שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר
29 באוקטובר 2015
כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם שניתן להשתמש בו כדי ליצור מספר רב של תאי T רוצחים טבעיים קבועים של עכברים מטחול עכבר. הפרוטוקול מתאר גישה שבאמצעותה ניתן להעשיר תאי iNKT טחול, לבודד ולהרחיב אותם במבחנה באמצעות מספר מוגבל של בעלי חיים וריאגנטים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להרחיב במגוון תאי T או INKT קטלניים טבעיים שנקטפו מהטחול של העכבר. זה מושג תחילה על ידי בידוד תאים חד-גרעיניים של הטחול, ולאחר מכן העשרה של אוכלוסיית הלימפוציטים החיוביים CD 5 על ידי הפרדת תאים מגנטיים. לאחר מכן, חלק תאי ה-INKT הטחול מבודד עוד יותר על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות.
בשלב האחרון, תאי ה-INKT הממוינים יושבים להרחבה במבחנה. בסופו של דבר, פרופיל הציטוקינים של תאי ה-INKT המורחבים יכול להיות מוערך על ידי אלייזה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהטיהור וההרחבה של תאי INKT דורשים שילוב של טכניקות שונות לביצוע.
הליך זה יילקח על ידי סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר קצירת הטחול, העבירו את הרקמה למסנן ניילון של 70 מיקרון, ולאחר מכן השתמשו בבוכנת מזרק של שני מיליליטר כדי למעוך בעדינות את הטחול דרך המסננת לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ולשטוף את המסנן עם חמישה מיליליטר PBS. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר מחבילת הפחם לצינור של 15 מיליליטר וכסה את שיפוע הצפיפות עם חמשת המיליליטר של המתלה הסלולרי.
הפרד את התאים באמצעות צנטריפוגה והעביר את הממשק לצינור חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את התאים ב-10 מיליליטר PBS קר והשעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מאגר פקס כדי להעשיר עבור ה-CD חמישה לימפוציטים חיוביים של הטחול. התאם את דילול התאים לאחד פי 10 לתאים השביעיים לכל 90 מיקרוליטר עם יותר מאגר פקס והוסף 10 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד CD חמישה לתאים.
לאחר 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את התאים עם ארבעה מיליליטר של מאגר פקס והשהו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר פקס טרי. בודד את ה-CD חמישה תאים חיוביים על ידי הפרדת תאים מגנטיים בהתאם להמלצת היצרן. לאחר מכן יש לדלל את ה-CD המועשר בחמישה לימפוציטים חיוביים בפעם אחת 10 לששת התאים לכל 20 מיקרוליטר אינקס מאגר המכיל אנטי CD 16, CD 32 ו-PE מצומד אלפא גלס אוויר CD 1D טטרמר בטמפרטורת החדר בחושך לאחר 30 דקות, לדגור על התאים עם הנוגדנים המעניינים בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות נוספות.
לאחר מכן שטפו את התאים במאגר פקס טרי וצבעו אותם ב-10 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של 20 מיקרו-מולרית של DPI לכל אחד כפול 10 לששת התאים למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר רוכשים כעת בערך 1 פעמים 10 ל-CD המועשר הרביעי חמישה אירועי לימפוציטים חיוביים על ציטומטר הזרימה באופן אלקטרוני על הפיזור הקדמי עם תאים נמוכים כדי לא לכלול את הכפילות והאגרגטים של התאים באופן אלקטרוני. הוצא את ה-CD החיובי של DAPI שמונה תאים חיוביים ל-CD 19 בתוך הפיזור הקדמי עם אוכלוסייה נמוכה והשתמש בתרשים פיזור צדדי ואזור פיזור קדימה.
