הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת
12 בדצמבר 2015
המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לפקח דינמיקת fluorescently- מתויג חלבון על משטחי תא צמח עם מיקרוסקופיה epifluorescence זווית משתנה, מראה מהבהב נקודות של PATROL1 מתויג GFP, חלבון סחר קרום, בקליפת התא של המתחם הפיוניות ב thaliana ארבידופסיס.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לתצפת על תנועתם של חלבונים המסומנים פלואורסצנטית על פני תאי צמחים באמצעות מיקרוסקופיית epi-fluorescence בעלת זווית משתנה. כלי זה יכול לסייע לנו להתקדם בתחום הביולוגיה של תאי צמחים, כגון הבנת האופן שבו חלבונים פועלים על פני תאי צמחים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו להדמיות של דינמיקה בזמן אמת של חלבונים המסומנים פלואורסצנטית לפני תחילת הפרוצדורה.
כייל את מרכוז הלייזר והמיקוד של המיקרוסקופ בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, השתמש בנתיב אור חופשי של עדשת אובייקטיב כדי לאתר את מרכז תקרת חדר המיקרוסקופ וסמן את המיקום באמצעות מדבקה צבעונית. לאחר מכן, האר את התקרה באמצעות עדשת אובייקטיב והזז את האזור המואר אל מיקום המרכז.
לאחר מכן, התמקדו בלייזר וכוונו בדייקנות את מיקום הלייזר למרכז התקרה. למרכוז ולמיקוד של הלייזר חשיבות רבה להצלחת התצפית במיקרוסקופ epi scent בעל זווית משתנה (VAEM). על המשתמשים לעבור הדרכה על ידי איש מקצוע מטעם חברת המיקרוסקופים לפני תחילת הניסוי.
כאשר המיקרוסקופ מוכן, טפטפו 30 µL של basal buffer למרכז של תבנית זכוכית בגודל 76 על 26 מ"מ. לאחר מכן, השתמשו במספרי דיסקציה כדי להסיר co leadin מנבט בן שבעה ימים והניחו את ה-co leadin לצוף על טיפת ה-basal buffer כאשר צד התצפית פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הוסיפו 30 µL של basal buffer למרכז של תבנית בגודל 18 על 18 מ"מ.
הניחו זכוכית כיסוי והפכו אותה למצב הפוך. תוך כדי החזקת זכוכית הכיסוי עם פינצטה מקצה אחד, מתח פנים עדין ימנע מהטיפה לנfalling. הניחו את הקצה הנגדי על גבי השקופית כך שהבופר יכסה את ה-co lead-in.
לאחר מכן, תוך השארת קצה זכוכית הכיסוי על גבי הפסלייד, כווננו את מיקום הטיפה כך שתהיה ישירות מעל דגימת ה-olein והנחנו את זכוכית הכיסוי. במידה ואין בועות אוויר, השתמשו בנייר סופג נטול סיבים כדי לנגב את עודפי הבופר והעבירו מיד את הדגימה למיקרוסקופ.
באמצעות תאורה בשדה בהיר (brightfield), בחרו את התאים לצפייה. לאחר מכן, ודאו שניתן להבחין בחלבון הפלואורסצנטי והשתמשו בתאורת פלואורסצנציה אפיפלאורסצנטית (epi fluorescence) כדי לקבוע את מיקום ציר Z על פני השטח של התא. לביצוע VAEM, השתמשו בתיבת הבקרה כדי להטות את זווית הכניסה של קרן הלייזר.
באופן הדרגתי תוך כדי ניטור קפדני של התמונה בשידור חי. בתחילה, התמונה תיראה מטושטשת. ככל שזווית הלייזר תעלה, תמונת ה-VAEM תהפוך לפחות מטושטשת, עד להפקת תמונה ברורה.
בשלב זה, הפסיקו להגדיל את זווית הלייזר. כעת בצעו כיוונון עדין של זווית כניסת הלייזר כדי להשיג תמונה טובה יותר, תוך התאמת הפרמטרים האופטיים ופרמטרי חיישן התמונה לפי הצורך.
לאחר מכן, באמצעות תוכנת המיקרוסקופ המסחרית, רכשו סרטון כקובץ תמונה TIFF רב-עמודים. כאן הסרטון מראה נקודות מסומנות ב-GFP המהבהבות על פני השטח של תאי מודל STA. כדי לכמת את זמן השהייה של נקודות המסומנות ב-GFP באמצעות Fiji, עברו לתפריט פתיחת קבצים ופתחו את קובץ ה-TIFF הרב-עמודי שנרכש.
