ליניארי ההגברה המתווכת PCR - לוקליזציה של אלמנטים גנטיים ואפיון ידוע האיגוף DNA

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות את המיקומים המדויקים של וקטורים ויראליים המשתלבים בגנום. דבר זה מושג על ידי תגובת PCR ליניארית ראשונית עם פריימרים ביוטיניליים להעשרה של רצפי נקודות המפגש בין הגנום של הווקטור לבין ה-DNA הגנומי על פאזה מוצקה בסדרה של תגובות; בתהליך זה נוצר DNA דו-גדילי בעל רצפי DNA ידועים בשני קצות המוצר, מה שמאפשר הגברה אקספוננציאלית של נקודות המפגש של גנום הווקטור. לאחר מכן, אדפטרים לריצוף משולבים במוצרי ה-PCR.

על מנת לרצף ולאפיין את ה-DNA השכן הבלתי ידוע באמצעות ריצוף עמוק (deep sequencing), מקטעים אלו חושפים את המיקומים המדויקים של אינטגרציות הווקטור. התוצאה היא מגוון של נקודות חיבור (junctions) מוגברות כפי שנראה באלקטרופורזה בג'ל. שיטה זו מספקת תובנות לגבי התפלגות אתרי האינטגרציה של וקטורים ויראליים במטופלים בטיפול גנטי קליני.

ניתן ליישם זאת גם במחקרים אחרים כגון מוטגנזה השבחה (insertional mutagenesis), סריקות, זיהום נגיפי, סרטן, וקלונליות של תאי גזע או גיוון של תאי T. הפרוצדורה תודגם על ידי ina RA, טכנאי מהמעבדה שלי. עבור פרוצדורה זו, הכין תחילה את קסטות הלינקר: ערבב 40 µL מכל אחד משני ה-LCO Legos עם 110 µL של tris hydrochloride ו-10 µL של magnesium chloride במבחנת מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, הדגקר את התערובת על בלוק חימום בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות, ואז קירר באיטיות לטמפרטורת החדר למשך הלילה.

ביום למחרת, הוסף 300 µL של מים למקשר (linker) הדו-גדילי שהוכן, DNA, וסנן אותם דרך מבחנה של מיקרו-צנטריפוגה. סובב את המסנן כדי לאסוף את ה-DNA של המקשר המרוכז ב-ouit. לאחר מכן, השג את ה-ouit מהמסנן.

הוסף 80 µL של מים למספרת ופפט. חלק למנבובות PCR בנפחים של 10 µL. בצע PCR להגברה מוקדמת של נקודות החיבור (junctions) של גנום הווקטור במבחנות תגובה של 50 µL עבור lamb.

הוסיפו בין 1 nanogram ל-1 microgram של DNA מהדגימה לכל תגובה של 50 µL. עבור NR lamb, השתמשו בלפחות 100 nanograms של DNA. אין להוסיף יותר מ-25 µL; בצעו את ה-PCR בהתאם לטבלה 2 בטקסט.

עם השלמת התהליך, הוסיפו 0.5 µL נוספים של tech לכל תגובה והריצו את תוכנית ה-PCR פעם שנייה. ראשית, הכינו את החרוזיים המגנטיים. הוסיפו 20 µL של חרוזיים מגנטיים מצופים ב-strept ENC למבחנה של 1.5 mL והניחו אותם על המפריד לחרוזיים מגנטיים למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון. השעו את החרוזים ב-40 µL של PBS עם BSA והחזירו את החרוזים למפריד לדקה נוספת. החליפו את הנוזל העליון בשטיפה של 20 µL של תמיסת ליתיום כלוריד בריכוז 3M.

שוב, הניחו את החרוזים על המפריד למשך דקה אחת. סיימו על ידי החלפת הנוזל העליון ב-50 µL של תמיסת lithium chloride בריכוז 6 M. כעת, הוסיפו את תערובת החרוזים המגנטיים לתוצר של תגובת ה-PCR והשאירו את התערובת להדגרה למשך שעתיים עד לילה שלם בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.

ה-DNA הביוטינילי, ה-strip tava והחרומים המצופים יגבשו קומפלקסים שניתן לאחסן בטמפרטורה של 4 °C למשך עד ארבעה ימים. המשיכו ל-lamb או NR lamb. בשל רגישותו הגבוהה, L-A-M-P-C-R נוטה לזיהום אם הוא מבוצע ללא תשומת לב.

זוהי סביבת עבודה בדרגת PCR, וניתן לראות כי תשומת לב מיוחדת לנקיון היא בעלת חשיבות עליונה. כדי להגביר בהצלחה את ה-DNA השכן הלא ידוע מבלי לזהם את הדגימות, ראשית חשוף את הקומפלקסים למפריד למשך דקה, ולאחר מכן השהה מחדש את חרוזי ה-DNA ב-100 µL של מים.

בשלב הבא, חשפו את הקומפלקסים למפריד למשך דקה. ובפעם זו, השעיקו מחדש את קומפלקסי DNA-bead בתערובת המכילה 8.25 µL מים, 1 µL מחוף HEXA nucleotide, רבע µL של dNTPs וחצי µL של cano polymerase.

דגרו תערובת זו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה. לאחר מכן, הוסיפו 90 µL של מים וחשפו את התגובה למפריד למשך דקה נוספת. לאחר מכן, השביו את קומפלקסי חרוזי ה-DNA ב-100 µL של שטיפת מים.

השתמשו בסנטריפוגה למשך דקה נוספת והכינו את תגובת אנזים ההגבלה. לאחר הסרת הנוזל העליון, הוסיפו 8.5 µL מים, 1 µL של בופר לאנזים ההגבלה, ו-0.5 µL של אנזים ההגבלה.