כדי לבחור אלקטרונית את הלימפוציטים, יש לשרטט את טטרמרים אלפא גל SER CD 1D על ידי CD שלושה אפסילון ובאופן אלקטרוני את אלפא גל סר CD 1D טטרמר חיובי CD שלושה תאי INKT חיוביים אפסילון כפי שמצוין. לאחר מכן, רכישת לא יותר מפעמיים 10 ל-CD החמישי, חמישה לימפוציטים מועשרים חיוביים קובעים את אחוז תאי ה-INKT החיוביים של אלפא גל SER, CD 1D, שלושה תאי INKT חיוביים של אפסילון הקיימים במקטע התאי המועשר. באמצעות מיון שער נמוך זה, האלפא אלסר CD 1D טטרמר חיובי CD שלושה תאי INKT חיוביים של אפסילון לתוך שפופרת פקס המכילה מיליליטר אחד של סרום עגל עוברי בסוף המיון.
שטפו את תאי ה-NKT המבודדים מהצד של צינור הפקס עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640. לאחר מכן סובב את התאים, השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של RPMI 1640 והשתמש בכמות של 40 מיקרוליטר של התאים כדי להעריך את טוהר התאים הממוינים. שימוש באותה אסטרטגיית שער.
באשר להגדרת פרמטרי המיון להרחבת תאי ה-INKT, סובב את התאים והשהה מחדש את התאים המבודדים בחמש פעמים 10 עד לתאים החמישיים למיליליטר במדיום RPMI 1640 שלם בתוספת IL שניים, IL 12 ואנטי CD 28. לאחר מכן זרעו את התאים בפעם אחת 10 עד תאי ה-INKT החמישיים לבאר בצלחת מצופה אנטי CD עם תחתית שטוחה של 96 ודגרו אותם ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים. לאחר יומיים, העבירו את התאים לצלחת באר תחתונה שטוחה טרייה לא מצופה 96 לתרבית בתנאי מנוחה ב-RPMI 1640 מלא.
בינוני לדגירה נוספת של יומיים. ביום הרביעי לאחר המיון, יש לזרוק בעדינות את הסופרנטנט בכל באר כדי לעקור את התאים ולאגד אותם בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את החך בחמש פעמים 10 עד החמישי תאים למיליליטר.
במדיום RPMI 16 מלא בתוספת IL שבע וזרע אחד כפול 10 עד חמישי תאים לבאר. בצלחת חדשה עם תחתית שטוחה של 96 בארות החזר את התאים לחממה לאחר ארבעה ימים, משוך אותם בצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. יש להשעות מחדש את הגלולה במדיום RPMI 1640 שלם המכיל אנטי CD 28 מסיס ולזרוע את התאים על צלחת תחתונה שטוחה של 96 באר המצופה באנטי CD שלושה אפסילון בפעם אחת 10 מהתאים החמישיים לבאר ולהחזיר את התאים לאינקובטור למשך שלושה ימים נוספים, ארבעה ימים, 11 עד 18.
חזור על הטיפול ב-IL 7 anti CD 28 ו-anti CD three epsilon כפי שהודגם זה עתה ביום ה-19. העבירו את התאים לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. סובב אותם והשהה מחדש את הגלולה בחמש פעמים 10 עד חמישית תאים למיליליטר ב-RPMI 1640 שלם.
לאחר מכן זרעו את התאים בפעם אחת 10 עד חמישית תאים לבאר בצלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות ואפשרו לתאים לנוח במשך יומיים בחממת תרבית התאים. גירוי תאי INKT ממוינים עם אנטי CD שלוש אפסילון כרוך בצלחת בנוכחות IL 2 IL 12 ואנטי CD 28 מסיס מביא להרחבה של בערך פי שלושה של מספרי INKT לאחר יומיים של תרבית. התרחבות עוקבת של תאי ה-INKT בנוכחות IL 7 מביאה לעלייה של פי שלושה עד ארבעה במספר תאי ה-INKT הקיימים ביום הרביעי בתרבית.
