כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לספק שיטה אוטומטית לניתוח ולכימות של שינויים במורפולוגיה של תא בעל צורה לא מוגדרת, המופקים מתמונות פלואורסצנציה קונפוקאליות תלת-ממדיות. הדבר מושג תחילה על ידי ביצוע ניסוי של גרייה כימית, הכולל תאים שטופלו באגוניסט, תאים שטופלו באנטגוניסט ולאחריו באגוניסט, ותאים ללא טיפול. לאחר מכן, התאים מוכנים לניתוח אימונופלואורסצנציה.

השלב השני הוא רכישת תמונות פלואורסצנציה תלת-ממדיות רב-ספקטרליות. לאחר מכן, מבוצע ניתוח מורפומטרי תלת-ממדי באמצעות תוכנות המחשב ameris neuroscience, ameris XT ו-MATLAB. כשלב סופי, השינויים הפנוטיפיים של תא בודד, כפי שהוצגו בניתוח המורפומטרי התלת-ממדי, מנותחים ומכומתים.

בסופו של דבר, פלטפורמה תוכנתית זו משמשת לכימות שינויים במבנה התא בעקבות הפעלת רצפטורים, ובכך מספקת כלי נוסף לגילוי תרופות. באופן כללי, לחוקרים יש מומחיות סטנדרטית במערכות ביולוגיות, אך הם עשויים שלא להיות בקיאים ביישומים ממוחשבים. פרוטוקול זה במודול I 60 מגשר על הפער שבין הוויזואליזציה לשפת המחשב לפני תחילת ההליך.

בצע טרנספקציה לתאי כליה עובריים של בן אדם עם קולטן גורם משחרר קורטיקוטרופין 2 (CRF R2) המסומן ב-hemagglutinin, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. CRF R2 הוא קולטן המצומד לחלבון G (GPCR). ביום שאחרי הטרנספקציה, עקרו להבה כיסויות זכוכית והניחו אותן בתוך פלטה בעלת שישה בארות.

הוסיפו 10 milliliters של PBS למבחנה המכילה חמישה milligrams של polylysine ליאופיליזציה וערבבו. לאחר מכן, דללו חמישה milliliters של polylysine מומס ב-500 milliliters של PBS והוסיפו שני milliliters מהתערובת לכל אחת מהכיסויות (cover slips). השאירו את הפלטה עם הכיסויות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, שטפו את הכיסויות על ידי הוספת שני milliliters של PBS ולאחר מכן הסרתם; חזרו על תהליך זה פעמיים.

לאחר הוספה של 2 mL של מצע DMEM עם 10% FBS, טפטפו שתיים עד חמש טיפות של תאים על לביות הזכוכית (cover slips). על התאים להיות בריכוז הדרוש להשגת 60% קונפלואנציה (confluency). למחרת.

דגרו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, ודאו כי התאים הגיעו ל-60% confluence לצורך הטיפול באגוניסט. עוררו את התאים המיועדים על ידי החלפת המצע בשני מיליליטר של מצע המועשר ב-corticotropin releasing factor, הליגנד האנדוגני של CRF R2, בריכוז של 1 µM.

דגרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות כדי שהתאים יעברו טיפול מקדים עם אנטגוניסט. החליפו את המצע בשני מיליליטר של מצע המועשר ב-CFR two antagonist anti salvaging 30 סלקטיבי בריכוז של 1 µM. דגרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.

לאחר הטיפול באנטגוניסט, גרו את התאים באמצעות האגוניסט CRF והדגרו אותם בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות עבור תאים שלא טופלו. החליפו את המצע בשני מיליליטרים של מצע טרי לאחר הטיפול.

החליפו את המצע בכל באר בשני מיליליטרים של מצע טרי והוסיפו anti HHA בדילול של 1:1,000, לאחר דגירה של 60 דקות ב-37 °C. שאבו את המצע והוסיפו שתי מיליליטרים של מקבע לכל באר. דגרו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ולאחר מכן שאבו את המקבע.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם Tris buffered saline. הוסיפו 100 µL של תמיסת חסימה מעל כל זכוכית כיסוי והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, שאבו את תמיסת החסימה הקיימת מהבארים והוסיפו 100 µL של תערובת נוגדנים משניים רעננה לכל זכוכית כיסוי, ולאחר דגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר ובחושך, שטפו ארבע פעמים עם TBSC על ידי הוספה והסרה עדינה של התמיסה מדופן הבאר, תוך השארת התמיסה של השטיפה האחרונה.

הרימו כל זכוכית כיסוי בעזרת מחט ופינצטה קמורה. הניחו את זכוכית הכיסוי כאשר התאים פונים כלפי מטה על גבי שקופית עם טיפה של מדיום קיבוע vector shield, קבעו אותה בעזרת לק והמתינו לייבוש במשך 15 עד 20 דקות. נוגדן עכבר מצומד ל-Alexa 488 nm משמש להדמיית CFR two ו-DAPI משמש להדמיית הגרעינים בשלב המיטוטי. כדי להתחיל, קבעו את התאים המקובעים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי להגביל סובייקטיביות ניסויית, השאירו את תנאי הניסוי לא ידועים עד לאחר רכישת התמונות וניתוחן לצורך השגת התמונות.

