Name: הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: חקור שיטת הקרנה תפוקה גבוהה לזיהוי חלבונים המעוררים זיכרון פנוטיפי מתמשך ב-Saccharomyces cerevisiae. הטכניקה מאפשרת סינון ללא הטיה של מסלולים ביולוגיים שונים ותורמת להבנת מנגנוני ירושה מבוססי חלבון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Sohini Chakrabortee סנדרה ג'ונס, דייוויד גרסיה, Bhupinder Bhullar, אמיליה צ'אנג, ריצ'רד היא, סוזן Lindquist לסיוע שלהם בפיתוח מבחני את הנייר הזה, כמו גם הבודקים המשמש את הערותיהם מתחשב.

<ol><li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%2C+protein+homeostasis%2C+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li>
<li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance%3A+the+significance+of+yeast+prions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).</li>
<li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable%2C+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li>
<li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li>
<li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+affect+the+appearance+of+other+prions%3A+the+story+of+%5BPIN%28%2B%29%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li>
<li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
<li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16793280">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li>
<li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li>
<li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li>
<li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766(2016).</li>
<li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).</li>
<li>Formosa, T., Nittis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressors+of+the+temperature+sensitivity+of+DNA+polymerase+alpha+mutations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).</li>
<li>Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteome+turnover+analyses+of+the+Yeasts+S.+cerevisiae+and+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe.</a> Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).</li>
<li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLAAC%3A+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Mendelian+determinant+%5BISP%2B%5D+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li>
<li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li>
<li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li>
<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

Prions הראשון שמרים זוהו על ידי שלהם יוצא דופן פנוטיפים ודפוסי מביך של ירושה. המאפיינים של אלה prions ואז שימשו לבניית אלגוריתמים, כלים חישוביים למסך חלבונים פריון נוספים. השיטה המתוארת כאן, לעומת זאת, נסיוני ומסתמך על ביטוי ארעית כדי ליצור מתמשך שינוי-a יציב מקודד המדינה קונפורמציה חלבון. עם זאת, אם היעילות של "זריעה" ההרכבות פריון על ידי ביטוי עבור כל חלבון נתון נמוך מאוד, את הפרוטאין ללא הרף יתגלה תוצאה שלילית שגויה במסכים ביטוי מסוג זה. אחד כגון השינוי כדי לתקן זאת תהיה לשימוש של פלסמיד 2-מיקרו-ביטוי חלבון בעתיד ניסו...

מערכות ביולוגיות חווים לעתים קרובות תנודות ארעי בשפע חלבון. בין אם אלה יש השפעה ממושכת בעיצוב של פנוטיפ של אורגניזם או של דורות העתיד עדיין לא ברור. המופעים הידועים ביותר של ביולוגיה זה לערב מחלקה נדיר של חלבונים, prions, אשר כונן את הופעתה של תכונות heritable ללא שינוי הגנום. במקום זאת, החלקיקים fectious pro, teinaceous וב -לשדר פנוטיפים באמצעות שינויים המנציחים את החלבון קונפורמציה1,2. סוג זה של ירושה התגלה כגורם של הדפוסים ירושה יוצא דופן של מחלה ניווניות הרסנית. עם זאת, מחקרים אורגניזמים ועד פטריות יונקים3,4,5,6,7,8,9,10 מאז גילו כי רכיבים דמויי פריון יכול להתייעץ ערך מסתגלת. למרות זאת, prions מתפרשת מרתקת אבל נדיר oddity ביולוגי.
זו חוכמה הרווחת מתקיים באופן חלקי בגלל האפיון של ירושה חלבון מבוססת זמן הוגבלה על ידי קבוצה קטנה של דוגמאות. מאמצי ההקרנה שיטתית ובמתמטיקה תמונה זו במידה ניכרת על-ידי זיהוי מספר bona אמן חדש prions11 וכמעט שני תריסר חלבון תחומים12 עם יכולת המרה הסתגלותי פריון כמו דלק. עם זאת, כי גישות אלה התמקדו בדרך כלל הטיות רצף חומצות אמיניות חזקה, prions זה התגלו לשתף את המאפיינים הביוכימי של המייסד שמרים prions [PSI+]13,14, [URE3]15,11,[RNQ+]16. אלה כוללים: 1) מודולרי תחומים שאינם עשירים מותח פולימריים זמן של אספרגין (N) וגלוטמין (Q) 2) הרכבה לתוך עמילואיד [פריון+] קונפורמציה17,18,19, ו- 3) להשלים את ההסתמכות על disaggregase Hsp104 פונקציה עבור הפצת נאמן מאמא ל בת13,20,21. ואכן, רבים בונה פיד ה prions, לרבות [גאר+], [הט-s], והוא אפילו את הפריון המקורי (PrPSc), יהיו חסרים תחת קריטריונים מחמירים כגון. אולי חשוב יותר, הם יהיו מסוגלים ללכוד את כל מנגנוני הרומן של ירושה מבוססי חלבונים22. לכן, מגוון ביולוגי אמיתי תופעות כאלה עשויים להיות הרבה יותר נפוץ בטבע מכפי ששוער.
כדי לחקור את השאלה הזו, הועסק אסטרטגיה תפוקה גבוהה, פרוטאום ברוחב. סימן היכר של כל prions, כולל PrPSc, [גאר+], והוא [הט-s], כי ביטוי ארעית של החלבונים סיבתי חזק מגביר את הקצב של פריון רכישה15,23,24,25,26. אנחנו ניצלו תכונה זו באופן שיטתי לשאול, על פני כולו שמרים ORFeome, אם הברית מבוסס-חלבון, epigenetic יציב יכול להיות ביוזמת transiently שייצור את ביטוי של חלבונים בודדים. ידוע שכי ביטוי חלבון יכול לשנות פנוטיפים27. עם זאת, פריון חלבונים הם יוצא דופן כי שלהם מתערובת זמנית מייצרת שינוי פנוטיפ זה heritable מאות רבות של דורות לאחר ביטוי ראשוני. בעבר לקחנו לנצל תכונה זו, כמו גם את דפוסי ירושה יוצא דופן של חלבון מבוססת מרכיבים גנטיים, לזהות עשרות חלבונים המסוגלים heritably חיווט מחדש נופים פנוטיפי מבלי לשנות את הגנום28. למרות כמה לזהות חלבונים היו בעבר המכונה prions, רובם היו לא, דבר המלמד את הכוח של גישה זו לחשוף את צורות חדשות של חלבון מבוססת ירושה.