בעת בחירת אנזים ההגבלה, ודאו שאין לו אתרי חיתוך בתוך או במורד אתר הקישור הראשוני ששימש בתגובת ההגברה המוקדמת. לאחר מתן זמן תגובה לאנזימים למשך שעה בטמפרטורה האופטימלית, הוסיפו 90 µL מים. השתמשו במפריד למשך דקה והשביו את קומפלקס ה-BDNA בתמיסת שטיפה של 100 µL מים.

חזור על ההפרדה והכן את תגובת הליגציה. הוסף לחרוזי הניקוי 5 µL מים, 1 µL של 10 x fast link buffer, 1 µL של TP, 1 µL של fast link DNA ligase ו-1 µL של ה-linker cassette שהוכן בתחילת הפרוטוקול.

יש להניח לתגובה זו להימשך במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש להפסיק את התגובה על ידי הוספת 90 µL של מים והפרדת החרוזיים, ולאחר מכן שטיפה ב-100 µL של מים. לאחר מכן, יש לבצע הפרדה נוספת; כדי לדנטור את ה-DNA המסנתז, יש להשהות את החרוזיים ב-5 µL של נתרן הידרוקסיד 0.1 N, ולהניח לתערובת להתערבל במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הפרידו את הקומפלקסים למשך דקה ואספו את ה-SUP natin, המכיל את צומת גנום הווקטור שעבר הגברה מוקדמת. עברו מיד להגברה אקספוננציאלית או שמרו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. התחילו בחשיפת הקומפלקסים למפריד למשך דקה.

לאחר מכן, השביה את חרוזי ה-DNA ב-100 µL של מים. הפר אותם שוב והסר את הנוזל העליון. עבור תגובת הליגציה, הוסף 6.5 µL של מים, 1 µL של circ Ligase ו-10x reaction buffer.

חצי מיקרוליטר של מגנזיום כלוריד, חצי מיקרוליטר של TP, מיקרוליטר אחד של אוליגואנוקלאוטידי קישור SS, וחצי מיקרוליטר של cir ligase. לאחר שעה בטמפרטורה של 60 °C, יש לסיום את התגובה באמצעות 90 מיקרוליטר של מים ותוך שימוש במפריד חרוצים Resus; השהה את החרוצים ב-100 מיקרוליטר נוספים של מים, השתמש שוב במפריד ואסוף את קומפלקסי השטיפה ב-10 מיקרוליטר של מים. התחל בהכנת תערובת PCR מאסטר (master mix) כפי שמתואר בטבלה 3 בטקסט.

הוסיפו 48 µL של תערובת מאסטר (master mix) לשני µL של מוצרי lamb או NR lamb במבחנות PCR של 200 µL, והריצו את ה-PCR כפי שמתואר בטקסט. כפי שנעשה בעבר, הכינו עוד חרוזי strept ותלה אתם מחדש בליתיום כלוריד בריכוז 6 M. השתמשו ב-20 µL עבור lamb או ב-50 µL עבור NR lamb. לאחר מכן, הוסיפו חרוזים לנפח זהה של תוצרי תגובת PCR והדגירו אותם על שייקר במהירות של 300 RPM למשך שעתיים או ללילה בטמפרטורת החדר; אספו את קומפלקס ה-DNA-חרוזים ושטפו אותו עם 100 µL של מים כפי שהודגם בעבר.

כעת, השעו את התכסית בנתרן הידרוקסיד 0.1 נורמלי והדגירו את החרוזיים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על מכשיר ניעור. לאחר מכן, חשפו את החרוזיים למפריד למשך דקה ואספו את העילאי המכיל את ה-DNA המוגבר לשפופרת חדשה. השתמשו ב-DNA המוגבר כתבנית, וקחו ממנו שני מיקרוליטרים כדי להריץ PCR כפי שמתואר בטבלה 4 בטקסט.

בצעו ויזואליזציה של התוצרים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל כדי לטהר את התוצרים. ערבבו 40 µL מהם עם 44 µL של חרוזי מגנט am pure XP בטמפרטורת החדר, והדגרימו אותם למשך חמש דקות. לאחר מכן, הפרדו את החרוזים למשך שתי דקות באמצעות המגנט.

לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), שטפו את החרוזיים פעמיים באמצעות 200 µL של 70% ethanol, ולאחר מכן השעיקו מחדש את החרוזיים ו-30 µL של מים באמצעות 40 ng של DNAA fusion primer. ניתן להשתמש ב-PCR כדי להוסיף מתאימים (adapters) ספציפיים לריצוף. פרטים מופיעים בטבלה חמישה.

בדקו את התוצרים על ג'ל. צפייה בתוצאות של PCR של lamb באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל ברזולוציה גבוהה היא הבחירה הטובה ביותר לאנליזה דיאגנוסטית לצורך השוואה. למרות ש-2%aros עובד גם הוא, הוא אינו יעיל באותה מידה.

לא ניתן לאבחן באופן חזותי את הקלונליות של תוצרי PCR של NR LAMB. עם זאת, ג'ל אגרוז בריכוז 2% מספיק בהחלט כדי לקבוע את הצלחתו של הפרוטוקול. לאחר רצף של תוצרי ה-PCR, ניתן למצוא את מיקום הווקטורים בגנום המארח.

מנתונים אלו ניתן לתעד את מיקומי אתרי ההחדרה באזורים מקודדים ובסמיכות לאתרי תחילת תמלול. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הטיפול הגנטי לבחון את הבטיחות הביולוגית של וקטורים להעברת גנים הן במודלים פרה-קליניים והן בניסויי טיפול גנטי קליניים.