Name: מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: למד שיטת הדמיה של פוליסומים במוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי ללא צורך בקיבוע או סימון. הטכניקה מאפשרת זיהוי ריבוזומים ורנ"א בקרבה לתנאים פיזיולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי פרויקט המחקר AXonomIX שמומן על ידי Provincia Autonoma di Trento, איטליה.

הפרקטיקות על מנת לקבל את רקמות העכבר אושרו על ידי גוף להגנת בעלי חיים (OPBA) של אוניברסיטת טרנטו (איטליה), פרוטוקול לא. 04-2015, לפי art.31 צו המחוקק לא. 26/2014. כל העכברים היו מתוחזקים במתקן אורגניזם מודל של המרכז לביולוגיה אינטגרטיבית (CIBIO), אוניברסיטת טרנטו, איטליה. זהירות: כדי למנוע את השפלה RNA של דגימות, להכין את כל מאגרי שימוש במים שטופלו DEPC למזעור זיהום RNase. 1. הכנת Polysomes ממוחו כל הפריטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף רקמות מוח (15 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים C57BL זן עכבר wild-type / 6 עם מחנק 2 CO 5 דקות 36. בזהירות לנתח את המוח החוצה מהגולגולת 36, למקם את הרקמה לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל ו למקם אותו בחנקן נוזלי. חנות ב -80 ° C עד השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת lysate (30 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכתוש את רקמת המוח כולו באמצעותובמכתש תחת חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כ -25 מ&quot;ג אבקה לצינור microcentrifuge קר ומייד (כדי למנוע את הפשרת הרקמה המרסקת) להוסיף 0.8 מיליליטר של הצפת תמוגה (ראה טבלה 1) ולשבש את התא על ידי pipetting למעלה ולמטה 25 פעמים מהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב XG 12,000 במשך 1 דקות ב 4 ° C עד גלולה פסולת הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש ולשמור את הצינור על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת גרעינים ואת המיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את supernatant ב -80 מעלות צלזיוס למשך תקופה מקסימלית של 6 חודשים או להשתמש בו באופן מיידי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שיפוע סוכרוז צנטריפוגה (2 שעה ו -30 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ultracentrifuge לשטוף צינורות בהרחבה עם מי RNase ללא (מי מטופלי diethylpyrocarbonate (מי DEPC) או מסחריים)ד 3% H 2 O 2 / DEPC H 2 O פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את הצינורות על הקרח ולהוסיף 5.5 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז קר 50% בחלק התחתון של צינור אחד (ראה לוח 1 עבור פתרונות סוכרוז). בזהירות להוסיף את ירידת תמיסת סוכרוז 15% אחר טיפה, נשאר קרוב שלבי ביניים כדי לשמור על שלבי חדה, עד הצינור הוא מלא לחלוטין. כאשר הצינור הוא מלא לחלוטין, לסגור אותו עם פקק גומי, כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר קר בעדינות להניח את הצינורות אופקיים ולשמור אותו בתנוחה זו למשך 2 שעות. לאחר פרק זמן זה, לאט ליישר את הצינורות בחזרה למצב אנכי ולשים אותם על הקרח. ההדרגתיים מוכנים כעת לשמש. לחלופין, להכין את שיפוע סוכרוז 15-50% באמצעות שיפוע קונבנציונאלי לשעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר קר להסיר בזהירות 1.0 מ&quot;ל מהחלק העליון של השיפוע ואת כיסוי הירידה סוכרוז אחר טיפה עם lysate cytosolic (כלומר, supernatant שהושגו STEp 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד בזהירות את הצינורות לתוך הדליים של הרוטור דלי מתנדנד. צנטריפוגה ההדרגתי עבור 100 דקות ב 180,000 XG ב 4 ° C באמצעות ultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לעזוב את הצינורות בדליים שלהם במשך 20 דקות ב 4 ° C לתת לייצב ההדרגתי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלוקת שיפוע סוכרוז (2 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות צינור ultracentrifuge אחד מן הרוטור ultracentrifuge ולעגן אותה במכשיר אספן של צפיפות מערכת חלוקה Gradient. אסוף 1 מיליליטר שברים ניטור את הספיגה ב 260 ננומטר עם גלאי UV / VIS (ראה איור 1 פנל עליון). שמור על השברים שנאספו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquots של 30-40 μl של שברים של עניין, ולשמור אותם על הקרח לפני אחסונם ב -80 ° C עד השימוש. אין להשתמש aliquots או שברי סוכרוז כי עבר יותר משני מחזורי הקפאה-פשרה (ראה איור 1 פנל תחתון). