כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח תסיסנית melanogaster שימוש ב Flywalk פרדיגמה

המטרה הכוללת של בדיקה ביולוגית התנהגותית זו היא לחקור התנהגות מונחית ריח בזבובי חומץ. Fly Walk היא מערכת תפוקה גבוהה שעוקבת ומנתחת את התגובות ההתנהגותיות של מספר זבובים בודדים לגירויים של חוש הריח באופן אוטומטי. טכניקה חדשה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הריח של חרקים.

כמו מהו האיזון הנהנתני של ריח, או מה המשמעות של תוספת של ריחות נוספים לאיזון זה? היתרון העיקרי של ניסוי זה הוא שאנו יכולים להריח התנהגות מונחית ברזולוציה זמנית גבוהה, ואנו משתמשים בגירויי ריח הדומים לאלה שחרקים חווים בטבע או לאלה שאנו משתמשים בהם גם בהקלטות אלקטרופיזיולוגיות. באופן כללי, אנשים שמנסים להשתמש בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהיא באמת, היא זקוקה למערכת אטומה, אז אתה צריך לדעת לאן האוויר עובר ואתה צריך להיות בטוח שאין דליפות בכלל היכן שהאוויר יכול לעזוב את המערכת I עבור ניסויים אלה, חשוב לגדל את הזבובים תחת מחזור כהה של 12 עד 12 אור בתרביות נמוכות עד בינוניות המכילות א מדיום מזון רגיל.

שמור על טמפרטורת החדר בין 23 ל-25 מעלות צלזיוס, והלחות היחסית צריכה להיות בסביבות 70% בהכנה. שימוש בבקבוקוני תרבית גדולים יצר 20 עד 30 מבוגרים למשך שבוע ואסף קבוצות של 30 עד 40 צאצאים מעורבים כדי ליצור קבוצת ניסוי. כאשר קבוצה בת יומיים עד ארבעה ימים, העבירו אותה לבקבוקון חדש המכיל פקק קצף לח או נייר טישו לח.

תנו לזבובים לגווע ברעב בבקבוקון הזה במשך 24 שעות לפני הבדיקה. חיוני שהזבובים לא יורדמו במהלך העברה זו. עבור התקנה זו, בקבוקי 250 מיליליטר משמשים כמכשירי אדים רבים.

מלאו כל בקבוק ב-100 מיליליטר מים מזוקקים. לאחר מכן, הכינו מלאי עבודה של חצי מיליליטר מכל ריח כדילול אחד של 1000 של הריחות הטהורים והשמן המינרלי. באופן דומה, הכינו צינור PCR אחד עם שמן מינרלי בלבד כדי לשמש כבקרה שלילית.

כעת הכינו את מערכת אספקת הריח לכל ריח. בניסוי. חבר שני שסתומי סימון כדוריים לכל בקבוקון ריח.

הקפד לחבר את בקבוקוני הריח בכיוון הזרימה הנכון. חיבור שגוי לא רק יפגע בניסוי המתוכנן, אלא גם עלול לזהם את מערכת המשלוחים. לאחר מכן, בדוק אם יש נזילות במערכת.

ראשית, אטום את יציאת תא הערבוב. לאחר מכן בדוק שכל זרימת האוויר לפני מכשיר הגירוי יורדת לאפס. אם יש נזילות במערכת, הקשיבו להן.

בדרך כלל ניתן לפתור אותם על ידי החלפת אטמי גומי בחיבורים חיוניים או החלפת צינורות טפלון. בשלב הראשון של הליך זה, שבירת זכוכית היא דאגה, אז לבש ציוד מגן. העבירו בזהירות 15 זבובי בדיקה בודדים לצינורות הזכוכית הבודדים בעזרת שואב, סגרו את צינורות הזכוכית משני הצדדים באמצעות המתאמים המתאימים, עליהם להתאים היטב.

לאחר מכן, חבר את צינורות הזכוכית העמוסים להגדרת הליכת הזבובים. לאחר שכל הצינורות מחוברים, תנו לזבובים להתרגל לסביבה החדשה לפחות 15 דקות לפני תחילת הניסוי. כעת הפעל את מקור האור.