<table><tbody><tr><td>גואנידין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>חתול #G3272-25G</td><td>כימי</td></tr><tr><td>מנגן כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>חתול#M8054-100G</td><td></td></tr><tr><td>כימי אתידיום ברומיד</td><td>סיגמא</td><td>E1510</td><td>כימי</td></tr><tr><td>5-חומצה פלואורורוטית</td><td>סיגמא</td><td>חתול#F5013-50 מ"ג</td><td>כימי</td></tr><tr><td>BY4741 MATa (his3&דלתא; 1 leu2&דלתא; 0 LYS2 met15&דלתא; 0 ura3&דלתא; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>זן שמרים</td></tr><tr><td>BY4741 MAT&alpha; (his3&דלתא; 1 leu2&דלתא; 0 lys2&דלתא; 0 MET15 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>זן שמרים</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&nbsp;</td><td>Jarosz et al., 2014b</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid FLEXGene library</td><td>Hu et al., 2007</td> N<td>/A</td><td>ספריית פלסמיד</td></tr><tr><td>דקסטרוז (גלוקוז)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D16-3</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>גלקטוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP656-500</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>CSM</td><td>זריחה מדע</td><td>1001-100</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>CSM-URA</td><td>Sunrise Science</td><td>1004-100</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>CSM-LYS</td><td>Sunrise Science</td><td>1032-100</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>CSM-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1019-100</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>CSM-LYS-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1035-100</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>פישר Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>פפטון</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>P20240-5000</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>בקטו-פפטון</td><td>BD</td><td>211677</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו</td><td>BD</td><td>291920</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>אגר</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49172</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>אדנין סולפט</td><td>סיגמא</td><td>A3159-25G</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>אשלגן אצטט</td><td>סיגמא</td><td>P1190-500G</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H8000-100G</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>לאוצין</td><td>סיגמא</td><td>L8000-25G</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>ליזין</td><td>סיגמא</td><td>L5501-25G</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0601</td><td>אנזים</td></tr><tr><td>ביוטיניל DNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1906</td><td>אנזים</td></tr><tr><td>זימוליאז 100T (אנזים ליטי שמרים)</td> <td>Sunrise Science</td><td>N0766555</td><td>קורא</td></tr><tr><td>מיקרו-פלטות</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>מערם Microplate</td><td>BioTek</td><td>BioStack3</td><td>צלחת ציוד</td></tr><tr><td> מילוי</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>רובוט לטיפול בנוזלים</td><td>בקמן קולטר</td><td>Biomek FX</td><td>ציוד</td></tr></tbody></table>

