השלמת אנליזה פונקציונלית (FCA): תרגיל מעבדה ומומש כדי להשלים את הוראת הביוכימיים

המטרה הכוללת של מאמר ההשלמה הפונקציונלית היא להבהיר את פעילותו של אנזים על ידי הכנסת עותק פונקציונלי של הגן המתאים לתא מוטנטי כדי לראות אם הוא משחזר פנוטיפ מסוג פרא ברקע המוטנטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במגוון תחומים, כגון ביוכימיה, מיקרוביולוגיה, גנטיקה, ביולוגיה של צמחים, אבולוציה ואחרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מעריכה את התפקוד, הפעילות ו/או התפקיד של אנזים, בתנאי in vivo, שהם בדרך כלל פיזיולוגיים באופיים, בניגוד לתנאי מבחנה, שהם בדרך כלל מלאכותיים באופיים.

ההשלכות של טכניקה זו, משתרעות לכיוון זיהוי, ו/או הבהרת התפקוד של אנזימים לא מאופיינים ואלה שעדיין יש להם פונקציות משוערות או חזויות. מדגים את ההליך הזה של השלמה פונקציונלית הוא מגמת ביוטכנולוגיה וביו-מדעים מולקולריים, טיילור הרקנס, סטודנט במעבדה שלי. לאחר השיבוט של הגנים DapL, TarB, MurE ו-RSH על פי פרוטוקול הטקסט, יש לחסן 50 מיליליטר של מדיום נוזלי עם מושבה אחת של תאי חיידקים מוטנטיים כדי לעבור טרנספורמציה עם גן מעניין ולגדול בן לילה.

ביום השני, השתמש בתרבית לילה של 50 מיליליטר כדי לחסן 1 ליטר מהמדיום המתאים ולגדול ב-30 מעלות צלזיוס לשלב הנעילה, או ל-OD600 של 0.4 עד 0.6. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 5, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן שפכו את הסופרנטנט והשתמשו ב-500 מיליליטר של מים סטריליים, קרים כקרח, מזוקקים כדי להשהות מחדש את הגלולה.

צנטריפוגה שוב של התאים, ולאחר סילוק הסופרנטנט, השתמש ב-250 מיליליטר של גליצרול סטרילי וקר כקרח כדי להשעות מחדש את הגלולה. לאחר סיבוב התאים בפעם האחרונה, השתמש בשני מיליליטר של 10% גליצרול כדי להשעות מחדש את התאים. העבירו 50 מיקרוליטר לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה והקפיאו מיד על ידי הנחת הצינורות באמבט אתנול קרח יבש.

אחסן את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס לצורך אלקטרופורציה. כדי לבצע אלקטרופורציה, הוסף 1 מיקרוליטר של פלסמיד רקומביננטי לכמות של 50 מיקרוליטר של תאים מוכשרים והניח על קרח למשך חמש דקות. העבירו את התאים לקוביית אלקטרופורציה והגדירו את מנגנון האלקטרופורציה להגדרות הבאות: קיבול של 25 מעלות פרנהייט, 2.5 קילו-וולט והתנגדות של 200 אוהם.

לאחר מכן עם הקובט במכשיר, העבירו דופק. הוסף 1 מיליליטר של מדיום התאוששות לקובט והעביר את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. אפשר לתאים להתאושש על ידי דגירה של התרבית בחממה רועדת עם סיבוב עדין למשך 60 דקות בטמפרטורה המתאימה הנדרשת על ידי המוטנט.

כדי לבחור טרנספורמציה, פיפטה 100 מיקרוליטר מהתרבית על מדיום עם צלחות אגר והשתמש במפזר סטרילי כדי להפיץ את התמיסה. לאחר מכן, דגרו למשך הלילה בטמפרטורה המתאימה. עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים.

כדי לבצע ניתוח השלמה, התמיר את AOH1 עם הווקטור הריק pBAD33 או עם וקטורי ביטוי dapL באמצעות אלקטרופורציה, כפי שהודגם זה עתה. צלחת את תערובת הטרנספורמציה על מדיום אגר LB, בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר Dap, 34 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול ו-50 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני התבוננות בתוצאות.

