הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת
December 12th, 2015
המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לפקח דינמיקת fluorescently- מתויג חלבון על משטחי תא צמח עם מיקרוסקופיה epifluorescence זווית משתנה, מראה מהבהב נקודות של PATROL1 מתויג GFP, חלבון סחר קרום, בקליפת התא של המתחם הפיוניות ב thaliana ארבידופסיס.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בתנועה של חלבונים מתויגים פלואורסצנטית על משטחי תאי הצמח עם מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי בזווית משתנה. כלי זה יכול לסייע לנו להתקדם בתחום הביולוגיה של תאי הצמח, כגון כיצד פועל חלבון על משטחי תאי צלחת. התצפית העיקרית של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת לנו לדמיין דינמיקה בזמן אמת של חלבוני התקפה פלואורסצנטיים לפני תחילת ההליך.
כיול מרכוז ומיקוד הלייזר של המיקרוסקופ בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן השתמש בנתיב אור חופשי מעדשת אובייקטיבית כדי לאתר את מרכז תקרת חדר המיקרוסקופיה ולסמן את המיקום בחותם צבעוני. לאחר מכן, האירו את התקרה בעדשת אובייקטיביות והזיזו את האזור המואר למצב המרכזי.
לאחר מכן מקד את הלייזר וכוונן את מיקום הלייזר למרכז התקרה. הריכוז והמיקוד של הלייזר חשובים מאוד להצלחה של מיקרוסקופ ריח אפי בזווית משתנה או תצפית VAEM. יש להכשיר את המשתמשים על ידי איש צוות מקצועי מחברת המיקרוסקופ לפני תחילת הניסוי.
כאשר המיקרוסקופ מוכן, הוצא 30 מיקרוליטר של מאגר בזאלי על מרכז מגלשת זכוכית בגודל 76 על 26 מילימטר. לאחר מכן השתמש במספריים מנתחים כדי להסיר עופרת משותפת משתיל בן שבעה ימים וצף את עופרת ה-co כשצד התצפית כלפי מעלה על טיפת החיץ הבסיסית. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר בזאלי למרכז של 18 על 18 מילימטר.
כסו את הזכוכית והפכו את זכוכית הכיסוי. מתח פנים בעדינות ימנע את נפילת הטיפה, תוך החזקת זכוכית הכיסוי בפינצטה בקצה אחד. הנח את הקצה הנגדי על מגלשת הזכוכית כך שהמאגר יהיה מעל המוביל המשותף.
לאחר מכן שמור את קצה זכוכית הכיסוי על המגלשה. כוונן את מיקום הטיפה כך שתהיה ישירות מעל דגימת האולאין והפיל את זכוכית הכיסוי. אם אין בועות אוויר, השתמש ברקמות נטולות מוך כדי לנגב את המאגר העודף ולהעביר מיד את התכשיר למיקרוסקופ.
באמצעות תאורת שדה בהיר, בחר את התאים לתצפית. לאחר מכן, אשר שניתן לצפות בחלבון הפלואורסצנטי והשתמש בתאורת אפי פלואורסצנטית כדי להגדיר את מיקום ציר Z על פני התא. כדי לבצע VAEM, השתמש בתיבת הבקר כדי להטות את זווית הכניסה של קרן הלייזר.
בהדרגה תוך ניטור קפדני של התמונה החיה. בתחילה, התמונה תיראה מטושטשת. ככל שזווית הלייזר גדלה, תמונת ה-VAEM תהפוך פחות מטושטשת, ובסופו של דבר תייצר תמונה ברורה.
בשלב זה, הפסק להגדיל את זווית הלייזר. עכשיו בסדר. כוונן את זווית כניסת הלייזר כדי לקבל תמונה טובה יותר, תוך התאמת הפרמטרים האופטיים וחיישן התמונה לפי הצורך.
לאחר מכן באמצעות תוכנת המיקרוסקופ המסחרית, רכוש סרט כקובץ תמונת TIFF מרובה עמודים. כאן הסרט מראה נקודות עם תווית GFP מהבהבות על פני תאי מודל STA. כדי לכמת את זמן השהייה של GFP המסומן ב-DOT באמצעות פיג'י, עבור לתפריט פתיחת הקובץ ופתח את קובץ הטיפים מרובה העמודים שנרכש.
השתמש בכלי בחירת הקו הישר כדי למקם קו בצד המבוקש. לאחר מכן, השתמש בתוסף הפרוסות הדינמיות של אוספי התמונות כדי ליצור תמונת תרשים. כאשר הקו משתנה, תמונת הגרף תשתנה באופן דינמי.
