מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק תהליך עבודה מפורט לטיהור מדויק ולהשכבה של פוליריבוסומים מהמוח על מיקה, ולהשגת אלפי תמונות ברזולוציה ננומטרית ללא צורך בעיבוד פוסט-פרוססינג כבד או בניתוחי רקביית תלת-ממד. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומי התרגום והבקרה התרגומית, כגון הבנת ההשפעה של ארגון הריבוסומים בתוך פוליסומים במהלך חיווט מחדש של ביטוי גנים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שאין צורך בקיבוע או בסימון של הדגימה, וניתן לבצע את המדידות בתנאים קרובים לתנאים פיזיולוגיים כדי לזהות בקלות את הריבוסומים ואת גדילי ה-RNA החופשיים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הארגון של פוליריבוזומים של יונקים, ניתן להחילה אותה גם על מיקרואורגניזמים אחרים, כגון שמרים, חיידקים וחרקים, וכן על מצבים הכוללים בקרות תרגומיות של ביטוי גנים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הטיפול בדגימה פוליסומלית לספיגה על מיקה ושלבי השטיפה הם מורכבים למדי ודורשים מיומנויות טיפול וניסיון. את ההליך ידגימו Paola Bernabo ו-Lorenzo Lunelli.

כדי להתחיל, אספו והקפיאו רקמת מוח כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, הוציאו את הרקמה הקפואה מהמקפיא והניחו אותה על משטח העבודה. הניחו את רקמת המוח הקפואה וחנקן נוזלי לתוך מכתש שקולל מראש ומרסקו אותה בעזרת עלי, עד לקבלת אבקה.

העבירו כ-25 milligrams של אבקת המוח למבחנה מיקרו-צנטריפוגה קרה והוסיפו מיד 0.8 milliliters של lysis buffer. העלו והורידו את התמיסה באמצעות פיפט 25 פעמים במהירות כדי לפרק את התאים. לאחר מכן, סובבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-12, 000 x g למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius כדי לשקיע את השאריות התאיות.

העבירו את הנוזל העליון למבחנת מיקרוצנטריפוגה חדשה ושמרו את המבחנה על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה למשך חמש דקות כדי לשקע את הגרעינים והמיטוכונדריה. לאחר מכן, הסירו בזהירות 1 ml מהחלק העליון של מדרג סוכרוז שהוכן מראש.

הסף את הסוכרוז טיפה אחר טיפה עם העילוי מהליזאט הציטוזולי. כעת, כאשר הדגימה טעונה בחלק העליון של המדרג, הורד בזהירות את המבחנה ואת מבחנת האיזון לתוך הסלים של רוטור עם סלים נעים (swinging bucket rotor). סבב את המדרג בצנטריפוגה למשך 100 דקות.

לאחר אולטרה-צנטריפוגציה, השאירו את המבחנות בסלים למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, כדי לאפשר למדרג להתייצב. לאחר מכן, הוציאו בזהירות את מבחנת הדגימה והניחו אותה על מכשיר האיסוף של מערכת הפרדה לפי מדרג צפיפות. אספו פרקציות של מיליליטר אחד תוך ניטור בליעת חומצות גרעין ב-260 ננומטר באמצעות גלאי אור UV-visible, והניחו אותן על קרח.

בשלב הבא, הכינו מנות של 30-40 µL מהfracions המבוקשים ושמרו אותן על קרח. אם הדגימות לא ישמשו באופן מיידי, אחסנו אותן בטמפרטורה של 80- °C ונקטו במעמדים להגבלת מספר מחזורי ההקפאה וההפשרה. כדי להכין דגימות לדימות AFM, כסו תחילה פלטת מיקה שטופה ב-200 µL של ניקל ii סולפ sogenannte 1 mM והדגרימו את הפלטה למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הסירו את התמיסה, ייבשו את פני השטח בעזרת אוויר דחוס, והניחו את פטרית הפטרי על קרח. כעת, הוסיפו בזהירות את כל המנה מהפרק הרלוונטי, טיפה אחר טיפה, על המיקה. בעזרת טיפ של 100 או 200 microliter, פזרו את הדגימה על פני כל שטח המיקה, והדגירו את הדגימה על קרח למשך שלוש דקות.

