ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למפות את אתרי האינטראקציה של ACAP LBC עם PDE four D three. זאת על ידי מדידת עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של השלמה פלואורסצנטית ביו-מולקולרית (Biomolecular Fluorescence Complementation או BiFC) באמצעות ציטומטריית זרימה. לצורך כך, תאים עוברים טרנספקציה עם מקטעים של ACAP LBC ו-PDE four D three המחוברים לקצה N או לקצה C של חלבון דגל פלואורסצנטי.

לאחר מכן מבוצעת ציטומטריית זרימה של Venus כדי להעריך פלואורסצנציה במקרה שבו מקטעי החלבון מקיימים אינטראקציה; תהליך ה-Venus מסתיים ובדיקת הפלואורסצנציה נבחנת. אם מקטעי החלבון אינם מקיימים אינטראקציה, לא תזוהה פלואורסצנציה. ניתוח משלים של Western blot מבוצע כדי לקבוע את רמות הביטוי היחסיות של החלבון.

עוצמת האינטראקציות בין החלבונים מחושבת לאחר מכן על ידי נורמליזציה של עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של YFP ביחס לרמות ביטוי החלבון. הנתונים שהתקבלו מעידים כי הקישור של PDE 43 ל-ACAP LBC מתווך על ידי מספר אזורים בתוך PDE 43, בעיקר באמצעות האזור השמרני העליון הראשון, או UCR one. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו co immunoprecipitation ו-BP C באמצעות מיקרוסקופ הם שהיא פשוטה יחסית, היא רגישה והיא מאפשרת סריקה מהירה של מספר רב של תאים.

אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אינטראקציות בין חלבונים, ניתן להשתמש בה גם לסריקת גורמים המווסתים אינטראקציות בין חלבונים לצורך גילוי תרופות. בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בהתחלה, כיוון שיש לקבוע תגובת B לינארית. רמת הביטוי של ה-construct צריכה להיות דומה, כדי שניתן יהיה להשוות בין תוצאות המשתמשות במקטעי חלבון שונים.

בניסויים המתוארים כאן, התאים עוברים טרנספקציה משותפת (cot transfection) של מקטע N-טרמינלי של נגזרת YFP, Venus, המחוברת ל-ACAP LBC באורכו המלא, ומקטע C-טרמינלי של Venus המחוברת לאחד מהבאים: PDE E 43 באורכו המלא, האזור השמרני העליון אחד (UCR one) של PDE E 43, או האזור השמרני העליון שני בתוספת האזור הקטליטי (UCR R two plus CAT) של PDE 43. יום לפני הטרנספקציה, זרעו 1.2×10⁵ תאי HEC 2 9 3 T לכל באער בלוחות תרבית רקמה של שש באערים, בשני מיליליטר של מצע גידול מלא. זרעו שלוש באערים לצורך בקרה ועוד שלוש באערים עבור כל אחת מהבדיקות.

דגרו את התאים ב-5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה. למחרת, הכינו את ה-BC plasma DNA constructs ואת וקטור ה-CFP, המועבר בטרנספקציה משותפת עם ה-BS C constructs כסמן. עבור כל תנאי, הוסיפו את כמות ה-DNA המתאימה ל-250 microliters של מצע Optum M1 נטול סרום.

במבחנה סטרילית, מבחנה אחת מספיקה לטרנספקציית שלושה בארות. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיקרוליטר של reagent TransIT-L1 עבור כל מיקרוגרם של תערובת DNA מהולת, וערבבו בעדינות באמצעות פיפטה. דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, טפטפו 250 מיקרוליטר של תערובת הטרנספקציה אל התאים, ואז דגרו ב-5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 24 שעות.

לאחר הטרנספקציה, בדקו את הפלואורסצנציה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי; התאים אמורים להפגין פלואורסצנציה צהובה עבור אות ה-BC ופלואורסצנציית CFP לדיווח על יעילות הטרנספקציה. כדי להכין את התאים לניתוח בציטומטריה עם זרימה, שטפו אותם תחילה ב-2 mL של PBS קר בקרח, ולאחר מכן נתקו את התאים על ידי הוספת 250 µL של Trypsin בריכוז 0.05% והדגירו למשך שתיים עד חמש דקות ב-37 °C. לאחר מכן, בדקו את ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופ.

לאחר שהתאים התנתקו, יש לנטרל את ה-trypsin באמצעות מיליליטר אחד של DMEM. לאחר מכן, העבירו מיליליטר אחד של תאים לשפרוret centrifuge tube אחד, ואז העבירו 0.25 מיליליטר של תאים לשפרוret centrifuge tube שני. סובבו את המבחנות ב-500 ×g למשך חמש דקות.

דגימה של 250 µL תעובד בהמשך עבור ציטומטריה של זרימה. יש להפריש דגימה של 1 mL על קרח לצורך אנליזת Western blot, שצריכה להתבצע במקביל לאחר השעיית התאים. יש להשעות את התאים ב-250 µL של FACS buffer ולהניחם על קרח; ניתן גם לקבע את התאים ב-1% Paraformaldehyde ב-PBS. אם אנליזת הציטומטריה של הזרימה לא תבוצע באופן מיידי. ציטומטריה של זרימה מבוצעת באמצעות מכשיר Beckman Coulter CytoFLEX המצויד בלייזרים במצב מוצק של 488 nm, 405 nm ו-642 nm; תוכנת Summit משמשת לרכישת הנתונים ולאנליזה. לאחר כיול הציטומטר באמצעות חרוזי סטנדרט, יש להפיק גרף של פיזור קדמי (FSC) מול פיזור צדי (SSC) בסולם לינארי, ולבצע gaiting על אוכלוסיית התאים החיים.

