ליניארי ההגברה המתווכת PCR - לוקליזציה של אלמנטים גנטיים ואפיון ידוע האיגוף DNA

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות את המיקומים המדויקים של שילוב וקטורים נגיפיים בגנום. זה מושג על ידי תגובת PCR ליניארית ראשונית עם פריימרים ביוטיניליים להעשרה עבור רצפי צומת גנום וקטורי מ-DNA גנומי בשלב מוצק בסדרה של תגובות, נוצרים DNA דו-גדילי עם רצפי DNA ידועים בשני קצוות המוצר, המאפשר הגברה אקספוננציאלית של צמתים גנומיים וקטוריים. מתאמי הריצוף הבאים משולבים במוצרי PCR כבש.

על מנת לרצף ולאפיין את ה-DNA האגפי הלא ידוע עם ריצוף עמוק, שברים אלה חושפים את המיקומים המדויקים של אינטגרציות וקטוריות. התוצאה היא מגוון של צמתים מוגברים כפי שהם נראים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. שיטה זו מספקת תובנה לגבי התפלגות אתר אינטגרציה וקטורית ויראלית בחולי ריפוי גנטי קליני.

ניתן ליישם אותו גם במחקרים אחרים כגון החדרה, מוטגנזה, מסכים, זיהום בנגיף, סרטן ושיבוט תאי גזע או מגוון תאי T. ההליך יודגם על ידי אינה RA, טכנאית מהמעבדה שלי להליך זה, הכינו תחילה את קלטות הקישור מערבבות 40 מיקרוליטר מכל אחד משני הלגו LCO עם 110 מיקרוליטר טריס הידרוכלוריד, ו-10 מיקרוליטר מגנזיום כלוריד בצינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן, הכניסו את התערובת לדגירה על גוש חום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן מצננים לאט לטמפרטורת החדר למשך הלילה.

למחרת, הוסיפו 300 מיקרוליטר מים ל-DNA המקשר הדו-גדילי המוכן, וסננו אותם על צינור מיקרו-צנטריפוגה. סובב את המסנן כדי לאסוף את ה-DNA המקשר המרוכז ב-ouit. לאחר מכן, שחזר את ה-ouit מהפילטר.

הוסף 80 מיקרוליטר מים ל-ouit ולפיפטה. 10 מיקרוליטר לתוך צינורות PCR. השתמש ב-PCR כדי להגביר מראש את צמתי הגנום הווקטורי בצינורות תגובה של 50 מיקרוליטר לכבש.

הוסף בין ננוגרם אחד למיקרוגרם אחד של DNA דגימה לכל תגובה של 50 מיקרוליטר. עבור כבש NR, השתמש לפחות 100 ננוגרם של DNA. אל תוסיף יותר מ-25 מיקרוליטר של ביצוע ה-PCR לפי טבלה שתיים בטקסט.

וכשתסיים, הוסף 0.5 מיקרוליטר נוסף של טכנולוגיה לכל תגובה והפעל את תוכנית ה-PCR בפעם השנייה. ראשית, הכינו את החרוזים המגנטיים. הוסף 20 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצופים ENC לצינור של 1.5 מיליליטר והניח אותם על מפריד החרוזים המגנטיים למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן השליכו את העלאת הסופרנטנט. השעו את החרוזים ב -40 מיקרוליטר PBS עם BSA והחזירו את החרוזים למפריד למשך דקה נוספת. החלף את הסופרנטנט בשטיפה של 20 מיקרוליטר של תמיסת ליתיום כלוריד שלוש טוחנת.

ושוב, הניחו את החרוזים על המפריד למשך דקה. סיים על ידי החלפת הסופרנטנט ב-50 מיקרוליטר של תמיסת ליתיום כלוריד שש טוחנת. כעת הוסיפו את תערובת החרוזים המגנטית לתוצר של תגובת ה-PCR ואפשרו לתערובת זו לדגור במשך שעתיים עד לילה בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.

ה-DNA הביוטינילי והרצועה והחרוזים המצופים ייצרו קומפלקסים שניתן לאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד ארבעה ימים. המשך עם כבש או כבש NR בשל רגישותו הגבוהה. L-A-M-P-C-R נוטה לזיהום אם מבוצע בתשומת לב.

זו סביבה בדרגת PCR. ותשומת לב מיוחדת לניקיון בעל חשיבות עליונה. כדי להגביר בהצלחה את ה-DNA האגפי הלא ידוע מבלי לזהם את הדגימות, ראשית חשפו את הקומפלקסים למפריד למשך דקה והשעו את חרוזי ה-DNA ב-100 מיקרוליטר מים.

לאחר מכן, חשפו את המתחמים למפריד למשך דקה. והפעם השעו מחדש את מתחמי חרוזי ה- DNA בתערובת עם 8.25 מיקרוליטר מים. מיקרוליטר אחד של מאגר נוקלאוטידים HEXA, רבע מיקרוליטר של NTPs D DN וחצי ליטר פולימראז קאנו.

דגרו על תערובת זו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן מוסיפים 90 מיקרוליטר מים וחושפים את התגובה למפריד למשך דקה נוספת. לאחר מכן השעו מחדש את מתחמי חרוזי ה- DNA בשטיפה של 100 מיקרוליטר מים.

השתמש במפריד למשך דקה נוספת והכן את תגובת אנזים ההגבלה. לאחר הסרת הסופרנטנט. הוסף 8.5 מיקרוליטר מים, מיקרוליטר אחד של מאגר אנזים הגבלה וחצי מיקרוליטר של אנזים ההגבלה.