לאחר מכן, כסו את לוח המיקה טיפה אחר טיפה ב-200 µL של AFM buffer קר והדגירו את הדגימה על קרח למשך שעה אחת. שמירת הדגימה בטמפרטורה של 40 מעלות ושימוש בבופר קר שהוכן במים נקיים מ-RNase חיוניים כדי לשמר את ארגון הפוליריבוסומים. לאחר הדגירה, הסירו בזהירות את הבופר ושטפו את המיקה שלוש עד ארבע פעמים עם 200 µL של AFM buffer קר כדי להסיר שאריות סוכרוז.

לאחר מכן, שטפו את המיקה שלוש פעמים עם תמיסת שטיפה קרה וסננו את עודפי המים מהמיקה באמצעות נייר. הסרה מלאה של סוכרוז מהדגימות הסופגות היא קריטית כעת, לאחר שהפרדתם הן את הריבוזומים והן את ה-RNA החופשי (naked RNA) בפוליסום. השאירו את הדגימה להתייבש תחת מזהם כימי כאשר מכס פטרי המעבדה פתוח חלקית.

לאחר שעתיים, סגרו את פטריית המצע. כעת ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורת החדר. הצמידו את הדגימה שהוכנה למחזיק הדגימות של ה-AFM באמצעות סרט דביק דו-צדדי.

לאחר מכן, הכניסו את מחזיק הדגימה לבמה של ה-AFM בהתאם להוראות היצרן. לאחר הכיול, התקרבו לדגימה עד שקצה הקנטילבר (cantilever) יבוא במגע עם הפני השטח. בחרו שטח סריקה של שני על שני מיקרונים, רזולוציה של לפחות 512 x 512 פיקסלים, בחרו במצב חיסור רקע בזמן אמת (live background subtraction), ובחרו קנה מידה של Z בטווח של 20-25 ננומטרים.

לאחר מכן, התחילו ברכישת התמונה. בחנו את התמונה וחפשו נוכחות של עצמים עגולים המאופיינים בגובה שבין 10 ל-15 ננומטרים בעת רכישת תמונות באוויר. לאחר מכן, כווןנו את נקודת הset point ואת פרמטרי המשוב עד להדמיה של עצמים חדים.

במדגמים טובים, הרקע אמור להיראות שטוח יחסית עם מספר עצמים בגובה של שני עד ארבעה ננומטרים. ברגע שהתמונה נראית טובה, בצעו מספר סריקות של שני על שני מיקרון באזורי מדגם שונים. לאחר השקיעת מנות של סוכרוז על מיקה, AFM מספק תיאורי גודל מדויקים של פוליסומים בודדים, הנראים כצבירי ריבוזומים דחוסים.

בחינה מקרה של אחד מהפיקים הריבוסומליים באמצעות ניתוח חתך רוחב מגלה כי גובה הפיקים הריבוסומליים הוא כ-14 nanometers. נתון זה תואם את מה שנצפה בעבר עבור ריבוסומים ופוליסומים אנושיים לאחר ייבוש באוויר. בתמונה מימין, נעשה שימוש במאקרו כדי לזהות את מיקום הריבוסומים ולסמן כל ריבוסום בעיגול אדום.

באמצעות מידע זה, ניתן לנתח את התפלגות השכיחות של מספר הריבוזומים לכל פוליסום. התפלגות ניסיונית זו הותאמה לעקומה גאוסיאנית שהייתה מרוכזת ב-5.8 ריבוזומים לכל פוליסום, עם סטיית תקן של 1.3. ברגע שהטכניקה תישלט, השלב שבין גריס המוח לרכישת תמונות הפוליריבוזומים יכול להסתיים בפחות משמונה שעות אם הוא מבוצע כראוי.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על הדגימה על קרח ולהשתמש בתמיכים (buffers) קרים לצורך השקיעת הדגימה על המיקה. באמצעות ביצוע פרוצדורה זו, ושימוש בתוסף ImageJ של מפתח שיהיה זמין במאמר שלכם, תוכלו לספור במדויק את מספר הריבוזומים לכל פוליסום. לאחר כל פיתוח, טכניקה זו תסלול את הדרך להבנת הקינטיקה של היווצרות הפוליסומים ולזיהוי שינויים בארגון הפוליסומים ותנאיהם התאיים או הרקמתיים השונים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשיג אלפי תמונות של פוליסומים לצורך ניתוח שיטתי ובחינה של ארגונם.