השתמש בכלי בחירת הקו הישר כדי להציב קו בצד הרלוונטי. לאחר מכן, השתמש בתוסף dynamic res slice של image stacks כדי להפיק תמונת גרף. ככל שהקו ישתנה, תמונת הגרף תשתנה באופן דינמי.
שמרו את התמונה כקובץ TIFF תחת התפריט "file, save as tiff". לאחר מכן, כדי לבצע הפחתת רעשים, עברו לתפריט "process filters Gaussian blur", והחילו מסנן גאוסיאני על תמונות הכרונוגרף. יש לכוונן את פרמטר רדיוס הסיגמא (sigma radius) לפי הצורך.
באמצעות כלי התאמת הסף של התמונה (image adjust threshold), פלחו את אזורי האות על ידי קביעת סף ופתחו את תפריט הגדרת המדידות (analyze set measurements). לאחר מכן, סמנו את המלבן החוסם (bounding rectangle) בחלון הגדרת המדידות, ובחרו במספר המינימלי של פיקסלים שניתן. לאחר מכן, עברו לתפריט ניתוח חלקיקים (analyze, analyze particles).
מדוד את הזמן של הנקודה הרלוונטית מול ציר ה-Y, בדוק את התוצאות המוצגות והוסף אותן לתיבות הניהול כדי לצפות בערכי הנתונים. לבסוף, בתפריט טבלת התוצאות, בחר ב"קובץ" (file), "שמור בשם" (save as) ועבד את מערך הנתונים של משכי הזמן של תמונות הנקודות באמצעות תוכנת הניתוח המתאימה. כאן, זמני השהייה של 185 נקודות GFP patrol one מ-12 תאי בת 12 עצמאיים ב-edin שמיני, כפי שנמדדו באמצעות ניתוח גרפי של chm, מוצגים כפי שמוצג בגרף.
פונקציית הצפיפות המתואמת גילתה שמרבית הנקודות של GFP patrol one שהו בתא עזר למשך שבין 2 ל-10 שניות, עם שיא של כ-3.5 שניות. הדבר מרמז על אקזוציטוזה ואנדוציטוזה מהירות של משאבות הפרוטונים על פני השטח של תא העזר. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להציג ולכמת דינמיקה של חלבונים מסוג ary על פני השטח של תאי צמחים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית בזווית משתנה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את הניטור של דינמיקה של חלבונים המסומנים בתווית פלואורסצנטית על פני שטח של תאי צמח באמצעות מיקרוסקופיית אפי-פלואורסצנציה בזוויות משתנות. הטכניקה מאפשרת ויזואליזציה של נקודות מהבהבות של PATROL1 המסומן ב-GFP, חלבון המעורב בתעבורה ממברנלית, בקורטקס התאי של קומפלקס הפתחים ב-Arabidopsis thaliana.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של תאי צמחים
- טכניקות מיקרוסקופיה
- דינמיקה של חלבונים
רקע
- הבנת תנועת חלבונים על פני שטחי תאי צמחים היא חיונית עבור הביולוגיה של הצמחים.
- סימון פלואורסצנטי מאפשר תצפית בזמן אמת על דינמיקה של חלבונים.
- מיקרוסקופיית אפיפלואורסצנציה בעגונית משתנה משפרת את יכולות הוויזואליזציה.
- *Arabidopsis thaliana* משמשת כאורגניזם מודל למחקרים בצמחים.
מטרת המחקר
- להבחין בדינמיקה של חלבונים המעבירים ממברנות.
- לשפר טכניקות לחקר התנהגות חלבונים על פני השטח של תאים.
- לתרום להבנת הביולוגיה של תאי צמחים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- כיול של מרכוז הלייזר ומיקוד של המיקרוסקופ.
- שימוש בנתיב אור ללא עדשת אובייקטיב לצורך הגדרה ראשונית.
- הארה של תקרת חדר המיקרוסקופ לאיתור המרכז.
- דימות בזמן אמת של חלבונים המסומנים ב-GFP בתאי צמחים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של דינמיקת PATROL1 המסומן ב-GFP.
- הדגמה של יעילות הטכניקה בדימות בזמן אמת.