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. הכנת המדגם עבור מיקרוסקופית כוח אטומי (3 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קלטת, לקלף את הגיליונות יציצו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הגיליונות יציצו 3-4 פעמים עם מי DEPC ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי קטנה. לאחר מכן לייבש את פני השטח באמצעות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את מיקה עם 200 μl של 1 מ&quot;מ Niso 4 דגירה במשך 3 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון ניקל ולאחר מכן לייבש את פני השטח באמצעות אוויר. לבצע את המהלכים הבאים ב 4 ° C על ידי נחת צלחת פטרי עם תציץ על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot שהושגו 1.4.2 על קרח בעדינות להוסיף את כל טיפה מדגם אחר טיפה על מיקה. בעזרת קצה 100-200 μl, להפיץ את המדגם על פני השטח של מיקה. דגירה המדגם על קרח למשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הירידה יציץ גיליון אחר טיפה עם 200 μl קר הצפה-AFM (ראה טבלה 1) ו דגירה במשך שעה 1 על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה בנוזל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסירו בזהירות את ההצפה-AFM ו לכבס את הסדינים יציצו 3-4 זמןים עם 200 μl קר הצפה-AFM להסיר סוכרוז עודף. לאחר מכן לשטוף את הסדינים נציץ 3 פעמים עם פתרון כביסה קר (ראה טבלה מס &#39;1), בהשאירו את פני השטח נציץ סוקר בכמה מיקרוליטר של פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לך להצביע 3 (תמונת רכישה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה באוויר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את מאגר-AFM ולשטוף את מיקה 3-4 פעמים עם 200 μl קר הצפת-AFM להסיר את סוכרוז עודף. לאחר מכן, לשטוף את מיקה 3 פעמים עם פתרון כביסה קר (ראה טבלה 1) ומסננים את המים העודפים באמצעות נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו המדגם להתייבש מתחת למכסה המנוע כימי עם החלק העליון של צלחת פטרי פתוחה חלקית. לאחר 2 שעות, לסגור את צלחת פטרי ולאחסן ב RT. מדוד את המדגם לאחר 2-3 שעות כפי שהם יציבים במשך שנים. </li></ol></li></ol> 3. Image Acquisition (15 דקות לכל תמונה לאחר ייצוב תרמי) הערה: Polysomes משותקת על תציץ ניתן הדמיה באוויר או בנוזל, באמצעות מצב AC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את מיקה לבעל המדגם באמצעות קלטת דו צדדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את בעל מדגם בשלב AFM הבא להוראות היצרן. כאשר הדמיה בנוזל, במידת האפשר, מנסה לשמור על מדגם בטמפרטורה נמוכה מ -25 מעלות צלזיוס כדי להגביר את היציבות polysome בזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שלוחה מתאימה הדמית AC ולעגן אותה על בעל הקצה הבא להוראות היצרן. הנה, cantilevers לשימוש עם כוח קבוע בין 2-20 N / m הדמיה אוויר סביב 0.1 N / m הדמיה נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מקום הליזר על השלוחה ואת אפס אותות הגלאים ברבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תדירות נהיגה מתאימה ולנסוע השלוחה עם משרעת של 10-20 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקרב המדגם עד הקצה עוסקת פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור הסריקה של מיקרומטר 2x2, לרכוש לפחות תמונות פיקסל 512x512 (רוחב פיקסל &lt;4 ננומטר), בחר מצב חיסור רקע חיה בסולם Z של 20-25 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק tהוא דמות מחפש בנוכחות חפצה עגולים מאופיינים גובה בין 10 ו -15 ננומטר בעת הרכישה באוויר ו -25 ו -30 ננומטר כאשר בנוזל ואת הרוחב ננו בטווח 25-30. כוונו את הפרמטרים setpoint ומשוב עד חפצים חדים הם דמיינו. הרקע אמור להופיע שטוח יחסית בדגימות טובות, עם כמה חפצים בגובה 2-4 ננומטר (ראה איור 2 א &#39;וב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התמונה נראית טובה (כמצוין בשלב 3.8), לרכוש כמה סריקות מיקרון 2x2 (לפחות עשר) בשעת אזורי מדגם שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי). במידת הצורך, לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של polysomes שנבחר (ראה איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תיקוני תוכנה (חיסור מטוס ואלגוריתמי תיקון שורה אחר שורה) כדי לתקן את תמונות AFM הסרת הטיה שרירותית ונסחפו אפקטים. </li></ol> 4. ניתוח נתונים (30 דקות לכל תמונה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא תמונות ב ImageJ (אופציונלי: להחיל גורם קנה מידה) preferentially באמצעות פורמט דחיסה ללא אובדן נתונים, למשל, בפורמט TIFF (ראה איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש RiboPick.ijm הכלים מאקרו ImageJ (להעתקה בתיקיית הכלים מאקרו / ImageJ) לספור הריבוזומים polysomes (ראה איור 3B) ולחשב הסטטיסטיים של המדגם (ראה איור 3 ג). