מיקרופלואידיקה דיגיטלי עבור עיבוד אוטומטי proteomic

פרוטאומיקה קלינית היא דיסציפלינה חדשה וחשובה המבטיחה גילוי של סמנים ביולוגיים שיהיו שימושיים לאבחון מוקדם ופרוגנוזה של מחלות. כאן אנו מדווחים על מיקרופלואידיקה דיגיטלית חדשה או שיטת DMF המשלבת מספר שלבי עיבוד המשמשים בפרוטאומיקה קלינית, כולל מיצוי חלבון, הפחתת מסיסות מחדש, אלקילציה ועיכול אנזימטי. DMF משתמש במיקרו טיפות נפרדות של חלבוני דגימה על מערך אלקטרודות וניתן להפעיל אותו בטמפרטורת החדר, מה שמאפשר ניתוח אוטומטי מקביל של דגימות.

מתודולוגיה זו מייצגת התקדמות משמעותית לעומת שיטות קונבנציונליות ויש לה פוטנציאל להיות כלי חדש ושימושי בפרוטאומיקה קלינית. היי, אני סטיב שה מפרופסור המעבדה ארין וילר במחלקה לכימיה ובמכון לביו-חומרים והנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת טורונטו. היי, אני גבריאל ממעבדת וילר באוניברסיטת טורונטו.

ואני ויויאן לוק, גם היא ממעבדת Wearer באוניברסיטת טורונטו. אני ארין ווילר. אני בר מזל לעבוד עם סטיב מייס וויויאן.

היום נראה לכם הליך לעיבוד פרוטאומי באמצעות מיקרופלואידיקה דיגיטלית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור חלבונים ודגימות ביולוגיות. אז בואו נתחיל.

התחל את ההליך במכסה האדים על ידי ניקוי מצעי הזכוכית בתמיסת פיראנה. תוך לבישת הגנה נאותה, תמיסת הפיראנה מורכבת מחומצה גופרתית מרוכזת של שלושה לאחד עד 30% מי חמצן. לכן יש לנקוט בזהירות בזמן העבודה איתו.

דגרו את מצעי הזכוכית בפיראנה למשך 10 דקות ולאחר הניקוי יש לשטוף אותם ולהסיר יונים או מים ולייבש את המצעים בגז חנקן. הנח את המצעים בתוך תא האידוי של קרן האלקטרונים לתצהיר כרום לעובי של 250 ננומטר. הסר מצעים מהתא לאחר השגת עובי זה ושטוף באיזופרופנול, ואז יבש על פלטה חמה למשך חמש דקות בחום של 115 מעלות צלזיוס.

יש להניח את המצעים המיובשים עם הקס מתיל קסילזין או HMDS על ידי ציפוי ספין תוך 30 שניות. קוד סיבוב של 3000 סל"ד שוב עם צילום Shipley S 1811. התנגד באמצעות פרמטרים זהים.

אופים מראש את המצע ישירות על צלחת חמה בחום של 100 מעלות צלזיוס דקות. לאחר מכן עצב את התנגדות הצילום על ידי חשיפה לקרינה אולטרה סגולה או UV למשך חמש שניות באמצעות מסכת צילום. לאחר מכן, פתח את המצעים החשופים ל-UV במפתח Shipley MF 3 21 מספיק כדי להטביע את המצע למשך שלוש דקות לאחר מכן.

שוטפים את המצע בעמדת מים DI. אופים ישירות על פלטה חמה בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך דקה. חרטו את הכרום החשוף על ידי טבילת המצעים למשך 30 שניות בתחריט כרום מספיק כדי לכסות אותם לחלוטין.

שוטפים את המצעים במי DI וטובלים בחשפנית Z 300 T מספיק כדי להטביע את המצע למשך 10 דקות. כדי להסיר את הפוטו-התנגדות שנותרה. שוטפים במי DI ומייבשים בגז חנקן.

בעקבות משקע זה, שניים עד חמישה מיקרומטר פרלין C.פולימר מבודד על המצע על ידי שקיעת אדים כימית מפקידים 50 ננומטר של טפלון AF כדי להפוך את פני השטח להידרופוביים על ידי ציפוי ספין לתמיסה. 1% משקל למשקל בעצב הצומח FC 40 ב-2000 סל"ד למשך 60 שניות. על המצע.

חזור על הפעולה עם תחמוצת פח אינדיום שלא עברה או מצע זכוכית ITO כדי ליצור את עמוד הצלחת העליונה. אופים את שני המצעים על פלטה חמה בחום של 160 מעלות צלזיוס. 10 דקות להגדרת המכשיר המיקרופלואידי הדיגיטלי.

הסר ציפויים פולימריים מרפידות המגע של מצע תחתון על ידי גירוד בעזרת אזמל. חבר את הרפידות החשופות של המצע התחתון עם מחברי 40 פינים המופעלים במחשב המריץ תצוגת מעבדה. אנו משתמשים בתיבת בקרה ביתית המכילה ממסרים עם אותות הנשלטים על ידי dpad.