בשלב הבא, שרטט את ה-SSC מול רוחב פולס המתח ובצע gait על אוכלוסיית התאים החיים שאינם מאגרגים. לאחר מכן, שרטט את ה-FSC בסולם ליניארי מול פלואורסצנציית CFP בערוץ 405 FL six במכשיר זה בסולם לוגריתמי, ובצע gait על התאים החיים החיוביים ל-CFP שאינם מאגרגים. לבסוף, שרטט את ה-FSC בסולם ליניארי מול פלואורסצנציית YFP ב-488 nanometers בערוץ FL one במכשיר זה בסולם לוגריתמי כדי להדמיות את עוצמת ה-BC.

בשלב הבא, הרץ את דגימת ה-Y-F-P-C-F-P כפולה-שלילית וכייל את המתח של שפופרת הכפלת הפוטונים (PMT) עבור FL one ו-FL six ב-F-S-C-S-S-C כדי לקבוע את סף הרגישות עבור כל אות. לאחר מכן, הרץ דגימות חיוביות-בודדות הן עבור YFP והן עבור CFP לצורך פיצוי (compensation) אופליין בעתיד. ודא שאתה רוכש לפחות 10,000 אירועים מסוננים (gated events).

לבסוף, אספו נתונים עבור הדגימות הניסוייות לאחר איסוף הנתונים. הגדירו את פרוטוקול הניתוח בהתאם לרכישה, תוך הפעלת שער 1 (gate one) בגרף פיזור FS CSC עבור תאים חיים. הגדירו את שער 2 (gate two) ב-FSC pulse עם גרף פיזור של שער 1 עבור תאים חיים שאינם מאגרגים, ואת שער 3 (gate three) בגרף פיזור ccfp FSC של שער 2 עבור תאים חיים חיוביים ל-ccfp שאינם מאגרגים.

לאחר פיצוי עבור אותות YFP ו-CCFP בתרשים פיזור (dot plot) של YFP ו-CFP באמצעות תאים חיוביים בודדים ל-YFP ו-CFP, אנו קובעים את קווי הסף לתאים חיוביים ל-CFP ו-YFP. ייצא את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של YFP, או ה-MFI, של תאים חיוביים ל-CFP לקובץ excel לצורך שרטוט נתונים, ולאחר מכן ב-Excel נרמל את ה-YFP-MFI לרמת הביטוי של ACAP LBC PDE E 43 ולבקרת הטענה alpha tubulin כפי שנקבעו ב-western blotting, כדי לקבוע את הטווח הליניארי של עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של YFP. CFP הוטרנספקט יחד עם VN ACAP L BBC וכמויות משתנות של VC PDE E 43 בתאי HEC 2 93, והאינטראקציה הוערכה באמצעות ציטומטריה עם זרימה דו-צבעית כפי שמתואר בסרטון זה; תרשים זה מציג את השינוי המקופל היחסי (relative fold change) בביטוי של VC PDE E 43 כפונקציה של כמות VC PDE E 43 שהוטרנספקטה.

עצימות הפלואורסצנציה הממוצעת של Venus בתאים חיוביים ל-CFP, המסומנים בריבועים כחולים, הייתה במתאם עם ביטויו של VCDE 43 ועקבית עם רמות הביטוי שנקבעו בניתוח תמונה של western blot, המסומן במשולשים אדומים. עצימות פלואורסצנציה ממוצעת דומה של CFP נצפתה בין הדגימות, כפי שמוסמן בריבועים ירוקים, ושימשה כביקורת שלילית להגבלת וריאציות בין תאים. תוצאות אלו מתקפות את השימוש בציטומטריה של זרימה לכימות האינטראקציה בין ACAB LB C ל-PDE 43 על ידי מדידת עצימות הפלואורסצנציה הממוצעת של BS e, ובו-זמנית קביעת הכמות המתאימה של מבני BIC המשמשים לסריקה לצורך מיפוי אתרי קישור של ACAP LBC בתוך PDE E 43 BIC בניתוח האינטראקציה של ACAP LBC עם PDE E 43 fl באורכו המלא.

האזור UCR one של PDE 43 והאזורים UCR two ו-CAT של PDE 43 נבחנו באמצעות שיטה זו כפי שניתן לראות כאן. ביטוי של vn ACAP LBC ו-VC PDE 43 UCR two פלוס CAT גורם לאות BC נמוך יותר בהשוואה ל-VC PDE 43 FL ו-VC PDE 43 UCR one; ביטוי חלבוני דומה נצפה בכל דגימות הזרימה, והפלואורסצנציה הממוצעת נורמלה לרמות הביטוי היחסיות של ACAP LBC PDE 43 ו-alpha tubulin. לכן, B-C-M-F-I מנורמל מצביע על כך שאין הבדל בעוצמת הפלואורסצנציה בין ACAP LBC PDE 43 FL לבין ACAP LBC PDE 43 UCR R one, אך קיים אות נמוך בהרבה עבור אינטראקציית ACAP LBC PDE 43 UCR two פלוס CAT.

תוצאות אלו מרמזות כי קיימים מספר אזורים ב-PDE 43 המקימים אינטראקציה עם ACAP LBC, וכי PDE 43 UCR R one הוא אזור האינטראקציה העיקרי עם ACAP LBC. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה כיצד לחקור אינטראקציית חלבון-חלבון באמצעות ניתוח flow cytometry של BP C. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור לקבוע את הכמות הנכונה של מבנה BP C שבה נעשה שימוש כדי להשיג ביטוי חלבון דומה ותגובה ליניארית של BP C. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון פפטיד או risk, כדי לקבוע אילו חומצות אמינו בתוך PDE 40 D three הן האחראיות לכך.

אינטראקציות ה-ACAP שלו עם RBC.