ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

המטרה הכוללת של הליך זה היא למפות אתרים של אינטראקציה של ACAP LBC עם PDE ארבע D שלוש. על ידי מדידת עוצמת הקרינה הממוצעת של ביו-מולקולרי, פלואורסצנטי, השלמה או BC באמצעות ציטומטריית זרימה. לשם כך, תאים עוברים טרנספטציה עם ACAP LBC ו-PDE ארבעה D שלושה שברים מאוחים לחלק הסופי N או C של חלבון המדווח הפלואורסצנטי.

לאחר מכן מבוצעת ציטומטריית זרימת ונוס כדי להעריך את הקרינה אם שברי החלבון מתקשרים ונוס הושלמה והפלואורסצנטיות. אם שברי החלבון אינם מתקשרים, לא מתגלה פלואורסצנטיות. ניתוח דם מערבי משלים מבוצע כדי לקבוע את רמות ביטוי החלבון היחסיות.

עוצמת האינטראקציות של חלבון החלבון מחושבת לאחר מכן על ידי נורמליזציה של עוצמת הקרינה הממוצעת של YFP עם רמות ביטוי החלבון. הנתונים שהתקבלו מצביעים על כך שהקישור של PDE 43 ל-ACAP LBC מתווך על ידי מספר אזורים בתוך PDE 43, בעיקר דרך אזור שמור במעלה הזרם אחד או UCR. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת כמו קו-אימונו-משקעים ו-BP C באמצעות מיקרוסקופ או שהיא פשוטה יחסית, היא רגישה והיא מאפשרת סינון מהיר של מספר רב של תאים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות חלבון-חלבון, ניתן להשתמש בה גם כדי לסנן גורמים המווסתים אינטראקציות חלבון-חלבון לגילוי תרופות. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שצריך לקבוע תגובת B ליניארית. ביטוי של מבנה צריך להיות דומה כך שניתן יהיה להשוות את השימוש בשברי חלבון שונים זה לזה.

בניסויים המתוארים כאן, התאים עוברים טרנספטציה עם מקטע מסוף N של נגזרת YFP, נוגה התמזגה ל-ACAP LBC באורך מלא ושבר מסוף C של נוגה התמזג לאחד מהבאים, PDE E 43 באורך מלא, האזור השמור במעלה הזרם אחד UCR אחד של PDE E 43 או האזור השמור במעלה הזרם שתיים בתוספת האזור הקטליטי UCR R שניים פלוס CAT של PDE 43 יום לפני הטרנספקציה ב שש. ובכן, צלחות תרבית רקמות זרעות 1.2 פעמים 10 עד החמישי HEC 2 9 3 תאי T לבאר בשני מיליליטר של צמיחה מלאה. זרע בינוני, שלוש בארות בקרה ועוד שלוש בארות לכל אחת מהבדיקות.

קוטראן דגר ב-5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת התכוננו לטרנספקציה של מבני ה-DNA של הפלזמה BC ווקטור CFP, שהוא טרנספטציה של cot עם מבני BS C כסמן. עבור כל מצב, הוסף את הכמות המתאימה של DNA ל-250 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום Optum M1.

בצינור סטרילי, מספיק צינור אחד כדי להעביר שלוש בארות. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטרים של מגיב מעבר LT אחד לכל מיקרוגרם לתערובת ה-DNA המדוללת ופיפטה בעדינות לערבב לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה ב-250 מיקרוליטר של תערובת טרנספקציה טיפתית לתאים ואז דגירה ב-5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס, 24 שעות.

בדיקת הקרינה לאחר טרנספקציה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי, התאים צריכים לבטא פלואורסצנציה צהובה עבור אות BC ופלואורסצנציה CFP לדיווח על יעילות טרנספקציה. כדי להכין את התאים לניתוח זרימה ציטומטרי יש לשטוף אותם תחילה בשני מיליליטר PBS קר כקרח, ואז לנתק את התאים על ידי הוספת 250 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין דגירה למשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ בדוק אם יש ניתוק תאים.

לאחר שהתאים התנתקו, נטרלו את הטריפסין עם מיליליטר אחד של DMEM. לאחר מכן, העבירו מיליליטר אחד של תאים לצינור מיקרו צנטריפוגה אחד, ולאחר מכן העבירו 0.25 מיליליטר תאים לצינור מיקרו צנטריפוגה שני. סובב את הצינורות ב -500 גבינות למשך חמש דקות.

הדגימה של 250 מיקרוליטר תעובד עוד יותר עבור ציטומטריית זרימה. הניחו את דגימת המיליליטר בצד על קרח לבדיקת דם מערבית, אותה יש לבצע במקביל לאחר הספין Resus. השעו את התאים ב-250 מיקרוליטר של מאגר פקס והניחו אותם על תאי קרח ניתן לתקן גם ב-1% אלדהיד פרפורמי ב-PBS אם ניתוח ציטומטריית זרימה לא יהיה מיידי כאן, ציטומטריית זרימה מבוצעת באמצעות ציאן בקמן קולטר DP המצויד בלייזרים במצב מוצק 488 ננומטר 405 ננומטר ו-642 ננומטר תוכנת פסגת לייזרים משמשת לרכישה וניתוח לאחר כיול ציטומטר הזרימה באמצעות חרוזים סטנדרטיים, התוויית פיזור קדימה או FSC לעומת SSC פיזור הצידה בקנה מידה ליניארי והליכה על אוכלוסיית התאים החיים.