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל טעינת תמונה באמצעות &lt;תמונה קרא&gt; כלי מאתחל את התוכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק המרכזים הריבוזום עם ImageJ &lt;פוינט בחירה&gt; כלי סטנדרטי (shift + שמאל לחץ מאפשר הריבוזומים רב מבחר). סמן את הריבוזומים הנבחרים עם הכלי &lt;מארק ריבוזומים&gt;. קואורדינטות ריבוזום תופענה חלון טקסט מותאם אישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עוד ריבוזומים לאותו polysome לחזור על ההליך שצוין בנקודת 4.2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור בטעות ריבוזומים מסומנים באמצעות &lt;בטל האיסוף האחרון&gt; הכלי (מתחיל הסרה מן הריבוזום הוסיף האחרון לראשון212; ב polysome הנוכחי בלבד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר polysome הושלמה, השתמש &lt;חדש polysome&gt; כלי. ככל שמספר polysome מתווסף כשכבה אל התמונה בחלון הטקסט מתעדכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &lt;שמירת תוצאות וקרובות&gt; לכתוב את הריבוזום לקובץ קואורדינטות (יחידות ברירת המחדל של התמונה משמשות) ואת תמונת PNG המסכם הריבוזומים שקוטף polysomes. התמונה המקורית סגורה ללא להינצל. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Buttgereit, F., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchy+of+ATP-consuming+processes+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells.</a> Biochem J. 312, 163-167 (1995).</li>
<li>Russell, J. B., Cook, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+bacterial+growth%3A+balance+of+anabolic+and+catabolic+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).</li>
<li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+signatures+and+mRNA+concentration+can+explain+two-thirds+of+protein+abundance+variation+in+a+human+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line.</a> Mol Syst Biol. 6, 400(2010).</li>
<li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13, 220(2012).</li>
<li>Kondrashov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-mediated+specificity+in+Hox+mRNA+translation+and+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning.</a> Cell. 145 (3), 383-397 (2011).</li>
<li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Pircher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+mRNA-derived+noncoding+RNA+targets+and+regulates+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome.</a> Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).</li>
<li>Simms, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+role+for+the+ribosome+in+determining+the+fate+of+oxidized+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA.</a> Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).</li>
<li>van Heesch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+localization+of+long+noncoding+RNAs+to+the+cytosol+and+mono-+and+polyribosomal+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes.</a> Genome Biol. 15 (1), R6(2014).</li>
<li>Preissler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not4-dependent+translational+repression+is+important+for+cellular+protein+homeostasis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast.</a> EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).</li>
<li>Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+particulate+component+of+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">A small particulate component of the cytoplasm.</a> J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).</li>
<li>McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+nascent+protein+by+ribosomes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).</li>
<li>Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+aggregate+engaged+in+protein+synthesis%3A+characterization+of+the+ergosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome.</a> Nature. 2 (197), 430-435 (1963).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrameric+organization+of+vertebrate+centromeric+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).</li>