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

קידוד מידע ביולוגי שנגיש לדורות מושגת בדרך כלל באמצעות שינויים רצף הדנ א. ירושה מאריכים מקודד חלבון קונפורמציה (במקום רצף) שהוצג זמן הפרדיגמה-shifting אבל נדיר. הדוגמאות מאופיין בצורה הטובה ביותר של רכיבים כגון epigenetic נמצאים prions, אשר בעלי התנהגות וההספק עצמית שיכולים להביא ביטוי heritable של פנוטיפים חדש. Prions ארכיטיפי רבים להציג דעה קדומה רצף מרשים של N/Q-עשיר ולהרכיב לתוך קיפול עמילואיד. אלה מאפיינים יוצאי דופן יש הודיע רוב המאמצים ההקרנה כדי לזהות חלבונים חדשים פריון. עם זאת, לפחות שלושה prions ידוע (כולל את הפריון המייסדים, PrPSc) לא הנמל מאפיינים אלו הביוכימי. לכן פיתחנו שיטה חלופית כדי לחקור את היקף הירושה חלבון מבוססת בהתבסס על מאפיין של פעולה המונית: ביטוי ארעית של חלבונים פריון מגדיל את תדירות שבו הם רוכשים קונפורמציה של העצמי-תבניות. מאמר זה מתאר שיטה לניתוח הקיבולת של שמרים ORFeome להפיק חלבון מבוססת ירושה. באמצעות אסטרטגיה זו, מצאנו כי בעבר &gt; 1% של חלבונים שמרים יכול לתדלק את הופעתה של תכונות ביולוגיות היו מאריכים, יציב, וקם בתדירות גבוהה יותר מאשר מוטציה גנטית. יכול להיות מועסקים גישה זו תפוקה גבוהה על פני כל ORFeomes או פרדיגמה ההקרנה ממוקד עבור רשתות גנטיות ספציפיות או גירויים סביבתיים. בדיוק כמו מסכי גנטי קדימה להגדיר אינספור מסלולים התפתחותית, איתות, טכניקות אלה מספקים מתודולוגיה לחקור את ההשפעה של חלבון מבוססת ירושה תהליכים ביולוגיים.

ידוע כי ביטוי יתר של חלבונים משנה באופן דרמטי פנוטיפים תאיים27. ואכן, באמצעות גישת סריקה ראשונית, מאות פנוטיפים חדשים התקבלו באופן הדיר מהביטוי יתר של שיבולים מתוך ה-ORFeome של השמרים תוך שימוש בעשרה גורמי עקה בלבד. עם זאת, הבדיקות שתוארו לעיל מאפשרות להעריך האם תאים שומרים על פנוטיפים יציבים לטווח ארוך בעקבות ביטוי יתר זה. חלבון אחד המסוגל לקודד למצב כזה הוא Psp1. Psp1 הוא חלבון שפונקציונו אינו ידוע, אשר יכול לדכא מוטציות במנגנון השכפול (למשל, ב-pol alpha...