הקפד לספק מספיק אור למעקב יעיל מבלי להעלות את הטמפרטורה בתוך צינורות הזכוכית. יש לחבר את כל בקבוקוני הריח בשלב זה כדי ליצור מערכת סגורה. תקופת ההתרגלות מסתמכת על מערכת סגורה ללא נזילות, כך שזרימת האוויר דרך הצינורות היא באותה מהירות כמו בתקופות הבדיקה.

בדוק את זרימת האוויר במחשב, חבר אותו למדי הזרימה הדיגיטליים. סך זרמי האוויר היוצאים מהמערכת צריכים להיות שווים לזרימת האוויר הנכנסת למערכת. אם לא, קיימת נזילה.

הדליפה תשפיע על זרימת האוויר בכל הצינורות, אך הצינור הבעייתי הוא בדרך כלל זה שמציג את הירידה הגדולה ביותר בזרימת האוויר. אם מזוהה נזילה חדשה, היא נגרמת בדרך כלל על ידי צינור זכוכית שנשבר בתוך המתאם, או שהיא נגרמת על ידי רסיסי זכוכית בתוך המתאמים מניסויים קודמים. במהלך תהליך זה, וודאו את לחות האוויר היוצא מהמערכת בין 60 ל-80% לאחר שהזבובים הסתגלו לצינורות שלהם, ניתן לבצע את הניסוי.

באופן עקרוני, ניתן להציג עד כה כל רצף של ריחות. ניתן להשיג את התוצאות הטובות ביותר על ידי חלוקה אקראית של הגירויים והפרדתם ב-90 שניות לפחות. בסך הכל.

הצג כל ריח 40 פעמים בפולסים של 500 אלפיות השנייה. לאחר מכן, הגדר אזור עניין על-ידי גרירת מסגרת על פני האזור המיועד למעקב. כלול את כל 15 צינורות הזכוכית במסגרת, אך אל תכלול את חמשת המילימטרים החיצוניים של קצוות הצינורות.

השלב הבא הוא לכבות את תוכנת המעקב ולבצע שינויים בסקריפט. זה ישנה את מיקום ציר ה-Y של 14 הקווים המקבילים המפרידים בין הצינורות הבודדים. כאשר תוכנת המעקב מופעלת שוב, רק זבוב אחד אמור להיות נוכח בין כל שני קווים.

לאחר מכן, ודא שפרמטרי המצלמה מוגדרים כך שהזבובים יהיו במעקב אמין לאורך צינורות הזכוכית. אם הזבובים הולכים לאיבוד בקצוות אזור העניין, הגדל את הבהירות או הרווח של תוכנת המעקב. כעת, כשהמערכת מוכנה לחלוטין, התחל את פרוטוקול התמריצים.

רשום את מיקומי הזבובים בקצב של 20 פריימים לשנייה ורשום את מיקומי הקואורדינטות הללו בשילוב עם מצב שסתום הריח בקבצי טקסט. מכיוון שהניסוי רגיש מאוד לריחות, נדרש ניקוי קבוע כדי לנקות את צינורות הזכוכית, להשרות אותם בחומר ניקוי ולאחר מכן לשטוף אותם תחת מים מזוקקים זורמים. לאחר השטיפה יש לייבש את הצינורות תחת אוויר בלחץ ולאחר מכן לחמם אותם ל-200 מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות.

כדי לנקות תחילה את מערכת אספקת הריח, הסר את כל בקבוקוני הריח והצינורות מתא הערבוב המרכזי. לאחר מכן הסר את מתאמי הצינורות מתא הערבוב. נקה את תא הערבוב המרוקן על ידי שטיפתו עם ממס מתחת למכסה המנוע כמו הצינורות.

יבש את תא הערבוב באמצעות אוויר בלחץ וחמם אותו בחום של 200 מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות. כדי לנקות את בקבוקוני הריח והשסתומים, הסר את פקקי הפלדה, השלך את אטמי הגומי והסר את שסתומי הסימון, שסתומי בקרת הסבון והאתנול ורכיבים אחרים הן באתנול והן באצטון. לאחר מכן, סוניקציה של הרכיבים הספוגים למשך 30 דקות בהגדרה המקסימלית ושטוף אותם במים מזוקקים.

