הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

המטרה הכוללת של פנוטיפ שמרים בעל תפוקה גבוהה זו היא לסנן חלבונים האוסרים זיכרון פנוטיפי מתמשך של ביטוי מועבר, כפרוקסי לתורשה מבוססת חלבון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום פריון השמרים, כגון, כמה חלבונים היא יכולה להוריש באופן בלתי חוקי מסוג זה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאתה יכול לסנן חלבונים ומסלולים רבים בצורה חסרת פניות.

התחל הליך זה על ידי גידול תאי השמרים המתאימים בצלחת של 96 בארות ב -30 מעלות צלזיוס, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בדוק חזותית את התרבויות כדי לאשר שהתרבויות רוויות, התאים צריכים להיות גלויים בעין, בתחתית כל באר. השתמש ברובוט לטיפול בנוזלים להכנת 384 צלחות באר, המכילות 45 מיקרוליטר מהמדיום המתאים לבאר.

ראשית, הוצא Scal-URA לבארות של צלחת באר 384. לאחר מכן מחלק Scal-URA בתוספת גורם הלחץ המעניין לבארות של צלחת שנייה, 20 מילימולר של מנגן כלוריד משמש כגורם הלחץ בניסוי זה. שלישית, חלק SD-URA, שלא יגרום לביטוי פלסמיד, בתוספת מנגן כלוריד לצלחת אחרת.

הורד את צלחת 96 הבארות המכילה את התרביות על הרובוט לטיפול בנוזלים וחסן מערך אחד עד ארבעה של מיקרוליטר אחד מכל באר של צלחת 96 הבארות, לארבע בארות נפרדות מכל צלחת באר 384 מלאה במדיה אחרת. הניחו מיד את הצלחות עם התאים על מערם מיקרופלייט בטמפרטורת החדר ופחמן דו חמצני אטמוספרי. הגדר את הפרוטוקול ללולאה רציפה של 72 שעות, המודדת את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר עם קורא המיקרו-פלטות.

לאחר מדידות הצמיחה, העבירו מיקרוליטר אחד לבאר של תרביות המושרות SCal-URA שחוו ביטוי יתר של חלבון ל-384 לוחות באר חדשים, המכילים 45 מיקרוליטר לבאר של מדיום ST-URA שאינו מאפשר ביטוי חלבון של הפלסמיד. במקביל, בצע חיסונים אנלוגיים של סט שני של 384 צלחת באר המכילה 45 מיקרוליטר לבאר ST-URA מהתרביות שגודלו ב-ST-URA בנוכחות גורם הלחץ. מניחים את הצלחות בתא לח ומגדלים את הצלחות למשך 48 שעות בחום של 30 מעלות צלזיוס לרוויה.

לאחר 48 שעות, השתמש בצלחות כדי לחסן מחדש מיקרוליטר אחד לבאר ב-384 צלחות באר המכילות 45 מיקרוליטר לבאר של ST-URA. לאחר מכן, בצע חיסון נפרד של מיקרוליטר אחד לבאר מאותה לוחית מקור לצלחת נפרדת של 384 בארות המכילה 45 מיקרוליטר לבאר ST-URA עם גורם הלחץ. הנח מיד את הלוחות עם תאים של המיקרו-מערם בטמפרטורת החדר ופחמן דו חמצני אטמוספרי והגדר את הפרוטוקול ללולאה רציפה של 48 שעות, המודדת את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר עם קורא מיקרו-פלטות.

לאחר השלמת מדידות הגידול, השתמש בתוכנת קורא הלוחות כדי לייצא את הזמן לעומת הצפיפות האופטית במדידות של 600 ננומטר כטבלת XY. עמודות קבוצתיות של מדידות הצפיפות האופטית עבור כל ביולוגי משכפלות יחד ומחשבות את הממוצע. צור תרשים XY של זמן לעומת צפיפות אופטית ב-600 ננומטר כדי ליצור עקומות צמיחה.

