מיקרופלואידיקה דיגיטלי עבור עיבוד אוטומטי proteomic

פרוטאומיקה קלינית היא דיסציפלינה חדשה וחשובה המבטיחה גילוי של סמנים ביולוגיים שיהיו שימושיים לאבחון מוקדם ולפרוגנוזה של מחלות. כאן אנו מדווחים על שיטה חדשה של מיקרופלואידיקה דיגיטלית (DMF), המשלבת מספר שלבי עיבוד המשמשים בפרוטאומיקה קלינית, כולל מיצוי חלבונים, המסה מחדש, רדוקציה, אלקילציה ועיכול אנזימטי. DMF משתמשת בטיפות מיקרוסקופיות בודדות של חלבוני דגימה על מערך של אלקטרודות ויכולה לפעול בטמפרטורת החדר, מה שמאפשר ניתוח אוטומטי ומקבילי של דגימות.

מתודולוגיה זו מהווה התקדמות משמעותית לעומת שיטות קונבנציונליות ויש לה פוטנציאל להוות כלי חדש ומועיל בפרוטאומיקה קלינית. שלום, אני סטיב שיי מהמעבדה של פרופסור ארין וילר במחלקה לכימיה ובמכון לביומטריאלים והנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת טורונטו. שלום, אני גבריאל ממעבדת וילר באוניברסיטת טורונטו.

ואני ויביאן לוק, גם אני ממעבדת וורר באוניברסיטת טורונטו. אני ארין וילר. אני בת מזל לעבוד עם סטיב מייס וויביאן.

היום נדגים לכם הליך לעיבוד פרוטאומי באמצעות מיקרופלואידיקה דיגיטלית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור חלבונים ודגימות ביולוגיות. אז בואו נתחיל.

התחילו את הפרוצדורה במכסה שאיבה (fume hood) על ידי ניקוי תשבתי הזכוכית בתמיסת פירנה (Piranha solution). בעודכם לובשים מיגון הולם, יש לשים לב כי תמיסת פירנה מורכבת מחומצה גברית רכזת ביחס של שלושה לواحد עם מי חמצן בריכוז 30%, ולכן יש לנהוג בזהירות בעת העבודה איתה.

הדגרו את תשבורי הזכוכית בתמיסת piranha למשך 10 דקות, ולאחר הניקוי, שטפו אותם במים דה-יוניים (deionized water) וייבשו את התשבורים באמצעות גז חנקן. הניחו את התשבורים בתוך תא אידוי באלומה אלקטרונית (electron beam evaporation) להשקעת כרום עד לעובי של 250 nanometers. הוציאו את התשבורים מהתא ברגע שהושג עובי זה ושטפו אותם באיזופרופנול, ולאחר מכן ייבשו על פלטה חמה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 115 degrees Celsius.

בצעו טיפול מקדים (Priming) למצעים המיובשים באמצעות hexa methyl xylazine או HMDS בשיטת ציפוי סבב (spin coating) למשך 30 שניות. בצעו ציפוי סבב נוסף במהירות של 3000 RPM עם Shipley S 1811 photoresist תוך שימוש בפרמטרים זהים.

בצעו אפייה מוקדמת (Pre-bake) של התשתית ישירות על פלטה מחממת בטמפרטורה של 100 degrees Celsius למשך מספר דקות. לאחר מכן, צרו תבנית בפוטורזיסט (photo resist) באמצעות חשיפה לקרינת ultraviolet או UV למשך חמישה שניות דרך מסכת פוטו (photo mask). לאחר מכן, פתחו את התשביות שנחשפו ל-UV בתוך חומר פיתוח Shipley MF 3 21 בכמות מספיקה לטבילה מלאה של התשתית למשך שלוש דקות.

שטפו את התשתית במים מזוקקים (DI water) לאחר מכן. חממו ישירות על לוח חימום בטמפרטורה של 100 degree Celsius למשך דקה אחת. תערו את הכרום החשוף על ידי טבילת התשתיות למשך 30 שניות בכמות מספיקה של חומר תעריכה לכרום כדי לכסות אותן לחלוטין.

שטפו את התשתיות במים מזוקקים (DI water) ושקעו אותן ב-Z 300 T stripper בכמות המספיקה לכיסוי התשתית למשך 10 דקות, כדי להסיר את שאריות הפוטורזיסט. שטפו במים מזוקקים (DI water) וייבשו בגז חנקן.

בעקבות השכבה זו, השקיעו פולימר מבודד מסוג Paraline C בעובי של שני עד חמישה מיקרומטר על התשתית באמצעות שיקוע פחסי כימי. השקיעו 50 ננומטר של Teflon AF כדי להפוך את הפני השטח להידרופוביים על ידי ציפוי סבב (spin coating) של תמיסת 1% weight per weight ב-flora nerve FC 40 במהירות של 2000 RPM למשך 60 שניות על התשתית.

חזור על הפעולה עם מצע זכוכית אינדיום-בדיל-תחמוצת או ITO שאינו מצופה כדי ליצור את עמוד הפלטה העליונה. חמם את שני המצעים על פלטה מחממת בטמפרטורה של 160 °C למשך 10 דקות כדי להכין את המכשיר המיקרופלואידי הדיגיטלי.

הסר את ציפויי הפולימר ממגשרי המגע של מצע תחתון על ידי גירוד עם סקלפל. חבר את המגשרים החשופים של המצע התחתון למחברים בעלי 40 פינים והפעל מחשב המריץ את תוכנת LabVIEW. אנו משתמשים בתיבת בקרה שהורכבה במעבדה, המכילה ממסרים עם אותות הנשלטים על ידי dpad.