- תובנות לגבי תהליכי תעבורת ממברנות בתאי צמחים.
- ביסוס פרוטוקול למחקרים עתידיים בביולוגיה של תאי צמחים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר דינמיקת חלבונים.
- מיקרוסקופיית אפי-פלואורסנציה בזווית משתנה היא כלי בעל ערך בביולוגיה של צמחים.
- הממצאים תורמים להבנה רחבה יותר של תעבורת ממברנות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך זה
מיקרוסקופיית אפי-פלואורסצנציה בעלת זווית משתנה (VAEM) מאפשרת דימוי ברזולוציה גבוהה ובזמן אמת של דינמיקת חלבונים על פני השטח של תאי צמח, ומספקת תובנות קריטיות לגבי תעבורת ממברנות וארגון מחדש של השלד התאי. יכולת זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים, במיוחד להבנת מיקום ותעבורה של חלבונים הרלוונטיים לביוטכנולוגיה של צמחים ולביולוגיה סינתטית. שילוב של נתונים כמותיים המופקים מ-VAEM מחזק את תיקוף המטרה ומסייע בקבלת החלטות במחקר תרגומי לאורך תיקי מוצרי מו"פ.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של תעבורת חלבונים ומיקומם על פני השטח של התא.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של חלבוני מועמדות המעורבים בדינמיקה של ממברנות.
- מספק נתוני זמן שהייה כמותיים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטית.
- מאפשר בדיקת השערות בנוגע לתפקוד חלבונים באיתות תאי.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מבסס תהליכי עבודה מאושרים של דימות לכימות דינמיקה של חלבונים בתאים חיים.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור ומתאימות לניתוח השוואתי.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך סריקה עוקבת של מודולטורים המשפיעים על תעבורה ממברנלית.
- מאפשר גישות של דימות בעל תוכן גבוה (high-content imaging) לצורך הערכת תרכובות במערכות צמחים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מבצע התאמה בין נתוני תעבורת חלבונים לבין מסלולים רלוונטיים למחלה או למענה למעקה במודלים של צמחים.
- מספק רצף מהגילוי המולקולרי ועד לאפיון פנוטיפי בצמחים מהונדסים.
- מספק בסיס לקבלת החלטות מושכלת לגבי קידום מותאם-סיכון של מבנים של ביולוגיה סינתטית או אסטרטגיות להנדסת תכונות.
- תומך בזיהוי ביומרקרים תרגומיים באמצעות פלטי דימות כמותיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
דימות VAEM ממוקם בממשק שבין הגילוי המוקדם לפיתוח בדיקות (assays), ובכך הוא מאפשר חקירה מונחית-השערה של דינמיקת חלבונים ותומך בניתוחים כמותיים לצורך מחקר תרגומי בהמשך התהליך.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות בזמן אמת והבהרת מסלולים עבור חלבונים הקשורים לממברנה.
- סריקה: מספקת תוצרי דימוג כמותיים הניתנים לשחזור לצורך מוכנות של בדיקות ומחקרים השוואתיים.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני זמן שהייה ולוקליזציה דינמית לתמיכה בניתוח סטטיסטי ובקבלת החלטות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים מולקולריים לתוצאות פנוטיפיות במערכות צמחים מהונדסות או כאלה המגיבות למעמדות (stress).
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימוג סטנדרטית הניתנת להתאמה למגוון מודלים של צמחים ומטרות חלבוניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תעתוע חלבונים.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים וניתנים להרחבה לאימוץ בין צוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך התקדמות (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף של מטרות ומבנים לקידום, תוך התחשבות בסיכונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת ובניתוח כמותי של תמונות.
- דורש גישה למכשור VAEM מכויל ולתוכנת דימות תואמת.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת הדגימות וניתוח הנתונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מיני צמחים שונים או מטרות חלבוניות שונות.
- איכות התמונה והדיוק הכמותי תלויים בכיול מדויק של הלייזר ובטיפול נכון בדגימה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:35
Cotyledon specimen Sky Drop Mounting
2:35
Variable-angle Epifluorescence Microscopy (VAEM) Observation and Movie Acquisition
3:42
GFP-labeled Dot Residence Time Quantification by Kymograph Analysis
5:19
Results: Representative GFP-PATROL1 Dot Residence Time Analysis by Kymography
6:02
Conclusion