העלילה הבאה SSC לעומת רוחב דופק המתח וההליכה על אוכלוסיית התאים החיים הלא מצטברים. לאחר מכן שרטט FSC בקנה מידה ליניארי לעומת פלואורסצנטי CFP ב-405 FL שש במכשיר זה בסולם לוג והליכה על התאים החיוביים של CFP החיים שאינם מצטברים. לבסוף, שרטט FSC בקנה מידה ליניארי לעומת פלואורסצנטי YFP ב-488 ננומטר FL אחד במכשיר זה בסולם לוג כדי להמחיש את עוצמת BC.

לאחר מכן, הפעל את הדגימה השלילית הכפולה Y-F-P-C-F-P והתאם את צינור מכפיל הצילום F-S-C-S-C FL אחד ו-FL שש או מתח PMT כדי להגדיר את הסף עבור כל אות. לאחר מכן, הפעל גם דגימות חיוביות בודדות של YFP וגם CFP לפיצוי לא מקוון עתידי. הקפד לרכוש לפחות 10,000 אירועים סגורים.

לבסוף, אסוף נתונים עבור דגימות ניסיוניות לאחר איסוף הנתונים. הגדר את פרוטוקול הניתוח לפי רכישה עם התפשטות עם שער אחד בעלילת נקודות FS CSC עבור תאים חיים. שער שני בדופק FSC עם עלילת נקודות של שער אחד עבור תאים חיים לא מצטברים ושער שלוש בתרשים נקודות ccfp FSC של שער שתיים עבור תאים חיים חיוביים של ccfp שאינם מצטברים.

לאחר פיצוי על אות YFP ו- CCFP בתרשים נקודות Y fp CFP באמצעות תאים חיוביים בודדים של YFP ו- CFP, אנו קובעים את קווי החיתוך עבור תאים חיוביים CFP ו- YFP. ייצא את עוצמת הקרינה הממוצעת של YFP או MFI של תאים חיוביים CFP כדי להצטיין להתוויית נתונים, ואז באקסל לנרמל את Y-F-P-M-F-I לרמת הביטוי של ACAP, LBC, PDE, E 43 ובקרת הטעינה אלפא טובולין כפי שנקבע על ידי Western Blotting, כדי לקבוע את הטווח הליניארי של עוצמת הקרינה הממוצעת של YFP. CFP הועבר עם VN ACAP L BBC וכמויות משתנות של VC PDE E 43 בתאי HEC 2 93 והאינטראקציה הוערכה באמצעות ציטומטריית זרימה bif כמתואר בסרטון זה, תרשים זה מראה שינוי קפל יחסי בביטוי של VC PDE E 43 כפונקציה של VC PDE E 43 שהועבר.

עוצמת הקרינה הממוצעת של נוגה בתאים חיוביים ל-CFP שצוינה על ידי הריבועים הכחולים הייתה בקורלציה עם ביטוי VCDE 43 והייתה עקבית עם רמות הביטוי שנקבעו על ידי ניתוח תמונה של כתם מערבי, המסומן על ידי המשולשים האדומים. עוצמת הקרינה הממוצעת של CFP נצפתה בקרב הדגימות כפי שצוין על ידי הריבועים הירוקים ושימשה כבקרה שלילית להגבלת וריאציות התאים. תוצאות אלו מאמתות את השימוש בזרימה ציטומטרית לכימות אינטראקציה של ACAB LB C PDE 43 על ידי מדידת עוצמת הקרינה הממוצעת של BS e ובמקביל קביעת הכמות הנכונה של מבני BIC המשמשים להקרנה למיפוי אתרי קשירת ACAP LBC בתוך ניתוח PDE E 43 BIC של אינטראקציה ACAP LBC עם PDE E 43 fl באורך מלא.

אזור UCR אחד של PDE 43 ו-UCR שניים ואזורי CAT של PDE 43 הוערך בשיטה זו כפי שניתן לראות כאן. ביטוי של vn, ACAP, LBC ו-VC PDE 43 UCR, שניים פלוס CAT מביא לאות BC נמוך יותר בהשוואה ל-VC, PDE 43, FL ו-VC PDE 43, UCR, נצפה ביטוי חלבון דומה אחד בכל דגימות הזרימה, והפלואורסצנציה הממוצעת נורמלה לרמות הביטוי היחסיות של ACAP, LBC, PDE 43 ואלפא טובולין. לכן B-C-M-F-I מנורמל מצביע על כך שאין הבדל בעוצמת הקרינה בין ACAP LBC PDE 43 FL ל-ACAP LBC PDE 43 UCR R אחד, אך אות נמוך בהרבה עבור אינטראקציה של ACAP LBC PDE 43 UCR שתיים פלוס CAT.

תוצאות אלה מצביעות על כך שישנם מספר אזורים ב-PDE 43 המקיימים אינטראקציה עם ACAP LBC וכי PDE 43 UCR R אחד הוא אזור האינטראקציה העיקרי עם ACAP LBC. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור אינטראקציה בין חלבון, חלבון על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה של BP C.בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקבוע את הכמות הנכונה של מבנה BP C המשמש להשגת ביטוי חלבון דומה ותגובת BP C ליניארית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פפטיד או סיכון על מנת לקבוע אילו חומצות אמינו ב-PDE 40 D 3 אחראיות.

אינטראקציות ה-ACAP RBC שלו.