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

המטרה הכללית של פנוטיפויז השמרים בסביבה זו של תפוקה גבוהה היא לסרוק חלבונים המעוררים זיכרון פנוטיפי מתמשך של ביטוי בעבר, כמדד לירושה מבוססת חלבונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הפריונים בשמרים, כגון, כמה חלבונים מסוגלים לעורר ירושה מסוג זה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לסרוק חלבונים ומסלולים רבים באופן בלתי מוטה.התחל את הפרוצדורה על ידי גידול תאי שמרים מתאימים בלוחית 96 בארות בטמפרטורה של 30 degrees celsius, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. בצע בדיקה ויזואלית של התרביות כדי לוודא שהן רוויות; התאים צריכים להיות נראים לעין בתחתית כל בארה. השתמש ברובוט לטיפול בנוזלים כדי להכין לוחות של 384 בארות, המכילים 45 microliters של המצע המתאים לכל בארה.ראשית, יש לחלק Scal-URA לבארות של פלטת 384 בארות. לאחר מכן, יש לחלק Scal-URA בתוספת הגורם המעסיק הרלוונטי לבארות של פלטה שנייה; בניסוי זה נעשה שימוש ב-20 millimolar של manganese chloride כגורם המעסיק. שלישית, יש לחלק SD-URA, אשר לא יגרום לביטוי הפלסמיד, בתוספת manganese chloride לפלטה נוספת.הנח את פלטת 96 הבארים המכילה את התרביות על רובוט הטיפול בנוזלים, והזרק מערך של אחת עד ארבעה של 1 µL מכל באר בפלטת 96 הבארים, לארבעה בארים נפרדים בכל פלטת 384 בארים הממולאה במצע גידול שונה. מקם מיד את הפלטות עם התאים במערך ערימה של מיקרו-פלטות (microplate stacker) בטמפרטורת החדר ובריכוז פחמן דו-חמצני אטמוספירי. הגדר את הפרוטוקול ללולאה רציפה של 72 שעות, תוך מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.לאחר מדידות הצמיחה, העבירו מיקרוליטר אחד לכל באר מהתרביות שהושרתה על ידי SCal-URA וחוו ביטוי יתר של חלבון, לפלטות 384 בארות חדשות המכילות 45 מיקרוליטר לכל באר של מצע ST-URA שאינו מאפשר ביטוי חלבון של הפלסמיד. במקביל, בצעו הזרקות מקבילות לסדרה שנייה של פלטות 384 בארות המכילות 45 מיקרוליטר לכל באר של ST-URA מהתרביות שגדלו ב-ST-URA בנוכחות הגורם למעץ. הניחו את הפלטות בתא לח, וגדלו אותן במשך 48 שעות ב-30 degree celsius עד להגעה לרוויה.לאחר 48 שעות, השתמש בפלטות כדי להחדיר מחדש 1 µL לכל באר לפלטות של 384 באער המכילות 45 µL לכל באר של ST-URA. לאחר מכן, בצע החדרה חוזרת נפרדת של 1 µL לכל באר מאותה פלטת מקור לפלטת 384 באער נפרדת המכילה 45 µL לכל באר של ST-URA עם הגורם למעקה (stressor). מקם מיד את הפלטות עם התאים במיקרוסטאקר (microstacker) בטמפרטורת החדר ובריכוז פחמן דו-חמצני אטמוספרי, והגדר את הפרוטוקול ללולאה רציפה של 48 שעות, תוך מדידת הצפיפות האופטית ב-600 nm באמצעות קורא פלטות מיקרו (microplate reader).עם השלמת מדידות הגדילה, השתמש בתוכנת קורא הלוחיות כדי לייצא את מדידות הצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר כפונקציה של זמן לתוך טבלת XY. קבץ יחד את העמודות של מדידות הצפיפות האופטית עבור כל שכפול ביולוגי וחשב את הממוצע. צור גרף XY של זמן מול צפיפות אופטית ב-600 ננומטר כדי להפיק עקומות גדילה.עבור תרביות שהראו הבדלי גדילה משמעותיים בתגובה לגורם עקה נתון, בהתאם לביטוי-יתר של חלבון אב, קחו מיקרוליטר אחד מכל שכפול ביולוגי, דללו ב-10 מיליליטר מים ולאחר מכן פזרו 50 מיקרוליטר על צלחות המכילות 5-FOA. גדלו בטמפרטורה של 30 degree celsius למשך שלושה ימים. אם התוצאה היא מספר רב מדי או מעט מדי של מושבות לצלחת, התאימו את מקדם הדילול בהתאם.100 עד 200 מושבות לצלחת הן אידיאליות. בחר שמונה עד 32 מושבות בודדות באמצעות קיסמי אוטוקלאב והעבר אותן ללוחות 96 בארות המכילים 150 µL של SDCSM לכל בארה. הנח את הלוחות בתא לח וגדל עד לרוויה במשך 48 עד 72 שעות ב-30 °C.השתמשו בתרבויות אלו כדי להחדיר שני סטים חדשים של פלטות 96 בארות המכילות 150 µL של SDCSM לכל בארה, אחת עם הגורם למעקה ואחת בלעדיו. הניחו את הפלטות על מחסן פלטות (microplate stacker) והגדירו את הפרוטוקול למדידת הצפיפות האופטית ב-600 nm בלולאה רציפה למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, נתחו את הנתונים כפי שהודגם קודם לכן, ואשרו כי הבדלי הצמיחה המשמעותיים שנצפו קודם לכן נשמרים לאחר אובדן הפלסמיד.התאים השומרים על הפנוטיפים המושרים נבדקים לאחר מכן לסממנים קלאסיים של הורשה מבוססת חלבון, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. סריקה זו של הורשה מבוססת חלבון חשפה כי ביטוי יתר זמני של מסגרת הקריאה הפתוחה של PSP1 גורם לעמידות למנגנז כלוריד שנשמרה במשך מאות דורות בתאים, זמן רב לאחר שביטוי היתר פסק. אלגוריתמים לחיזוי פריונים דירגו את הקצה הסופי של PSP1 כבעל מאפיינים דמויי פריון במידה בינונית.לעומת זאת, האלגוריתמים לא חזו כמעט שום מאפיינים משמעותיים של רצפים דמויי פריון ברוב החלבונים המשרה שהופקו בסריקה, כפי שמוצג בניתוח מייצג זה. מדידות גדילה של זנים ו-SDCSM עם מנגנז כלוריד, שנורמלו למש controllo שלילי תואם של PSP1 נאיבי, הצביעו על כך שעיכוב של הדיסאגרגז HSP104 אינו פוגע בעמידות למנגנז כלוריד התלויה ב-PSP1, בעוד שהסרת השפרוני HSP70 והגן PSP1 מבטלת פנוטיפ זה באופן תורשתי. כל הנבגים מטטראדות בודדות של הכלאות בין זנים הנושאים את המצב הפנוטיפי התלוי ב-PSP1 לבין זנים נאיביים, מראים עמידות למנגנז כלוריד, מה שמעיד על הורשה לא-מנדלית של הפנוטיפ.השוואה של מידורי העדבון עבור טרנספורמציה של חלבונים בין ליזאטים של ביקורת (mock lysates) לבין ליזאטים הנושאים PSP1 כחומר המעביר, הראתה כי למעלה מ-53% מהתאים הנאיביים שעברו טרנספורמציה עם PSP1 שנזרע, קיבלו את הפנוטיפ התואם של עמידות למנגן כלוריד. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך מספר שבועות, כולל שלבי דגירה, וניתן להכין את מרבית שלבי הסריקה בפחות משעתיים ליום, גם עם מספר רב של צלחות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לתכנן מראש בדיוק מה ברצונכם לבדוק ולהביא בחשבון את קנה המידה של הניסוי.כעת, נקודה זו חשובה במיוחד עבור מתחילים בטכניקה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אלו המתוארות בפרוטוקול הכתוב, כדי לקבוע אם הפנוטיפים שנצפו בסריקה מציגים דפוס תורשה אמיתי דמוי-Prion. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האפיגנטיקה לחקור את היקף הביולוגיה של Prions ב-sacralis service CI. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לתכנן סריקה בתושבה גבוהה (high throughput screen) לצורה חדשות של תורשה מבוססת-חלבון בשמרים, הן באופן בלתי מוטה והן באופן ממוקד.יש לזכור כי גורמי עקה כימיים מסוימים, כגון חומרים הגורמים לנזקי DNA, עלולים להיות מסוכנים ביותר, ויש תמיד לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מיגון אישי, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

