כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

פתחנו פלטפורמת תוכנה שמנצלת Imaris Neuroscience, ImarisXT וMATLAB כדי למדוד את השינויים במורפולוגיה של צורה מוגדרת נלקחה מפלואורסצנטי confocal תלת ממדי של תאים בודדים. זו גישה חדשנית יכולה לשמש כדי לכמת את השינויים בצורת התא בא הפעלה קולטנית ולכן מייצגת כלי נוסף אפשרי לגילוי סמים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק שיטה אוטומטית לניתוח וכימות שינויים במורפולוגיה של תא צורה לא מוגדר שנלקח מתמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות תלת מימדיות. זה מושג על ידי ביצוע ניסוי הגירוי הכימי שיכלול תאים שטופלו בתאים אגוניסטיים, טופלו באנטגוניסט, ולאחר מכן אגוניסטים ותאים ללא טיפול. לאחר מכן מכינים את התאים לניתוח אימונופלואורסצנטי.

השלב השני הוא רכישת תמונות פלואורסצנטיות תלת מימדיות רב-ספקטרליות. הניתוח המורפומטרי התלת מימדי הבא מבוצע באמצעות תוכנת המחשב ameris neuroscience, ameris XT ו-MATLAB. השינויים הפנוטיפיים של התא הבודד המומחשים באמצעות ניתוח מורפומטרי תלת מימדי מנותחים ומכומתים כשלב אחרון.

בסופו של דבר, פלטפורמת תוכנה זו משמשת לכימות שינויים בצורת התא לאחר הפעלת הקולטן, ומספקת כלי נוסף לגילוי תרופות. בדרך כלל, לחוקרים יש מומחיות סטנדרטית במערכת ביולוגית, ייתכן שאין להם היכרות עם יישומי מחשב. בפרוטוקול זה במודול I 60, גשר על הפער בין דה ויזואליזציה לשפת המחשב לפני תחילת הליך זה.

טרנספקט תאי כליה עובריים אנושיים עם המגלוטינין מתויג קורטיקוטרופין קולטן גורם משחרר שניים או CRF R שניים כפי שמוזכר בפרוטוקול הכתוב. CFR 2 הוא קולטן מצומד לחלבון G או GPCR. למחרת מכסה הלהבה של הטרנספקציה מחליק ומניח אותם בצלחת של שש בארות.

הוסף 10 מיליליטר PBS לבקבוקון של חמישה מיליגרם פוליליזין ליופיליזין וערבב. לאחר מכן יש לדלל חמישה מיליליטר פוליליזין מומס ב -500 מיליליטר PBS ולהוסיף שני מיליליטר מהתערובת על כל אחת מהחלקות הכיסוי. השאירו את הצלחת עם החלקות כיסוי בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לאחר 20 דקות, שטפו את החלקות הכיסוי על ידי הוספת שני מיליליטר PBS ואז הסרה, חזור על תהליך זה פעמיים.

מהדורה עוקבת של שני מיליליטר של DMEM עם מדיה של 10% FBS מוסיפים שתיים עד חמש טיפות של תאים על החלקות הכיסוי. התאים צריכים להיות בריכוז הדרוש כדי להשיג שטף של 60%. למחרת.

דגרו על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למחרת. בדוק שהתאים מתכנסים ב-60% לטיפול באגוניסטים. לעורר תאים ייעודיים על ידי החלפת המדיה בשני מיליליטר מדיה בתוספת CRF R שני גורמים משחררי קורטיקוטרופין ליגנד אנדוגני בריכוז של מיקרומולר אחד.

דגרו על התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי שתאים יטופלו מראש באנטגוניסט. החלף את המדיה בשני מיליליטר של מדיה בתוספת CFR סלקטיבי שני אנטגוניסטים אנטי הצלה 30 בריכוז של מיקרו-טוחנת אחת. דגרו את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר טיפול אנטגוניסטי. לעורר את התאים עם ה-CRF האגוניסטי ולדגור אותו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לתאים לא מטופלים. החלף את המדיה בשני מיליליטר מדיה טרייה לאחר הטיפול.

החלף את המדיה בכל באר בשני מיליליטר של מדיה טרייה והוסף אנטי HHA מדולל אחד לאלף, לאחר דגירה של 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. שאפו את המדיה והוסיפו שני מיליליטר של קיבוע לכל אחד. ובכן דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לאחר שאיבת הקיבוע.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם תמיסת מלח נפוחה. קיין. מוסיפים 100 מיקרוליטר תמיסת דם על גבי כל כיסוי, מחליקים ומודגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן שאפו את תמיסת הכתמים הקיימת מהבארות והוסיפו 100 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים משני טרי על כל החלקת כיסוי לאחר דגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר בכביסה החשוכה ארבע פעמים עם TBSC על ידי הוספה והסרה עדינה של התמיסה מדופן הבאר בעודם בתמיסת הכביסה הסופית.

הרם כל פתק כיסוי בעזרת מחט ומלקחיים מעוקלים. הנח את תאי ההחלקה של הכיסוי כלפי מטה על שקופית עם טיפה של מדיום הרכבה של מגן וקטורי עם תיקון עם לק ותן לו להתייבש במשך 15 עד 20 דקות. Alexa, 4 88 ננומטר נוגדן מוזה מצומד משמש להדמיית CFR 2 ו-DAPI משמש להמחשת השלב המיטוטי של הגרעינים כדי להתחיל להרכיב את תאי הקיבוע על מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להגביל את הסובייקטיביות הניסיונית, לשמור על תנאי הניסוי לא ידועים עד לאחר רכישת התמונות וניתוחם כדי לרכוש תמונות.