יש לציין שחזרה על תנאי תרבית אלה יכולה להניב בממוצע שבע פעמים 10 לתאי ה-INKT השביעיים לאחר שני סבבי התפשטות ללא אובדן נראה לעין של תאים בין השינויים במצע התרבית בימים שונים, וכתוצאה מכך התרחבות של לפחות פי 70 ב-18 ימים. תאי INKT מורחבים נוספים המופעלים עם מורין רקומביננטי קשור לצלחת. CD 1D עמוס באלסר אלפא מייצר IL 2 IL 4 IFN gamma, TNF alpha ו-IL 6 ב-48 שעות לאחר הגירוי, מה שמדגים שתאי ה-INKT שומרים על יכולתם לייצר ציטוקינים TH אחד ו-TH שני לאחר התפשטות.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי צביעה נכונה של תאי INKT עם cdre טעון אלפא סרמיד חיונית לזיהוי תאי ה-INKT בזמן זרימה ציטומטרית. בטוח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שיטה להרחבת תאי ט (iNKT) טבעיים אינווריאנטיים מטחול עכבר. הוא מפרט את בידוד והעשרת תאי iNKT ספלניים להרחבה in vitro, תוך שימוש במספר מוגבל של בעלי חיים ותגובנים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה תאית
- פרוטוקולים ניסיוניים
רקע
- תאי ט טבעיים אינווריאנטיים (iNKT) ממלאים תפקיד קריטי בתגובות חיסוניות.
- בידוד והרחבה של תאי iNKT הם חיוניים ליישומים מחקריים שונים.
- שיטות מסורתיות יכולות להיות עתירות משאבים ומורכבות.
- פרוטוקול זה נועד לייעל את התהליך לנגישות טובה יותר.
מטרת המחקר
- לספק שיטה אמינה להרחבת תאי iNKT מטחול עכבר.
- להגדיל את התשואה של תאי iNKT תוך שימוש במשאבים מינימליים.
- להקל על מחקר נוסף על התכונות הפונקציונליות של תאי iNKT.
שיטות ששימשו
- בידוד תאים מונו-גרעיניים ספלניים.
- העשרת לימפוציטים חיוביים ל-CD5 באמצעות הפרדת תאים מגנטית.
- בידוד תאי iNKT ספלניים באמצעות מיון תאים פעיל פלואורסצנטי.
- הרחבה in vitro של תאי iNKT ממויינים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח והרחבה של תאי iNKT מטחול עכבר.
- הדגמה של פרופיל הציטוקינים של תאי iNKT מורחבים.
- זיהוי אתגרים שעומדים בפני מתחילים בשיטה.
- מתן פרוטוקול מפושט למחקרים עתידיים.
מסקנות
- הפרוטוקול המותאם מגדיל ביעילות את התשואה של תאי iNKT.
- הוא מפשט את התהליך, מה שהופך אותו לנגיש יותר לחוקרים.
- מחקרים נוספים יכולים לנצל תאי iNKT מורחבים ליישומים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and expansion of murine invariant natural killer T (iNKT) cells enables robust preclinical modeling of innate-adaptive immune interactions. This optimized workflow supports high-yield generation of functional iNKT cells for mechanistic studies, target validation, and translational research. The method enhances predictive confidence in immunology-focused discovery pipelines by providing standardized, scalable access to disease-relevant cell populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of iNKT cell-mediated immune pathways for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by providing functionally characterized iNKT cells for hypothesis testing.
- Facilitates portfolio triage by clarifying the role of iNKT cells in immune modulation.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of iNKT cells for standardized in vitro assays.
- Enables quantitative assessment of cytokine secretion profiles post-expansion.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening targeting iNKT biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant model systems by enabling in vivo transfer of expanded iNKT cells.
- Maintains functional cytokine production, supporting translational biomarker studies.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation of immune-modulating agents.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the immunology discovery continuum, spanning early target validation, assay development, and preclinical modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification using purified, functional iNKT cells.
- Screening: Delivers assay-ready iNKT cells with reproducible expansion and cytokine output.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cytokine profiles for comparative analysis.
- Translational Research: Provides expanded cells for in vivo transfer and biomarker alignment in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for repeated use across immunology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Standardizes iNKT cell preparation, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, magnetic cell separation, and cell culture techniques.
- Demands access to FACS instrumentation and cytokine analysis platforms (e.g., ELISA).
- Necessitates cross-team standardization of gating and sorting strategies for reproducibility.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for cell yield and purity.
- Proper staining and gating are critical for accurate iNKT cell identification and downstream utility.
