גדיל DNA עקירת עיר רשתות תגובת השרשת כימית המופק מפלסמיד

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגזור שערי תזוזה של גדילי DNA מפלסמידים חיידקיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בפלסמיד חיידקי כמקור טהור ביותר ליצירת שערי DNA חזקים. מדגימים הליך זה עמיתיי סם דיפ ואנוכי: להתחיל בייצור המוני ולאחר מכן לבודד שערי DNA המכילים באמצעות ערכות בידוד DNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה ובהתאם להוראות היצרן בעקבות ellucian.

למדוד את ריכוז ה-DNA של הפלסמיד בטכניקות סטנדרטיות. לאחר מכן עכל את ה-DNA על ידי הוספת ארבע יחידות של אנזים ההגבלה PV U2 HF עבור כל מיליגרם של הפלסמיד. לאחר מכן, הוסף לדגימה שני נפחים שווים של אתנול מוחלט קר כקרח.

דגרו את התערובת במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות כדי לזרז את ה-DNA. לאחר מכן גלולה את ה-DNA המשקע על ידי צנטריפוגה של הדגימה ב-10, 000 עד 14, 000 פעמים G ואפס מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הסר את ה- SNAT והוסף לדגימה 1000 מיקרוליטר טמפרטורת החדר 95% אתנול.

לאחר מכן הפוך את הדגימה 10 עד 15 פעמים לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-10, 000 עד 14, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בסיום, הסירו את הסופרנטנט וייבשו את הדנ"א באוויר על ספסל למשך 10 עד 20 דקות. כאשר מוציאים את הסופרנטנט מהדנ"א המשקע, היזהרו לא להפריע לגלולה, אחרת התשואה תפחת משמעותית.

לאחר הייבוש, השעו מחדש את כדור ה-DNA בעד 200 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז ומערבולת כדי לערבב. הוספת יותר מ-200 מיקרוליטר מים בדרך כלל תגרום לדגימה לדלל לשימוש. בניסויים קינטיים, מדוד את ה-DNA המושעה באמצעות ספקטרופוטומטר בהתאם להוראות היצרן.

לאחר מכן הוסף ארבע יחידות של האנזים החריץ M-B-B-S-R-D אחת למיקרוגרם אחד של פלסמיד, והוסף את מאגר האנזים המתאים. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לעכל את שערי המפרקים. לאחר מכן, עכל את שערי המזלג על ידי הוספת שמונה יחידות של אנזים החיתוך NT BST mb אחת למיקרוגרם אחד של פלסמיד ומאגר האנזים המתאים.

דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה. כדי להכין את המדווחים הפלואורסצנטיים תחילה יש להשעות ולכמת את הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן מערבבים 10 מיקרוליטר מהגדיל התחתון של הכתבים עם 13 מיקרוליטר של גדיל המרווה העליון במאגר טריס אצטט EDTA עם 12.5 מילימולר של מגנזיום.

כדי להבטיח שכל הצומח, ארבעה גדילים מסומנים מרווים, יש להוסיף עודף של 30% מהגדיל המסומן. לאחר מכן, אניל הכתב C קומפלקס באמצעות מחזור תרמי. מצננים את הדגימה מ-95 מעלות צלזיוס ל-20 מעלות צלזיוס בקצב של מעלה צלזיוס אחת לדקה.

בסיום, אחסן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס לאחר הכיול. התחל את מדידות הקרינה על ידי הגדרת בקר הטמפרטורה ל-25 מעלות צלזיוס בזמן שהטמפרטורה מתייצבת. הגדר את הפרמטרים המתאימים למדידות קינטיקה בתוכנת רכישת הנתונים.

לאחר פתיחת התוכנה עבור הפלואוריומטר הספקטרלי, הגדר את רוחב ההחלקה ל-2.73 ננומטר הן עבור מונוכרום העירור והן עבור הפליטה. לאחר מכן הגדר את זמן האינטגרציה ל-10 שניות עבור כל נקודת זמן 62 והגדר את זמן המדידה הכולל ל-24 שעות. לבסוף, הגדר את אורכי גל העירור והפליטה כך שיתאימו ליער הצומח ששימש בניסוי.

לאחר מכן, הוסף 410.2 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ו-52.8 מיקרוליטר של 10 תוספות מאגר EDTA אצטט המכיל 125 מילימולר של מגנזיום לתא קוורץ סינתטי. הוסף גם שני מיקרוליטרים של גדילי פולי T של 300 מילי-מולאר, ולאחר מכן מערבל את תא הקוורץ הסינתטי למשך 10 עד 15 שניות. הבא אחריו בתשעה מיקרוליטר של גדילי המדווח ב-10 מיקרומולר ושישה מיקרוליטר מכל גדיל עזר ב-10 מיקרומולר.

לאחר מכן ב-45 מיקרוליטר של שערי המפרק והמזלג במיקרוטולר אחד ומערבבים בעדינות את התמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 20 פעמים. לבסוף, בתשעה מיקרוליטרים של 10% נתרן לעשות סולפט דוקטלי כדי להשיג ריכוז סופי של 0.15% SDS מערבבים בעדינות את התגובה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 20 פעמים מניחים מיד את תאי הקווטר הסינתטיים לתוך תא הספקטרום ומתחילים במדידת הקינטיקה. לאחר חמש דקות של מדידה, הוסף שלושה מיקרוליטר מגדילי הקלט.

הוסף 10 מיקרוטולר לתא הקווטר הסינטטי. בזמן שתוכנית רכישת הנתונים מושהית, ערבב בעדינות את התגובה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 20 פעמים, ולאחר מכן סגור את מכסה האור והמשך להקליט את קינטיקת התגובה עד שהיא מגיעה ליציבות. נתוני קינטיקה של המדינה עבור השערים הנגזרים מהפלזמה והשערים המסונתזים מוצגים כאן בניסויים.

ריכוז גדיל האות A קבוע בעוד שכמות האות הקטליטי B משתנה. אות C משמש לקריאת התקדמות התגובה מבלי להפריע. תחלופת המחזור הקטליטי מוגדרת ככמות האות C המופק עבור כל זרז B בזמן נתון.

עבור מערכת קטליטית אידיאלית, מספר תחלופה זה אמור לגדול באופן ליניארי עם הזמן ולהיות בלתי תלוי בכמות הזרז כל עוד המצע אינו מגביל. כאן נצפה כי המערכת המסונתזת חורגת מהעלייה הליניארית האידיאלית של התחלופה הרבה יותר מוקדם מהמערכת הנגזרת מהפלזמה, מה שמעיד על קיבוע הזרז באמצעות תגובת לוואי לא רצויה. כאן משווים את דליפת המעגל הן של הפלזמה והן של השערים המסונתזים, ונצפה כי היחס בין אות הדליפה באמצעות שערים שמקורם בפלזמה הוא כ-8% פחות מזה שמשתמש בשערים מסונתזים לאחר 10 שעות של תגובה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור שערי DNA חזקים מפלסמיד חיידקי ולבדוק את השערים באמצעות מדידות קינטיקה פלואורסצנטיות.