בעת בחירת אנזים ההגבלה, ודא שאין לו אתרים בתוך או במורד הזרם של אתר הקישור הראשוני המשמש בתגובת ההגברה הראשונית. לאחר שאפשרו לאנזימים להגיב במשך שעה בטמפרטורה האידיאלית, הוסיפו 90 מיקרוליטר מים. השתמש במפריד למשך דקה והשהה מחדש את מתחמי ה- BDNA בשטיפה של 100 מיקרוליטר מים.

חזור על ההפרדה והכן את תגובת הקשירה. הוסף לחרוזים חמישה מיקרוליטר מים, מיקרוליטר אחד של מאגר קישור מהיר פי 10. מיקרוליטר אחד של TP, מיקרוליטר אחד של ליגאז DNA לקישור מהיר ומיקרוליטר של קלטת הקישור שנעשתה בתחילת ההליך.

אפשר לתגובה זו לפעול במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. סיים את התגובה על ידי הוספת 90 מיקרוליטר מים והפרדת החרוזים, ואחריו שטיפה ב -100 מיקרוליטר מים. ואז הפרדה נוספת לדנטורציה של הדנ"א המסונתז משהה מחדש את החרוזים בחמישה מיקרוליטרים של 0.1 נתרן הידרוקסיד רגיל, ומאפשר לתערובת לנער במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הפרד את הקומפלקסים למשך דקה ואסוף את ה-SUP natin, המכיל את צומת הגנום הווקטורי המוגבר של preem. המשך מיד עם ההגברה האקספוננציאלית או אחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס. התחל בחשיפת המתחמים למפריד למשך דקה.

והחייאה, תליית חרוזי הדנ"א ב-100 מיקרוליטר מים. והפרד אותם שוב והסר את הסופרנטנט. לתגובת הקשירה, הוסף 6.5 מיקרוליטר מים, מיקרוליטר אחד של סירקל ליגאז, 10 x מאגר תגובה.

חצי מיקרוליטר מגנזיום כלוריד, חצי מיקרוליטר TP, מיקרוליטר אחד של אוליגוס מקשר SS וחצי ליטר סיר ליגאז. לאחר שעה בחום של 60 מעלות צלזיוס, סיימו את התגובה עם 90 מיקרוליטר מים באמצעות מפריד החרוזים Resus השעיית החרוזים בעוד 100 מיקרוליטר של אחד, השתמשו שוב במפריד ואספו את מתחמי הכביסה ב -10 מיקרוליטר מים. התחל בהכנת תערובת מאסטר PCR כמתואר בטבלה 3 של הטקסט.

הוסף 48 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לשני מיקרוליטר של מוצרי כבש או כבש NR בצינורות PCR של 200 מיקרוליטר והפעל את ה-PCR כמתואר בטקסט כמו קודם, הכין עוד סטרפט בחרוזים והשהה אותם מחדש בשישה ליתיום כלוריד מולארי. השתמש ב -20 מיקרוליטר לכבש או 50 מיקרוליטר לכבש NR. לאחר מכן הוסיפו חרוזים לאותו נפח של תוצרי תגובת PCR ודגרו אותם על שייקר ב-300 סל"ד למשך שעתיים עד לילה בטמפרטורת החדר, אספו את קומפלקס חרוזי ה-DNA ושטפו אותו ב-100 מיקרוליטר מים כפי שהודגם קודם לכן.

כעת, השעו את הקומפלקס ב-0.1 נתרן הידרוקסיד רגיל ודגרו על החרוזים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר. לאחר מכן חשפו את החרוזים למפריד למשך דקה ואספו את הסופרנטנט שמכיל את הדנ"א המוגבר לצינור חדש. השתמש ב-DNA המוגבר כתבנית, השתמש בשני מיקרוליטרים ממנו כדי להריץ PCR כמתואר בטבלה 4 של הטקסט.

דמיין את המוצרים על ידי אלקטרופורזה ג'ל לטיהור המוצרים. מערבבים 40 מיקרוליטר מהם עם 44 מיקרוליטר של טמפרטורת החדר אם חרוזים מגנטיים טהורים XP, ודוגרים עליהם למשך חמש דקות. לאחר מכן הפרד את החרוזים למשך שתי דקות על המגנט.

לאחר הסרת הסופרנטנט, שטפו את החרוזים פעמיים באמצעות 200 מיקרוליטר של אתנול 70%, ולאחר מכן השעו מחדש את החרוזים ו-30 מיקרוליטר מים באמצעות 40 ננוגרם של פריימר היתוך DNAA. ניתן להשתמש ב-PCR כדי להוסיף מתאמים ספציפיים לרצף. הפרטים מובאים בטבלה חמש.

בדוק את המוצרים על ג'ל. צפייה בתוצאות של PCR כבש על ידי אלקטרופורזה של ג'ל ברזולוציה גבוהה היא הבחירה הטובה ביותר לניתוח אבחון בהשוואה. בעוד ש-2%aros גם עובד, זה לא עובד כמו שצריך.

לא ניתן לאבחן שיבוט של מוצרי NR LAMB, PCR באופן ויזואלי. עם זאת, ג'ל אגרוס של 2% מספיק לחלוטין כדי לקבוע את הצלחת הפרוטוקול. לאחר ריצוף תוצרי ה-PCR, ניתן למצוא את מיקום הווקטורים בגנום המארח.

מנתונים אלה, ניתן לרשום מיקומי אתרי הכנסה באזורי קידוד, וקרוב לאתרי התחלת תמלול לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הריפוי הגנטי לחקור את הבטיחות הביולוגית של וקטורי העברת גנים הן במודלים פרה-קליניים והן בניסויים קליניים בריפוי גנטי.