<li>Allen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope+measurements+of+nucleosome+cores+assembled+along+defined+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences.</a> Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289 (5481), 905-920 (2000).</li>
<li>Schluenzen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+functionally+activated+small+ribosomal+subunit+at+3.3+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution.</a> Cell. 102 (5), 615-623 (2000).</li>
<li>Ben-Shem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+eukaryotic+ribosome+at+3.0+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution.</a> Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).</li>
<li>Anger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+human+and+Drosophila+80S+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the human and Drosophila 80S ribosome.</a> Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).</li>
<li>Brandt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+3D+organization+of+bacterial+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The native 3D organization of bacterial polysomes.</a> Cell. 136, 261-271 (2009).</li>
<li>Myasnikov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+structure+of+the+left-handed+supra-molecular+helix+of+eukaryotic+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes.</a> Nat. Commun. 5, 5294(2014).</li>
<li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+circular+polyribosomes+on+eukaryotic+mRNA+without+cap-structure+and+poly%28A%29-tail%3A+a+cryo+electron+tomography+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).</li>
<li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+transitions+of+eukaryotic+polyribosomes+during+multi-round+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation.</a> Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).</li>
<li>Viero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+ribosome+assemblies+modulated+by+translation+are+the+building+blocks+of+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes.</a> J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).</li>
<li>Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+polyribosomes+in+intact+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells.</a> Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).</li>
<li>Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+ribosomes+and+initiation+complexes+from+rat+liver+as+revealed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy.</a> Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).</li>
<li>Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+and+atomic+force+microscopic+observation+of+polysomes+on+carbon-coated+grids+prepared+by+surface+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).</li>
<li>Mikamo, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+polysomes+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+liquid+solution+observed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy.</a> J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).</li>
<li>Mikamo-Satoh, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+gene-dependent+translational+progress+in+cellfree+protein+synthesis+by+real-space+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging.</a> Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).</li>
<li>Bernabò, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+translational+control+in+non-model+stressed+organisms+by+polysomal+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling.</a> J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Lauria, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboAbacus%3A+a+model+trained+on+polyribosome+images+predicts+ribosome+density+and+translational+efficiency+from+mammalian+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Al Omran, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Ependymal+Cilia+in+the+Lateral+Ventricles+of+the+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain.</a> J Vis Exp. (100), e52853(2015).</li>