שמור את התמונה כקובץ TIFF מתחת לקובץ, שמור כתפריט tiff. לאחר מכן כדי לבצע הפחתת רעש, עבור לתפריט הטשטוש הגאוסי של מסנני התהליך, והחל מסנן גאוס על תמונות הכרונוגרף. יש לכוון את פרמטר רדיוס הסיגמא לפי הצורך.
בעזרת כלי הסף להתאמת תמונה, פלח את אזורי האות על ידי סף ופתח את תפריט מדידות ערכת הניתוח. לאחר מכן, בדוק את המלבן התוחם בחלון המידות שנקבעו, ובחר את מספר הפיקסלים המינימלי האפשרי. ואז תחת הניתוח, ניתוח תפריט חלקיקים.
מדוד את הזמן של נקודת העניין מול ציר Y וסמן את תוצאות התצוגה והוסף למנהל כדי להציג את ערכי הנתונים. לבסוף, תחת תפריט טבלת התוצאות, בחר קובץ, שמור בשם ועבד את מערך הנתונים של משכי תמונת הנקודות באמצעות תוכנת הניתוח המתאימה. כאן, זמני השהייה של 185 סיור GFP נקודה אחת מ-12 תאי משנה עצמאיים ב-edin השמיני כפי שנמדדו על ידי ניתוח גרף chm מוצגים כפי שמוצג בגרף.
פונקציית הצפיפות המותאמת גילתה שרוב הנקודות הבודדות של סיור ה-GFP שהו בתא משנה בין 2 ל-10 שניות עם שיא של כ-3.5 שניות. זה מצביע על אנדוציטוזיס אקסוציטוזיס מהיר של משאבות הפרוטונים על פני תא המשנה. לאחר העבודה על הסרטון הזה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין ולכמת דינמיקת חלבון מסוג ary על פני תא הצמח באמצעות מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי בזווית משתנה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
הפרוטוקול הזה מדגים את ניטור הדינמיקה של חלבון מסומן פלואורסצנטי על משטחי תאים צמחיים באמצעות מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית בזוויות משתנות. הטכניקה מאפשרת לדמיין נקודות מהבהבות של PATROL1 מסומן GFP, חלבון תעבורת ממברנה, בקליפת התא של המתחם הסטומטי ב-Arabidopsis thaliana.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תא צמחי
- טכניקות מיקרוסקופיה
- דינמיקה של חלבונים
רקע
- הבנת תנועת החלבונים על משטחי תאים צמחיים היא חיונית לביולוגיה של הצמחים.
- סימון פלואורסצנטי מאפשר תצפית בזמן אמת על דינמיקה של חלבונים.
- מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית בזוויות משתנות משפרת את יכולות ההדמיה.
- Arabidopsis thaliana משמשת כאורגניזם מודל למחקרי צמחים.
מטרת המחקר
- לצפות בדינמיקה של חלבוני תעבורת ממברנה.
- לשפר טכניקות לחקר התנהגות חלבונים על משטחי תאים.
- לתרום להבנת ביולוגיה של תא צמחי.
שיטות ששימשו
- כיול של מרכזת לייזר ופוקוס של המיקרוסקופ.
- שימוש בנתיב אור חופשי של עדשת האובייקטיב להגדרה ראשונית.
- הארת תקרת חדר המיקרוסקופיה לאתר את המרכז.
- הדמיה בזמן אמת של חלבונים מסומני GFP בתאי צמחים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של דינמיקה של PATROL1 מסומן GFP.
- הדגמה של יעילות הטכניקה בהדמיה בזמן אמת.
- תובנות לגבי תהליכי תעבורת ממברנה בתאי צמחים.
- הקמת פרוטוקול למחקרים עתידיים בביולוגיה של תא צמחי.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לחקר דינמיקה של חלבונים.
- מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית בזוויות משתנות היא כלי חשוב בביולוגיה של הצמחים.
- הממצאים תורמים להבנה הרחבה יותר של תעבורת ממברנה.
שאלות נפוצות
Chapters in this video
0:05
Title
0:35
Cotyledon specimen Sky Drop Mounting
2:35
Variable-angle Epifluorescence Microscopy (VAEM) Observation and Movie Acquisition
3:42
GFP-labeled Dot Residence Time Quantification by Kymograph Analysis
5:19
Results: Representative GFP-PATROL1 Dot Residence Time Analysis by Kymography
6:02
Conclusion
