שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא להרחיב במגוון תאי T או INKT קטלניים טבעיים שנקטפו מהטחול של העכבר. זה מושג תחילה על ידי בידוד תאים חד-גרעיניים של הטחול, ולאחר מכן העשרה של אוכלוסיית הלימפוציטים החיוביים CD 5 על ידי הפרדת תאים מגנטיים. לאחר מכן, חלק תאי ה-INKT הטחול מבודד עוד יותר על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות.

בשלב האחרון, תאי ה-INKT הממוינים יושבים להרחבה במבחנה. בסופו של דבר, פרופיל הציטוקינים של תאי ה-INKT המורחבים יכול להיות מוערך על ידי אלייזה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהטיהור וההרחבה של תאי INKT דורשים שילוב של טכניקות שונות לביצוע.

הליך זה יילקח על ידי סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר קצירת הטחול, העבירו את הרקמה למסנן ניילון של 70 מיקרון, ולאחר מכן השתמשו בבוכנת מזרק של שני מיליליטר כדי למעוך בעדינות את הטחול דרך המסננת לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ולשטוף את המסנן עם חמישה מיליליטר PBS. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר מחבילת הפחם לצינור של 15 מיליליטר וכסה את שיפוע הצפיפות עם חמשת המיליליטר של המתלה הסלולרי.

הפרד את התאים באמצעות צנטריפוגה והעביר את הממשק לצינור חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את התאים ב-10 מיליליטר PBS קר והשעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מאגר פקס כדי להעשיר עבור ה-CD חמישה לימפוציטים חיוביים של הטחול. התאם את דילול התאים לאחד פי 10 לתאים השביעיים לכל 90 מיקרוליטר עם יותר מאגר פקס והוסף 10 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד CD חמישה לתאים.

לאחר 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את התאים עם ארבעה מיליליטר של מאגר פקס והשהו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר פקס טרי. בודד את ה-CD חמישה תאים חיוביים על ידי הפרדת תאים מגנטיים בהתאם להמלצת היצרן. לאחר מכן יש לדלל את ה-CD המועשר בחמישה לימפוציטים חיוביים בפעם אחת 10 לששת התאים לכל 20 מיקרוליטר אינקס מאגר המכיל אנטי CD 16, CD 32 ו-PE מצומד אלפא גלס אוויר CD 1D טטרמר בטמפרטורת החדר בחושך לאחר 30 דקות, לדגור על התאים עם הנוגדנים המעניינים בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות נוספות.

לאחר מכן שטפו את התאים במאגר פקס טרי וצבעו אותם ב-10 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של 20 מיקרו-מולרית של DPI לכל אחד כפול 10 לששת התאים למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר רוכשים כעת בערך 1 פעמים 10 ל-CD המועשר הרביעי חמישה אירועי לימפוציטים חיוביים על ציטומטר הזרימה באופן אלקטרוני על הפיזור הקדמי עם תאים נמוכים כדי לא לכלול את הכפילות והאגרגטים של התאים באופן אלקטרוני. הוצא את ה-CD החיובי של DAPI שמונה תאים חיוביים ל-CD 19 בתוך הפיזור הקדמי עם אוכלוסייה נמוכה והשתמש בתרשים פיזור צדדי ואזור פיזור קדימה.

כדי לבחור אלקטרונית את הלימפוציטים, יש לשרטט את טטרמרים אלפא גל SER CD 1D על ידי CD שלושה אפסילון ובאופן אלקטרוני את אלפא גל סר CD 1D טטרמר חיובי CD שלושה תאי INKT חיוביים אפסילון כפי שמצוין. לאחר מכן, רכישת לא יותר מפעמיים 10 ל-CD החמישי, חמישה לימפוציטים מועשרים חיוביים קובעים את אחוז תאי ה-INKT החיוביים של אלפא גל SER, CD 1D, שלושה תאי INKT חיוביים של אפסילון הקיימים במקטע התאי המועשר. באמצעות מיון שער נמוך זה, האלפא אלסר CD 1D טטרמר חיובי CD שלושה תאי INKT חיוביים של אפסילון לתוך שפופרת פקס המכילה מיליליטר אחד של סרום עגל עוברי בסוף המיון.