<li>Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li>
<li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים במאמר זה ואין מה לחשוף.

כמו מבנה ה- DNA הוכח להיות בעל חשיבות עליונה כדי לתאר את התהליך של שעתוק כארגון של הכרומטין קידם את ההבנה שלנו של שליטה תעתיק של ביטוי גנים, חשוב לנתח את הארגון והמבנה של polysomes לשפר הבנה אמת תרגום והרגולציה שלה. עם הפרוטוקול המתואר, צפיפות אופטימלית של polysomes משותקת בעדינות על משטח שטוח, מתאים הדמית AFM מתקבלת. שימוש במצבים אלו דגימות מוכנות בנוחות, כמעט 50 polysomes לשעה יכולים להירכש, מוכן ניתוחי אפיון נ...

הסינתזה של חלבון היא תהליך האנרגיה הרב ביותר בתאים 1,2. לפיכך, אין זה מפתיע כי שכיחותם חלבון נשלטת בעיקר על translational ולא 3,4,5 רמת התעתיק. Polysome הוא המרכיב macromolecular היסוד הממיר את המידע mRNA לתוך readouts חלבוניים פונקציונלי. Polysomes ובכך מוכרים ככל מתחמי macromolecular שבו מספר פקדים translational להתכנס 6-13. למרות מאה מחקרים על מבנה הריבוזום 14- 16, תובנה המולקולריות המפורטות לתוך הדינמיקה של תרגום ואת הטופולוגיה של polysomes נתקלו עניין מוגבל. כתוצאה מכך, הארגון של מתחם polysomal ribonucleoprotein יליד ההשפעה הפוטנציאלית שלה על תרגום עדיין די בעיות מעורפלות. Polysomes עשוי להסתיר עדיין ארגונים ידועים הורה ופונקציונלי, פוטנציאל שיקוף נוקלאוזום מה לניהול עבודות אפיגנטייםls ייצג לתחום שעתוק. ואכן, החקירה של שערת מסקרן זה דורשת מחקרים נוספים וגישות טכניות חדשות. בקו הזה, טכניקות מבניות במיקרוסקופ כוח אטומי יכולים לשתף פעולה פורה לפענח מנגנונים חדשים לבקרת ביטוי גנים, בדומה למה הושג עבור הנוקלאוזום 17,18. מאז גילויו של הריבוזום 14-16, מבנו התאפיין בהרחבת פרוקריוטים 19,20, שמרים 21 ולאחרונה ב -22 אנושיים, מתן התיאור המולקולרי של המנגנונים בבסיס סינתזת חלבון. Polysomes בתחילה הוכרו על הממברנה של reticulum endoplasmic, ויצר ארגונים גיאומטריים 2D טיפוסיים 14. כפי שהוזכר קודם לכן, הרכבת polysome לא מושא ריבית קבועה כמו המבנה הריבוזום. בעבר, polysomes נחקר בעיקרו על ידי transmission EM מבוסס טכניקות. רק לאחרונה, טכניקות קריו-EM איפשר שחזור 3D של polysomes מטוהרים ממערכות תרגום במבחנה 23-26, lysates הסלולר אדם 27 או בתאים 28. טכניקות אלו המוצעים מידע מעודן יותר על הארגון הריבוזום-הריבוזום ב polysomes 23, 26-28 ותיאור מולקולרי ראשוני של משטחי מגע של ריבוזומים סמוכים polysomes נבט חיטה 24. לפיכך, טומוגרפיה קריו-EM מאפשרת הגילוי של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום עם מולקולרי, אבל הוא נטל על ידי ושחזור שלאחר עיבוד נרחב מנתח הדורשים משאבי חישוביים כבדים לצורך הטיפול במידע. יתר על כן, כדי לקבל את הפרטים המולקולריים של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום, מפה נפתרה ביותר של הריבוזום נדרשה, וגם זה סוג של הריבוזום עזר זמין רק לכמה מינים. חשוב לציין, טומוגרפיה קריו-EM היא לא מסוגלת לזהות RNA בחינם. Therefבצר, טכניקות חדשות נדרשים להבין את הארגון באופן מלא של מכונות תרגום. לצד קריו-EM, AFM הועסק גם ככלי שימושי עבור הדמיה ישירה של polysomes אאוקריוטים התחתון 29-33 ובני אדם 27. לעומת EM, AFM לא דורש קיבוע מדגם או תיוג. בנוסף, מדידות יכולות להתבצע בתנאים פיסיולוגיים ליד ועם האפשרות הייחודית של זיהוי הוא ריבוזומים בבהירות גדילי RNA עירום 27. הדמיה של polysomes היחיד יכולה להתבצע במהירות יחסית, קבלת אלף תמונות בבת ברזולוצית ננו עם מאמץ שלאחר עיבוד מעט לעומת העיבוד שלאחר נרחב וכבד ושחזור ניתוחי נדרש על ידי מיקרוסקופ קריו-EM. כתוצאה מכך, AFM טיפול נתונים וניתוח לא צריך תחנות עבודה יקרות וכוח מחשוב גבוה. ככזה, טכניקה זו אוספת מידע על צורות polysomal, מאפיינים מורפולוגיים (כגוןגובה, אורך ורוחב), צפיפויות הריבוזום, בנוכחות RNA חינם ומספר ריבוזומים לכל polysome 27 עם תפוקה גבוהה יותר מאשר-EM קריו. באופן כזה, AFM מייצג גישה חזק משלים טכניקות EM להציג polysomes 27. כאן אנו מציגים צינור מלא מפני טיהור כדי ניתוח נתונים שבו AFM מוחל תמונה ולנתח polysomes במוח עכבר. הפרוטוקול המוצע מתמקד בנושאי טיהור ועל בתצהיר המדויק של polysomes על מצעים יציצו המשמשים הדמית AFM. בנוסף ניתוח חלקיקים קונבנציונלי שניתן לבצע בקלות עם תוכנה נפוצה בשימוש על ידי קהילת AFM, תוסף 34 ImageJ, שנקרא RiboPick, מוצג עבור לספור את מספר ריבוזומים לכל polysome 27, 35.