קופסת הבקרה הממוחשבת מאפשרת למשתמש לשלוט בהחלת אותות של 100 volts RMS בתדר של 18 kilohertz למכשיר באמצעות מחברי ה-40 פינים. כמו כן, הפעל גנרטור פונקציות ומגבר. הרכב את המכשיר על ידי הצמדת שני קטעי סרט דבק דו-צדדי בעובי כולל של 140 micrometer לקצוות של התשתית התחתונה.

טפטפו 4 µL של מים מזוקקים (DI water) לאחד מהמאגרים וסגרו את המכשיר על ידי הנחת שקופית indium tin oxide ללא תבנית מעל המכשיר, כאשר הצד המצופה בטפלונית פונה כלפי מטה. חברו מחבר הארקה למסילה של הלוחית העליונה. הפעילו את תוכנית האתחול שפותחה במעבדה ב-LabVIEW כדי לכלול את בקרת המשוב; המכשיר מוכן כעת לניסויים.

בפרוטוקול זה, נשתמש באלבומין מסרום בקר או BSA כדגימת חלבון כדי להדגים את התכנון והשימוש במערכת המיקרופלואידיקה הדיגיטלית שלנו. ה-BSA מדולל בבופר עבודה או WB המורכב מ-100 millimolar tris HCL pH 7.8 עם 0.08%onic F1 27 משקל לנפח. הכינו מיליליטר אחד מכל דגימה ומכל תמיסת ריאגנט, וסמנו את המאגר אליו הן יתווספו.

לאחר הכנת הריאגנטים, הסר את הלוחית העליונה מהמכשיר והעבר בעזרת פיפט 4 µL מהתמיסה אל המאגר המוקצב לה. לאחר מילוי המאגרים, החזר את הלוחית העליונה למקומה על המכשיר. השתמש בתוכנת ה-LabVIEW הפנימית של המעבדה כדי לבצע את השלבים הבאים.

זכרו, ממשק המחשב מאפשר למשתמש להעביר טיפות של כ-600 nanoliter ממאגרי נוזלים ולשלוט בטיפות על מערך האלקטרודות. ראשית, העבירו טיפה של דגימה המכילה חלבון מ-R one וטיפה של חומר משקיע מ-R two. מרגשו את שתי הטיפות והניחו לטיפה המשולבת להדגיר במשך חמש דקות כדי שהחלבונים ישקיעו על פני השטח.

העבירו את הנוזל העליון מהחלבון המשקוע אל מיכל הפסולת. כדי לשטוף את החלבון המשקוע, השתמשו ב-R שלוש, וטפטפו שלוש טיפות של תמיסת שטיפה מ-R ארבע, והעבירו אותן על פני החלבון המשקוע אל מיכל הפסולת. המתינו לייבוש המשקע וטפטפו טיפה אחת של תמיסת המסה מ-R חמש על החלבון.

יש להמתין 20 דקות להדגרה של התמיvVertex עד להמסת המשקע. לאחר מכן, יש להעביר טיפה של חומר מחזר מ-R six ולמזג אותה עם טיפת הדגימה. ערבבו את הטיפה המאוחדת על ידי העברתה מעל שש אלקטרודות בתבנית מעגלית.

המתינו שהטיפה תודגרה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. העבירו טיפה של חומר אלקיליציה מ-R שבעה ומזגו אותה לתוך טיפת הדגימה, ולאחר מכן ערבבו. המתינו שהטיפה תודגרה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, במיגון מאור.

לבסוף, העבירו טיפה של trypsin מ-R שמונה ומיזגו אותה עם טיפת הדגימה, ולאחר מכן ערבבו. הניחו לטיפה לדגור במשך שלוש שעות ב-37 degrees Celsius בתוך Petri dish על פלטה מחוממת. כדי להפסיק את התגובה, הסירו את הפלטה העליונה והשביתו את העיכול באמצעות פיפטינג.

טפטפו שש נקודות (0.6 מיליליטר) של חומצה טריכלורואצטית (trichloroacetic acid) בריכוז 2.5% במים אל טיפת התגובה. טהרו את תוצרי התגובה שעוכבו על ידי שאיבת טיפת הדגימה ישירות מהפלטה התחתונה. באמצעות C 18 zip tip, ובהתאם להוראות היצרן, ניתן כעת לדלל את הדגימות לפי הצורך ולהעריכן באמצעות ספקטרומטריית מסות כדי לזהות את החלבונים בדגימה באמצעות מערכת זו.

בסיום, בוצעה ספקטרומטריית מסות וזוהו חלבונים עם ציוני הסתברות של פחות מ-1×10⁻³, השקולים לרווח ברחב של 99.9% וכיסוי רצף של לפחות 30%. לפיכך, DMF היא מתודולוגיה יעילה מאוד לעיבוד אוטומטי של דגימות פרוטאומיות. היום הצגנו כיצד אנו משתמשים במיקרופלואידיקה דיגיטלית כדי למסח ולעבד חלבונים באופן אוטומטי. מתודולוגיה זו מספקת פתרון פוטנציאלי לאובדן דגימות ולזיהומים במהלך בידוד וזיהוי של חלבונים.

אנו מקווים ליישם שיטה זו בעתיד ביישומים ביולוגיים אחרים, כולל בדיקות אימונו-ספציפיות (immunoassays) ובדיקות מבוססות תאים. בעת ביצוע סוג זה של ניסוי, הדבר החשוב ביותר הוא לזכור ליהנות ממנו. וזהו זה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.