עם הווקטור הריק pBAD33 או עם וקטור המבטא murE, הפוך את המוטציה TKL-11 באמצעות אלקטרופורציה כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. צלחו את השנאים על אגר LB, בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר תיאמין, ו-34 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול, ודגרו על הצלחות ב-30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני בדיקת שנויים. בדוק השלמה על ידי פסים או ציפוי מושבות הן מהבקרה והן מהטרנספורמציות הניסיוניות על שתי צלחות של מדיום LB, בתוספת 0.2% ארבינוז ו-50 מיקרוגרם למיליליטר תיאמין.

דגרו צלחת אחת ב-30 מעלות צלזיוס והשנייה ב-42 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני הערכת פנוטיפ הגדילה. התירו את הזן המוטנטי Hx699 ואת הזן הפראי Rr217 של מיני נובוספינגוביום עם הווקטור הריק pRK290, או וקטור המכיל את הגן המקומי rshNsp בשני אירועי טרנספורמציה נפרדים כל אחד, כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. צלחו את הטרנספורמנטים על דקסטרוז תפוחי אדמה או אגר PD בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר טטרציקלין ודגרו למשך 72 שעות לפחות, או עד להופעת שנאים.

לאחר מכן, פס את הטרנספורמנטים בתבנית X על לוחות אגר PD טריים עם טטרציקלין. לאחר דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים לפחות, בדוק ויזואלית את פנוטיפ הצמיחה של שתי הצלחות. המוטציה הכפולה של E.coli AOH1 מכילה מוטציה בגן DapE, ומחיקה של הגן DapD, ולא תגדל אלא אם כן יסופקו Dap.

כפי שניתן לראות כאן, המוטציה AOH1 המבטאת DapLs מסוגלת לצמוח על מדיום נטול LLDap על ידי המרת THDP ל-LLDap במסלול Dap lyse. האנזים MurE מקל על הוספת m-DAP לפפטידוגליקן של חיידקים גרם שליליים. המוטציה E.coli MurE, TKL-11, אינה יכולה לגדול ב-42 מעלות צלזיוס.

בניסוי זה, רק תאי TKL-11 שעברו טרנספורמציה עם MurE גדלים ב-42 מעלות צלזיוס. מוטציה בגן TyrB מונעת סינתזה של טירוזין ופנילאלנין. עם זאת, כפי שמוצג כאן, כאשר הזן המוטנטי TyrB DL39 מבטא את הגן A.thaliana At5g36160, הוא גדל על מדיום M9, חסר טירוזין ופנילאלנין, מה שמדגים שהאנזים יכול לסנתז טירוזין.

המוטציה Hx699 במיני נובוספינגוביום מכילה חלבון RSH לא פונקציונלי ומייצרת פנוטיפ היפו-רירי. עם זאת, טרנספורמציה עם הגן RSH המקורי מייצרת פוליסכרידים חוץ-תאיים מסיסים יותר בפס ה-X הרב-תאי שהוא היפר-רירי. לעומת זאת, כאשר המוטציה Hx699 עוברת טרנספורמציה עם וקטור ריק, היא מייצרת פנוטיפ היפו-רירי.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-24 עד 48 שעות. אם מבוצע כראוי, תלוי בצמיחת אורגניזם המודל בו נעשה שימוש, למעט שיבוט, יכולת ההכנה ושלבי הטרנספורמציה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את דרישות תנאי הגידול של המוטציות המשמשות בניתוח ההשלמה הפונקציונלית.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אפיונים אקסיומטיים מסורתיים במבחנה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ספציפיות המצע, טמפרטורה ו-pH אופטימלי, ושיעורי מהירות סומטיים וכו'. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ובתחומי משנה רבים, כגון מיקרוביולוגיה, להבהיר את התפקוד או התפקיד in vivo של אנזימים ממגוון אורגניזמים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לייצר תאי חיידקים בעלי יכולת חשמלית, כיצד להתמיר חיידקים באמצעות אלקטרופורציה, וכיצד להעריך את תפקודם של גנים/אנזימים באמצעות השלמה פונקציונלית.

אל תשכח שעבודה עם אורגניזמים פתוגניים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט באמצעי הזהירות הדרושים.