שטפו את תאי ה-NKT המבודדים מהצד של צינור הפקס עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640. לאחר מכן סובב את התאים, השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של RPMI 1640 והשתמש בכמות של 40 מיקרוליטר של התאים כדי להעריך את טוהר התאים הממוינים. שימוש באותה אסטרטגיית שער.

באשר להגדרת פרמטרי המיון להרחבת תאי ה-INKT, סובב את התאים והשהה מחדש את התאים המבודדים בחמש פעמים 10 עד לתאים החמישיים למיליליטר במדיום RPMI 1640 שלם בתוספת IL שניים, IL 12 ואנטי CD 28. לאחר מכן זרעו את התאים בפעם אחת 10 עד תאי ה-INKT החמישיים לבאר בצלחת מצופה אנטי CD עם תחתית שטוחה של 96 ודגרו אותם ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים. לאחר יומיים, העבירו את התאים לצלחת באר תחתונה שטוחה טרייה לא מצופה 96 לתרבית בתנאי מנוחה ב-RPMI 1640 מלא.

בינוני לדגירה נוספת של יומיים. ביום הרביעי לאחר המיון, יש לזרוק בעדינות את הסופרנטנט בכל באר כדי לעקור את התאים ולאגד אותם בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את החך בחמש פעמים 10 עד החמישי תאים למיליליטר.

במדיום RPMI 16 מלא בתוספת IL שבע וזרע אחד כפול 10 עד חמישי תאים לבאר. בצלחת חדשה עם תחתית שטוחה של 96 בארות החזר את התאים לחממה לאחר ארבעה ימים, משוך אותם בצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. יש להשעות מחדש את הגלולה במדיום RPMI 1640 שלם המכיל אנטי CD 28 מסיס ולזרוע את התאים על צלחת תחתונה שטוחה של 96 באר המצופה באנטי CD שלושה אפסילון בפעם אחת 10 מהתאים החמישיים לבאר ולהחזיר את התאים לאינקובטור למשך שלושה ימים נוספים, ארבעה ימים, 11 עד 18.

חזור על הטיפול ב-IL 7 anti CD 28 ו-anti CD three epsilon כפי שהודגם זה עתה ביום ה-19. העבירו את התאים לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. סובב אותם והשהה מחדש את הגלולה בחמש פעמים 10 עד חמישית תאים למיליליטר ב-RPMI 1640 שלם.

לאחר מכן זרעו את התאים בפעם אחת 10 עד חמישית תאים לבאר בצלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות ואפשרו לתאים לנוח במשך יומיים בחממת תרבית התאים. גירוי תאי INKT ממוינים עם אנטי CD שלוש אפסילון כרוך בצלחת בנוכחות IL 2 IL 12 ואנטי CD 28 מסיס מביא להרחבה של בערך פי שלושה של מספרי INKT לאחר יומיים של תרבית. התרחבות עוקבת של תאי ה-INKT בנוכחות IL 7 מביאה לעלייה של פי שלושה עד ארבעה במספר תאי ה-INKT הקיימים ביום הרביעי בתרבית.

יש לציין שחזרה על תנאי תרבית אלה יכולה להניב בממוצע שבע פעמים 10 לתאי ה-INKT השביעיים לאחר שני סבבי התפשטות ללא אובדן נראה לעין של תאים בין השינויים במצע התרבית בימים שונים, וכתוצאה מכך התרחבות של לפחות פי 70 ב-18 ימים. תאי INKT מורחבים נוספים המופעלים עם מורין רקומביננטי קשור לצלחת. CD 1D עמוס באלסר אלפא מייצר IL 2 IL 4 IFN gamma, TNF alpha ו-IL 6 ב-48 שעות לאחר הגירוי, מה שמדגים שתאי ה-INKT שומרים על יכולתם לייצר ציטוקינים TH אחד ו-TH שני לאחר התפשטות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי צביעה נכונה של תאי INKT עם cdre טעון אלפא סרמיד חיונית לזיהוי תאי ה-INKT בזמן זרימה ציטומטרית. בטוח.