תיבת הבקרה של המחשב מאפשרת למשתמש שליטה על יישום של אותות RMS של 100 וולט לכל אותות של 18 קילו-הרץ להתקן באמצעות מחברי 40 פינים. הפעל גם מחולל פונקציות ומגבר. הרכיבו את המכשיר על ידי הצבת שתי חתיכות של סרט דו צדדי בעובי כולל של 140 מיקרומטר בשולי המצע התחתון.

הכניסו ארבעה מיקרוליטרים של מי DI לאחד המאגרים וסגרו את המכשיר על ידי מיקום מגלשת תחמוצת פח האינדיום הלא מעוצבת על גבי המכשיר כשהצד המצופה טפלון פונה כלפי מטה. חבר מחבר הארקה להפעלת הצלחת העליונה. המעבדה יצרה תוכנית אתחול בתצוגת מעבדה כדי לכייל את בקרת המשוב המכשיר מוכן כעת לניסויים.

בפרוטוקול זה, נשתמש באלבומין בסרום בקר או BSA כדגימת חלבון כדי להדגים את העיצוב והשימוש במיקרופלואידיקה הדיגיטלית שלנו. BSA מדולל במאגר עבודה או WB העשוי מ-100 מילי-מולרי tris HCL pH 7.8 עם 0.08% אוניק F1 27 משקל לנפח. הכן מיליליטר אחד מכל דגימה ותמיסת ריאגנט וציין את המאגר שאליו הוא יתווסף.

לאחר הכנת המגיב הסר את הצלחת העליונה מהמכשיר והכניס ארבעה מיקרוליטר תמיסה למאגר שהוקצה לו. לאחר מילוי המאגרים, החזר את הצלחת העליונה למכשיר. השתמש בתוכנית תצוגת המעבדה הפנימית כדי לבצע את השלבים הבאים.

זכרו, ממשק המחשב מאפשר למשתמש להוציא כ-600 טיפות ננו-ליטר ממאגרים ולתפעל את הטיפות על מערך האלקטרודות. ראשית, יש להוציא טיפת חלבון המכילה דגימה מ-R 1 וטיפה של משקעים מ-R 2. מיזגו את שתי הטיפות ואפשרו לטיפה המשולבת לדגור במשך חמש דקות כך שחלבונים ישקעו על פני השטח.

הפעל את הסופרנטנט הרחק מהחלבון המשקע למאגר הפסולת. R שלוש, כדי לשטוף את החלבון המשקע, יש להוציא שלוש טיפות של מאגר שטיפה מ-R ארבע ולהניע אותן על פני החלבון המשקע ולתוך מאגר הפסולת. הניחו למשקעים להתייבש והוציאו טיפה של מאגר מסיס מחדש מ-R 5 על החלבון.

הניחו למאגר לדגור במשך 20 דקות עד שהמשקעים נמסים. לאחר מכן, הוציאו טיפה של חומר הפחתה מ-R 6 ומזגו אותה עם טיפת הדגימה. מערבבים את הטיפה המשולבת על ידי הפעלתה על פני שש אלקטרודות בתבנית מעגלית.

הניחו לטיפה לדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר. מוציאים טיפה של חומר אלקילציה מ-R 7 וממזגים אותה עם טיפת הדגימה, ואחריה ערבוב. הניחו לטיפה לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור.

לבסוף, הוציאו טיפה של טריפסין מ-R 8 ומזגו אותה עם טיפת הדגימה, ואחריה ערבוב. הניחו לטיפה לדגור במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בצלחת פטרי על צלחת חמה. כדי לסיים את התגובה, הסר את הצלחת העליונה והרוה את העיכול על ידי פיפטינג.

הצביעו על שישה מיליליטר של 2.5% חומצה טריכלורואצטית במים על טיפת התגובה. טהר את תוצר התגובה המרווה על ידי שאיבת טיפת הדגימה ישירות מהצלחת התחתונה. באמצעות קצה רוכסן C 18, על פי הוראות היצרן, ניתן כעת לדלל דגימות לפי הצורך ולהעריך אותן על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לזהות את החלבונים בדגימה באמצעות מערכת זו.

אחריהם זוהו חלבוני מפרט מסה עם ציוני הסתברות של פחות מפי אחד E לשלושת השליליים, שווה ערך לרווח בר-סמך של 99.9% וכיסויי רצף של לפחות 30% לפיכך, DMF היא מתודולוגיה שימושית מאוד לעיבוד אוטומטי של דגימות פרוטאומיות. אז רק היום הראינו כיצד אנו משתמשים במיקרופלואידיקה דיגיטלית כדי לחלץ ולעבד חלבונים בצורה אוטומטית. מתודולוגיה זו מספקת פתרון פוטנציאלי לאובדן דגימה וזיהום במהלך בידוד וזיהוי חלבונים.

אנו מקווים ליישם שיטה זו בעתיד ביישומים ביולוגיים אחרים, כולל בדיקות אימונולוגיות ובדיקות מבוססות תאים. כאשר עושים ניסוי מסוג זה, הדבר החשוב ביותר הוא לזכור ליהנות ממנו. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.