high-throughput-screening-for-protein-based-inheritance-s

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

כאן אנו מתארים מסך overexpression פלסמיד...

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

מודלים של חלבוני שמרים הם כלים רבי ערך להערכת הרעילות והצבירה של חלבונים המעורבים במחלה. כאן, אנו מציגים שיטות לסינון ספריות וריאנטים של Hsp104 עבור מדכאי רעילות. ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לסנן כל ספריית חלבונים לאיתור מדכאי רעילות של כל חלבון רעיל בשמרים.

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית להגדרת אינטראקציות כימיות-גנטיות בשמרים ניצנים. הגישה בנויה על טכניקות בסיסיות בביולוגיה מולקולרית של שמרים ומתאימה היטב לחקירה מכניסטית של אוספים קטנים עד בינוניים של כימיקלים וסביבות מדיה אחרות.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

צוואר בקבוק במחזור ' עיצוב-לבנות בדיקה ' של הנדסת חיידקים היא המהירות שבה אנחנו יכולים לבצע מסכי פונקציונלי של זנים. אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה לסינון המתח המוחל על מאות אלפי תאים שמרים לכל ניסוי העושה שיטה ברצף RNA מבוסס droplet.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

עבודה זו מתארת פרוטוקול לבדיקה גנטית מדכאת מולטי-קופיות בסכיזוזאכרומיצס פומבה. מסך זה משתמש בספריית פלסמידים כלל-גנומית כדי לזהות שיבוטים מדכאים של פנוטיפ אובדן תפקוד הקשור לזן מוטנטי שאילתה. מדכאים גנטיים חדשים של מוטציית האפס ell1 זוהו באמצעות מסך זה.

בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

פרוטוקול זה מתאר את השלבים החיוניים לביצוע קמפיינים לבחירת פני השטח של שמרים להעשרת וריאנטים חלבוניים הנקשרים לאנטיגן מעניין.

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

חקור שיטת הקרנה תפוקה גבוהה לזיהוי חלבונים המעוררים זיכרון פנוטיפי מתמשך ב-Saccharomyces cerevisiae. הטכניקה מאפשרת סינון ללא הטיה של מסלולים ביולוגיים שונים ותורמת להבנת מנגנוני ירושה מבוססי חלבון.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

גלה סרטונים נוספים