עבור תרביות שבחרו בהבדלי גדילה משמעותיים בתגובה לגורם לחץ נתון, התלויים בביטוי יתר של חלבון אבות, קחו מיקרוליטר אחד מכל שכפול ביולוגי, דללו ב-10 מיליליטר מים ולאחר מכן צלחו 50 מיקרוליטר על צלחות המכילות 5-FOA. גדל בחום של 30 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים. אם זה גורם ליותר מדי או מעט מדי מושבות לצלחת, התאם את גורם הדילול בהתאם.

100 עד 200 מושבות לצלחת הן אידיאליות. בחר שמונה עד 32 מושבות בודדות עם קיסמי חיטוי והצמד אותן ל-96 צלחות באר המכילות 150 מיקרוליטר SDCSM לבאר. מניחים את הצלחות בתא לח וגדלים לרוויה למשך 48 עד 72 שעות בחום של 30 מעלות צלזיוס.

השתמש בתרביות אלה כדי לחסן שתי קבוצות חדשות של צלחות 96 בארות המכילות 150 מיקרוליטר לבאר SDCSM, עם ובלי גורם הלחץ. הנח את הלוחות על מערם מיקרו-פלטות והגדר את הפרוטוקול למדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר בלולאה רציפה של 48 שעות. לאחר 48 שעות, נתח את הנתונים כפי שהוצגו קודם לכן ואשר כי הבדלי הצמיחה המשמעותיים שנראו קודם לכן, נשמרים לאחר אובדן פלסמיד.

התאים השומרים על הפנוטיפים המושרים נבדקים לאחר מכן עבור סימני היכר קלאסיים של תורשה מבוססת חלבון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מסך תורשה מבוסס חלבון זה חשף את ביטוי היתר החולף של מסגרת הקריאה הפתוחה PSP1, מניע עמידות למנגן כלוריד שנשמרה במשך מאות דורות בתאים, זמן רב לאחר הפסקת ביטוי היתר. אלגוריתמי חיזוי פריון דירגו את הקצה הסופי של PSP1 כדמוי פריון בינוני.

לעומת זאת, האלגוריתמים לא חזו כמעט שום תכונות רצף דמויות פריון משמעותיות מרוב החלבונים המעוררים ששוחזרו על המסך, כפי שמוצג בניתוח מייצג זה. מדידות גדילה של זנים ו-SDCSM עם מנגן כלוריד, מנורמלות לבקרת PSP1 מינוס נאיבית מקבילה, הצביעו על כך שעיכוב של HSP104 disaggregase אינו פוגע בעמידות למנגן כלוריד תלוי PSP1 בעוד שהסרת המלווה HSP70 והגן PSP1, מבטלת את הפנוטיפ הזה באופן תורשתי. כל הנבגים מטטרדות בודדות של הכלאות בין זנים, המכילים את המצב הפנוטיפי התלוי ב-PSP1 וזנים נאיביים, מציגים עמידות למנגן כלוריד, מה שמעיד על תורשה לא מנדלית של הפנוטיפ.

השוואה של הזיהום לטרנספורמציה של חלבון בין ליזטים מדומים ל-PSP1 המכיל ליזטים כחומר המועבר, הראתה כי למעלה מ-53% מהתאים הנאיביים שעברו טרנספורמציה עם PSP1 זרוע, קיבלו את הפנוטיפ המתאים לעמידות למנגן כלוריד. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שבועות, כולל שלבי דגירה והכנת רוב שלבי ההקרנה יכולה להיעשות תוך פחות משעתיים ביום, אפילו עם מספר רב של צלחות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתכנן בדיוק מה אתה רוצה לבדוק מראש ולזכור את היקף הניסוי.

עכשיו זה חשוב במיוחד למתחילים בטכניקה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלה המתוארות בפרוטוקול הטקסט כדי לקבוע אם הפנוטיפים שנצפו בהקרנה מציגים דפוס תורשה אמיתי דמוי פריון. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטיקה לחקור את רוחב הביולוגיה של פריון בשירות סקרליס CI.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעצב מסך תפוקה גבוהה לצורות חדשות של תורשה מבוססת חלבון בשמרים, הן בצורה בלתי משוחדת והן באופן ממוקד.

אל תשכח, שגורמי לחץ כימיים מסוימים כגון חומרים מזיקים ל-DNA יכולים להיות מסוכנים ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי, בעת ביצוע הליך זה.