עושה שימוש בעדשת אובייקטיב DIC מסוג plan acro mat oil עם הגדלה של 63 x ומספר מפתח (numerical aperture) של 1.4, בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקאלי zeis LSM five 10 meta המחובר למערכת לייזר דו-פוטונית משולבת של coherent. במהלך תהליך רכישת הנתונים, יש לבצע חלוקה למדורים (compartmentalization) של התאים הן באמצעות רב-ערוציות והן באמצעות חלוקה ל-c, כדי לכלול נתונים מהמעטפת הגרעינית ועד לקצוות הקולטנים החוץ-תאיים החיצוניים. יש לעבד את נתוני הפלואורסצנציה באמצעות amris, המאפשרת ויזואליזציה וסגמנטציה של סט נתונים של מיקרוסקופיה בתלת-ממד. בהתאם לאלגוריתם שתוכנן על ידי Amaris, השתמש תחילה ברינדור פני שטח (surface rendering) כדי לייצג את המעטפת הגרעינית NU.

תוכנת Amaris תקבע אם קיים יותר מגרעין אחד באזור העניין, או ROI. לאחר מכן, השתמש באלגוריתם יצירת הנקודות כדי לאתר את שתי נקודות ההרחבה של CFR two. כדי לפצות על רעשי רקע ועצימות לא אחידה של הרשת המורכבת של תאים בעלי צורה אמורפית ולמקסם את הכללת כל יחידת גילוי פלואורסצנציה של CFR two, הגדר את קוטר הנקודות ל-0.2 micrometers, שהיא היחידה הקטנה ביותר בתוך התמונה.

דבר זה מאפשר אקסטרפולציה של מידע מובחן בצורה של עוצמה נמדדת. בעזרת מסנן גאוסי, שלבו סינון נקודות (spot filtering) בתהליך היצירה האוטומטי של הנקודות. כדי למנוע קיטוע נתונים, המירו את סט הנתונים מנקודה קבועה של שמונה ביטים למספר שלם צף של 32 ביט.

בחר את המשטח שנוצר וקבע את המיקום המרחבי המדויק של כל נקודה מחוץ למשטח הגרעין על ידי ביצוע טרנספורמציית מרחק (distance transformation), כאשר ממברנת הגרעין משמשת כנקודת ייחוס. המר את נתוני עוצמת הווקסלים לנתוני קואורדינטות של הנקודות באמצעות מודול ameris XT המקושר ל-MATLAB. בחר את הנקודות ובחר את הקידוד הסטטיסטי תחת סוג הסטטיסטיקה.

בחרו את מרכז העוצמה שדווח בערוץ החדש שנוצר. טענו את הצבע הרצוי לתצוגה והגדירו את טווח מפת הצבעים לצורך הניתוח. ניתן להציג את הנתונים המספריים בלשונית הסטטיסטיקה ולייצא אותם ל-excel באמצעות GraphPad prism.

כמת את הנתונים שהתקבלו והצג אותם בפורמט גרפי לצורך ניתוח סטטיסטי. בצע השוואות בין קבוצות באמצעות Inova דו-כיוונית ומבחן Bonferroni לאחר המבחן; הצג את הנתונים כממוצע פלוס או מינוס סטיית תקנית. כדי להדגים את יעילותו של גישה זו, בוחן את השינויים התאיים הנובעים מהאינטראקציה בין קולטנים המצומדים לחלבון G ובין קולטן 2 של גורם משחרר קורטיקוטרופין עם הליגנד האנדוגני שלו, CRF.

בתאי HT K 2 93 שעברו טרנספקציה, נמדדו כמיות של תמונות ממוזגות שהוצגו באמצעות נוגדן משני אנטי-עכבר המשולב עם Alexa 4 88, ו-DPI להדגשת הגרעינים. התוצאות מעידות כי רצפטורי CRF R two ממוקמים בממברנת הפלזמה ובולטים מאזורים מוגדרים בממברנת התאים. באמצעות ניתוח דו-ממדי (2D) קונבנציונלי, ניתן לזהות תת-אוכלוסייה זו של רצפטורי CRF R two חוץ-תאיים רק אם מנתחים את נקודות ההיצמדות של הרצפטורים לכיסויי הזכוכית.

כתוצאה מכך, כל מידע אחר הנגזר מנתונים מולטיספקטרליים (MULTISPECTRAL) שנערמו ב-ZS אובד. התוצאה לא הראתה הבדל בין קבוצת הביקורת לבין האגוניסט. בעוד שנקודות היצמדות הרספטורים שונות באופן דרמטי כאשר התאים מטופלים ב-CRF, הרספטורים החוץ-תאיים מופחתים במידה ניכרת, כפי שמעידה הירידה במרחק הנקודות מממברנת הפלזמה.

הם מופצים מחדש ממיקומים מוגדרים בעיקר למספר מיקומים נפרדים. השפעת ה-CRF על התפלגות הקולטנים בממברנה נמנעת על ידי טיפול מקדים עם אנטגוניסטים ספציפיים ל-CR2. 30 30.

תחת תנאים אלו, שתי ההארכות של ה-CRFR אינן משתנות עם טיפול ב-CRF. ההפצה הדיסטלית של הנקודות, המוצגות במרווחי צבע של ספקטרום של 5 µm, משמשת להמחשת המרחק של הווקסלים מהמעטפת הגרעינית. לא נראה הבדל מובהק בכיווץ GPCR בין קבוצת הביקורת ללא טיפול לבין קבוצת הטיפול המקדים באנטגוניסט לפני טיפול באגוניסט.

טיפול בתאים באמצעות האגוניסט CRF מפחית באופן הדרגתי את מספר הווקסלים המכילים CRF2 בהשוואה לאי-טיפול או בהשוואה לתאים שעברו טיפול מקדים עם אנטגוניסט. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום טכניקות דימוי כמותיות לחקור ולאפיין שינויים פנוטיפיים רבים בתא בודד, מה שהופך בדיה זו מבוססת-התאים לכלי נוסף לאפיון תא בודד בתהליך גילוי תרופות.