נעשה שימוש בשמן אקרו מט תוכנית, מטרת DIC עם הגדלה של פי 63 וצמצם מספרי של 1.4 בשילוב עם מיקרוסקופ zeis LSM חמש 10 מטא קונפוקלי המחובר למערכת לייזר משולבת קוהרנטית של שני פוטונים במהלך תהליך רכישת הנתונים, מידור התאים הן על ידי חלוקה רב-ערוצית והן על ידי חלוקה c כדי לכלול נתונים מהממברנה הגרעינית לקצוות הקולטן החוץ-תאיים החיצוניים. עבד את נתוני הקרינה באמצעות אמריס, המאפשר הדמיה ופילוח של מערך נתונים של מיקרוסקופיה תלת מימדית. בעקבות האלגוריתם שתוכנן על ידי אמריס תחילה, השתמש בעיבוד פני השטח כדי לייצג את הממברנה הגרעינית של NU.

אמריס תקבע אם יש יותר מגרעין אחד באזור העניין, או ROI. לאחר מכן, השתמש באלגוריתם יצירת הכתמים כדי לאתר את שתי נקודות ההרחבה של CFR. מפצה על רעשי רקע ועוצמה לא סדירה של הרשת המורכבת של תאים בצורת אמורפיים כדי למקסם את ההכללה של כל יחידת זיהוי פלואורסצנטי של CFR שתיים, הגדר את קוטר הכתמים ל-0.2 מיקרומטר, שהיא היחידה הקטנה ביותר בתמונה.

זה מאפשר אקסטרפולציה של מידע מובחן בצורה של עוצמה נמדדת. באמצעות מסנן גאוס, שלבו סינון נקודתי בתהליך היצירה האוטומטי של הספוט. כדי להימנע מקטיון נתונים, המר את מערך הנתונים מנקודה קבועה של שמונה סיביות לציפה של 32 סיביות.

בחר את המשטח שנוצר וקבע את המיקום המרחבי המדויק של כל נקודה מחוץ לפני השטח הגרעיני על ידי ביצוע טרנספורמציה למרחק באמצעות הממברנה הגרעינית כנקודת ייחוס. החלף את נתוני עוצמות הווקסל כדי לזהות נתוני קואורדינטות באמצעות מודול ameris XT המתממשק עם MATLAB. בחר נקודות ובחר סטטיסטיקה מקודדת בסוג סטטיסטי.

בחר את מרכז העוצמה המדווח בערוץ החדש שנוצר. טען את הצבע הרצוי לתצוגה והגדר את טווח מפת הצבעים לניתוח. ניתן להמחיש את הנתונים המספריים בכרטיסייה הסטטיסטית ולייצא אותם לאקסל באמצעות פריזמה של GraphPad.

לכמת את הנתונים המתקבלים ולהציג בפורמט גרפי לניתוח סטטיסטי. בצע השוואות בין קבוצות המשתמשות בנתונים דו-כיווניים של Inova ו-Bonferroni לאחר המבחן כממוצע פלוס או מינוס סטיית תקן. כדי להדגים את כוחה של גישה זו, השינויים התאיים הנובעים מהאינטראקציה של קולטנים מצומדים של חלבון G וקולטן גורם שחרור קורטיקוטרופין 2 עם ה-CRF האנדוגני שלו.

ב-HT K 2 93 תאים כומתו תמונות ממוזגות מומחשות באמצעות Alexa 4 88 מצומד, אנטי עכבר, נוגדן משני ו-DPI כדי להמחיש את הגרעינים. התוצאות מגלות כי שני קולטני CRF R ממוקמים בקרום הפלזמה ומקרינים מאזורים סופיים של קרום התאים. באמצעות ניתוח דו-ממדי קונבנציונלי, ניתן לזהות תת-קבוצה זו של שני קולטנים CRF R חוץ-תאיים רק אם מנתחים את נקודות ההדבקה של הקולטן על כיסויי הזכוכית.

כתוצאה מכך, כל מידע אחר שנגזר מנתוני MULTISPECTRAL מוערמים של ZS הולך לאיבוד. התוצאה לא בחרה בהבדל בין אי-טיפול לבין אגוניסט. בעוד שנקודות ההדבקה של הקולטן שונות באופן דרמטי כאשר התאים מטופלים ב-CRF, הקולטנים החוץ-תאיים מצטמצמים מאוד כפי שמוצג על ידי הירידה במרחק הכתמים מקרום הפלזמה.

הם גם מחולקים מחדש ממיקומים סופיים בעיקר למספר מיקומים דיסקרטיים. ההשפעה של CRF על התפלגות קרום הקולטן נמנעת על ידי טיפול מקדים בשני אנטגוניסטים ספציפיים של CR. 30 30.

בתנאים אלה, שתי הרחבות ה-CRFR אינן משתנות עם טיפול ב-CRF. ההתפלגות הדיסטלית של כתמים המשורטטים במרווחים מקודדי צבע בספקטרום של חמישה מיקרומטר מנוצלת כדי לדמיין את המרחק של הווקסלים מהממברנה הגרעינית. שום טיפול וטיפול מקדים אנטגוניסטים לפני הטיפול באגוניסט לא הראו הבדל משמעותי בהתכווצות GPCR.

טיפול בתאים עם CRF אגוניסטי מפחית בהדרגה את מספר ה-CFR שניים המכילים ווקסלים בהשוואה ללא טיפול או בהשוואה לתאים. טופל מראש עם אנטגוניסט כמו לאחר התפתחותו. טכניקה זו מילאה את הדרך לחוקרים בתחום טכניקת הדמיית הכימות לחקור ולאפיין שינויים פנוטיפיים רבים של תא בודד, מה שהופך את הבדיקה מבוססת התאים הזו לכלי פרופיל נוסף של תא בודד לתהליך גילוי התרופות.