כמו קודם, השתמשו באוויר בלחץ לייבוש וחממו את הרכיבים ל-200 מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות. שטפו אותם באתנול כאשר אצטון בכיוון זרימת האוויר, מכיוון שאצטון תוקף חלקי גומי, יבש מיד כל שסתום סימון שטוף באוויר בלחץ כדי להסיר את כל הריחות הנותרים משסתומי הסימון השטופים. דופק אוויר דרכם במשך מספר ימים, הגדר אותם באינקובטור של 60 מעלות צלזיוס עם זרימת אוויר פועמת לסירוגין במרווחים של שנייה אחת.

15 נקבות זבובים מורעבות נחשפו לאתיל בוטיראט. הפס הצהוב מייצג את דופק הריח. הריבועים הכחולים מתארים תנועה נגד הרוח בתוך מסגרת זמן של 100 אלפיות השנייה.

בהתאמה ריבועים אדומים מתארים תנועה במורד הרוח. אותם זבובים הראו גם תנועה נגד הרוח בתגובה לגירוי עם איזופ פנטיל אצטט, אתיל אצטט או שניים שלושה בוטאן d בממוצע לאוכלוסייה. לתגובת הזבוב לאתיל אצטט הייתה התחלה חדה, משרעת גבוהה ומשך זמן קצר.

לעומת זאת, לתגובה לשני שלושה בוטאן דיון הייתה התחלה ממוצעת מאוחרת יותר, משרעת נמוכה יותר ומשך זמן ארוך יותר. בסופו של דבר, הנתונים מכל ריח נפתרו בדרך זו ולאחר מכן נותחו עוד יותר כדי להראות שכל ארבעת הריחות עוררו תזוזה גבוהה יותר בכיוון הרוח תוך ארבע שניות מאשר הממס. בנוסף, על ידי פתיחת בקבוקוני ריח, זבובים נחשפו באופן סינכרוני לכל התערובות האפשריות.

לאחר גירוי הזבובים עם ארבעת הריחות הבודדים, גירויים עם תערובות של ארבעת הריחות היו כולם אטרקטיביים לפחות כמו התרכובת הבודדת האטרקטיבית ביותר בתערובת. לאחר המאסטר, אתה יכול להריץ את הניסוי הזה תוך שעה, ואז הוא רץ במשך שמונה שעות וכבר 30 דקות לאחר מכן אתה יכול לדמיין את התוצאות הראשונות שלך. אז השיטה הזו באמת מאפשרת להשיג נתונים מזבובים רבים בזמן קצר עם רזולוציה זמנית גבוהה.

אבל היזהר. ניסוי זה דורש ניקוי נרחב בין הניסויים. אם המערכת שלכם עדיין מזוהמת בנמלים מהניסוי האחרון, אתם יכולים לשכוח מהתוצאות שלכם בהליכת הזבובים.

אתה יכול כמובן גם לבדוק זבובים מהונדסים גנטית על ידי כך שתוכל לחקור את ההשפעה של מעגלים עצביים בודדים או מפעל על ההתנהגות המודרכת OD. לאחר פיתוח הטכניקה החדשה הזו, היא סללה את הדרך עבורנו לעשות מחקר בתחום הזה, סיעת חרקים, כדי להבין את הקידוד של הריחות האלה במוח של החרק. וחשוב מכך, שימוש באותו סוג של גירוי להתנהגות בהליכת זבובים ולניסויים פיזיולוגיים פירושו שאנו יכולים באמת להשוות בין שתי פרדיגמות הניסוי השונות הללו.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבסס את הליכת הזבובים, ואתה אמור להיות מסוגל לבסס את הניסוי הזה בחיקך ולהתחיל ניסויים בתפוקה גבוהה משלך על חיבה לחרקים בקרוב. אבל אל תשכח, עבודה עם כלי זכוכית וכימיקלים יכולה להיות מסוכנת ביותר, לכן, תמיד ללבוש מעיל מעבדה. השתמש במשקפי מגן וכפפות.