי המדווח ב-10 מיקרומולר ושישה מיקרוליטר מכל גדיל עזר ב-10 מיקרומולר.לאחר מכן ב-45 מיקרוליטר של שערי המפרק והמזלג במיקרוטולר אחד ומערבבים בעדינות את התמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 20 פעמים. לבסוף, בתשעה מיקרוליטרים של 10% נתרן לעשות סולפט דוקטלי כדי להשיג ריכוז סופי של 0.15% SDS מערבבים בעדינות את התגובה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 20 פעמים מניחים מיד את תאי הקווטר הסינתטיים לתוך תא הספקטרום ומתחילים במדידת הקינטיקה. לאחר חמש דקות של מדידה, הוסף שלושה מיקרוליטר מגדילי הקלט.הוסף 10 מיקרוטולר לתא הקווטר הסינטטי. בזמן שתוכנית רכישת הנתונים מושהית, ערבב בעדינות את התגובה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 20 פעמים, ולאחר מכן סגור את מכסה האור והמשך להקליט את קינטיקת התגובה עד שהיא מגיעה ליציבות. נתוני קינטיקה של המדינה עבור השערים הנגזרים מהפלזמה והשערים המסונתזים מוצגים כאן בניסויים.ריכוז גדיל האות A קבוע בעוד שכמות האות הקטליטי B משתנה. אות C משמש לקריאת התקדמות התגובה מבלי להפריע. תחלופת המחזור הקטליטי מוגדרת ככמות האות C המופק עבור כל זרז B בזמן נתון.עבור מערכת קטליטית אידיאלית, מספר תחלופה זה אמור לגדול באופן ליניארי עם הזמן ולהיות בלתי תלוי בכמות הזרז כל עוד המצע אינו מגביל. כאן נצפה כי המערכת המסונתזת חורגת מהעלייה הליניארית האידיאלית של התחלופה הרבה יותר מוקדם מהמערכת הנגזרת מהפלזמה, מה שמעיד על קיבוע הזרז באמצעות תגובת לוואי לא רצויה. כאן משווים את דליפת המעגל הן של הפלזמה והן של השערים המסונתזים, ונצפה כי היחס בין אות הדליפה באמצעות שערים שמקורם בפלזמה הוא כ-8% פחות מזה שמשתמש בשערים מסונתזים לאחר 10 שעות של תגובה.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור שערי DNA חזקים מפלסמיד חיידקי ולבדוק את השערים באמצעות מדידות קינטיקה פלואורסצנטיות.

plasmid-derived-dna-strand-displacement-gates-for-implementing

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אוריגמי DNA הוא שיטה רב עוצמה לבודת עצמים ננומטריים מדויקים על ידי תכנות ההרכבה העצמית של מולקולות DNA. כאן, אנו מתארים איך יכול להיות מנוצלים-DNA אוריגמי לעצב רובוט רובוטי מסוגלים לחוש סימנים ביולוגיים ולהגיב בצורת הסטה, לאחר מכן הועברה לאפקט רצוי.

עיצוב רובוט ביו תגובה מ-DNA אוריגמי

סינתזה של פלסמידים מותאמים אישית גוזלת עבודה וזמן. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיבוט הרכבה של גיבסון כדי להפחית את העבודה ומשך הליך שיבוט ה-DNA המותאם אישית. הפרוטוקול המתואר מייצר גם מבני חלבון מתויגים אמינים לביטוי יונקים בעלות דומה לשיבוט ה-DNA המסורתי של גזירה והדבקה.

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

. הנה, זרימת עבודה אוטומטית לבצע הרכבה "התקן" DNA מודולרי, באמצעות שיטה מודולרית DNA שיבוט הרכבה על רובוטים נוזלי-טיפול מוצג. הפרוטוקול משתמשת כלי תוכנה אינטואיטיבית ליצירת רשימות המטפל נוזלי לדור קומבינטורית DNA התקן הספרייה, אשר נדגים באמצעות שתי פלטפורמות טיפול בנוזלים.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

מאמר זה מציג סדרה של פרוטוקולים לפיתוח תאים מהונדסים ומשטחים פונקציונליים המאפשרים מהונדס חיידק סינטטי לשלוט ולטפל משטחי חומר לתכנות.

באמצעות ביולוגיה סינתטית מהנדס תאים חיים המתממשקות חומרים לתכנות

אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור עיצוב, הדמיה, רטוב-מעבדת ניסויים וניתוח עבור מתלה reconfigurable של אקורדיון הדנ א של 6 על ידי 6 רשתות.

עיצוב, סינתזה של ארון אקורדיון דנ א Reconfigurable

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד אני) להרכיב וקטור שכפול עצמי באמצעות ערכת השכפול שיבוט מודולרי ציאנוגייט, ii) להציג את הווקטור לתוך מארח cyanobacterial על ידי הקונקטורים, ו iii) לאפיין את הזנים של הציטוחיידקים הטרנסגניים באמצעות קורא צלחת או לזרום cy, לנסות.

השינוי הגנטי של הקיאובקטריה באמצעות הקוניוגציה באמצעות ערכת השכפול המודולרי של ציאנוגייט

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

אנו מתארים את ההנדסה של פולימראז T7 RNA חדשני הקשור לדנ"א כדי לווסת את תגובות התמלול במבחנה. אנו דנים בצעדים לסינתזה ואפיון חלבונים, מאמתים רגולציה של תמלול הוכחת הרעיון, ודנים ביישומיה במחשוב מולקולרי, אבחון ועיבוד מידע מולקולרי.

RNA פולימראז קשור DNA לתכנות תמלול במבחנה וחישוב מולקולרי

מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר שולבו בתוכנית של שערים בוליאניים בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae). המעגלים הלוגיים הקטנים החדשים הראו ביצועים טובים והעמיקו את ההבנה של גורמי שעתוק מבוססי dCas9/dCas12a והתכונות של חלבונים אנטי-קריספר.

מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

הרכבה in vivo היא שיטת שיבוט בלתי תלויה בקשירה המסתמכת על אנזימי תיקון DNA פנימיים בחיידקים כדי להרכיב שברי DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית. פרוטוקול זה הוא גם חסכוני בזמן וגם בעלות יתר, מכיוון שנדרשים מעט ריאגנטים, ויעילות השיבוט יכולה להגיע עד 99%.

שימוש במכלול In Vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה

למד לייצר שערי DNA לשיכוך גדילים מפלסמידים חיידקיים ולבדוק אותם באמצעות מדידות קינטיקת פלואורסצנציה. שיטה זו מספקת מקור DNA טהור ליצירת שערים יציבים לתכנות מולקולרי.

גדיל DNA עקירת עיר רשתות תגובת השרשת כימית המופק מפלסמיד

גלה סרטונים נוספים