<table><tbody><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>הכנה של ליזאט</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>הכנה של ליזאט</td></tr><tr><td>RiboLock מעכב RNAse</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>EO-0381</td><td>הכנה של ליזאט</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>הכנה של ליזאט</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>הכנה של ליזאט</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>הכנה של ליזאט</td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>סיגמא</td><td>D6750</td><td>הכנה של ליזאט</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>הכנה של ליזאט</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>הכנת שיפוע סוכרוז</td></tr><tr><td>אולטרה צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>אופטימה LE-80K</td><td>צנטריפוגה שיפוע סוכרוז</td></tr><tr><td>רוטור</td><td>בקמן קולטר</td> SW <td>41 Ti</td><td>צנטריפוגה שיפוע סוכרוז</td></tr><tr><td>צינור פוליאלומר</td><td>בקמן קולטר</td><td>331372</td><td>צנטריפוגה שיפוע סוכרוז</td></tr><tr><td>צפיפות שיפוע מערכת פיצול שיפוע&nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>פיצול שיפוע סוכרוז</td></tr><tr><td>AFM</td><td>מחקר מקלט</td><td>הדמיה של פוליסום</td> <td>סייפר</td></tr></tbody></table>

מציץ המוח polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

מנגנון translational, כלומר, polysome או polyribosome, הוא אחת הכונה ציטופלסמית הגדולות והמורכבות ביותר בתאים. Polysomes, שהוקם על ידי הריבוזומים, mRNAs, כמה חלבוני RNAs ללא קידוד, מייצג פלטפורמות משולבות שבו שולט translational להתקיים. עם זאת, בעוד הריבוזום נחקר באופן נרחב, ארגון polysomes עדיין חסר הבנה מקיפה. כך מאמץ רב נדרש כדי להבהיר ארגון polysome וכל מנגנון חדשני מלא translational שעשוי להיות מוטבע. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא סוג של מיקרוסקופיה בדיקת סריקה המאפשר רכישת תמונות 3D ברזולוציה של ננו. לעומת במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) טכניקות, אחד היתרונות העיקריים של AFM הוא שזה יכול לרכוש אלף תמונות הם אוויר בתמיסה, מה שמאפשר את המדגם כדי להישמר בתנאים פיסיולוגיים ליד ללא כל צורך מכתים ותיקון פרופרוצדורות. כאן, פרוטוקול מפורט לטיהור המדויקת של polysomes ממוח עכבר בתצהיר שלהם על מצעים יציצו מתואר. פרוטוקול זה מאפשר הדמית polysome באוויר ואת הנוזלים עם AFM והשחזור שלהם כמו אובייקטים תלת-ממדיים. משלימים במיקרוסקופ אלקטרונים cryo- (cryo-EM), השיטה המוצעת ניתן להשתמש בנוחות לניתוח polysomes ולומדים הארגון שלהם באופן שיטתי.

פרופיל polysomal שיפוע סוכרוז של מוח עכבר השלם אפשר לטהר polysomes מתוך lysate הסלולר על ידי יצירת פרופיל polysomal, המפריד מקרומולקולות בהתאם למשקל וגודלם. עם פרופיל polysomal, lysates ציטופלסמית המתקבל תאים או רקמות בתרבית, כגון בדוגמא זו, הם הועמסו על שיפוע סוכרוז ליניארי ועובד על ultracentrifugation להפריד RNA ללא יחידות משנת 4...

בעוד שמבנה הריבוזום אופיין בהרחבה, ארגון הפוליזומים עדיין לא נחקר. כדי להתגבר על חוסר ידע זה, אנו מציגים כאן פרוטוקול הכנה מפורט להדמיה מדויקת של פוליזומים של יונקים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) באוויר ובנוזל.

מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק תהליך עבודה מפורט לטיהור מדויק ולהשכבה של פוליריבוסומים מהמוח על מיקה, ולהשגת אלפי תמונות ברזולוציה ננומטרית ללא צורך בעיבוד פוסט-פרוססינג כבד או בניתוחי רקביית תלת-ממד. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומי התרגום והבקרה התרגומית, כגון הבנת ההשפעה של ארגון הריבוסומים בתוך פוליסומים במהלך חיווט מחדש של ביטוי גנים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שאין צורך בקיבוע או בסימון של הדגימה, וניתן לבצע את המדידות בתנאים קרובים לתנאים פיזיולוגיים כדי לזהות בקלות את הריבוסומים ואת גדילי ה-RNA החופשיים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הארגון של פוליריבוזומים של יונקים, ניתן להחילה אותה גם על מיקרואורגניזמים אחרים, כגון שמרים, חיידקים וחרקים, וכן על מצבים הכוללים בקרות תרגומיות של ביטוי גנים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הטיפול בדגימה פוליסומלית לספיגה על מיקה ושלבי השטיפה הם מורכבים למדי ודורשים מיומנויות טיפול וניסיון. את ההליך ידגימו Paola Bernabo ו-Lorenzo Lunelli.כדי להתחיל, אספו והקפיאו רקמת מוח כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, הוציאו את הרקמה הקפואה מהמקפיא והניחו אותה על משטח העבודה. הניחו את רקמת המוח הקפואה וחנקן נוזלי לתוך מכתש שקולל מראש ומרסקו אותה בעזרת עלי, עד לקבלת אבקה.העבירו כ-25 milligrams של אבקת המוח למבחנה מיקרו-צנטריפוגה קרה והוסיפו מיד 0.8 milliliters של lysis buffer. העלו והורידו את התמיסה באמצעות פיפט 25 פעמים במהירות כדי לפרק את התאים. לאחר מכן, סובבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-12, 000 x g למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius כדי לשקיע את השאריות התאיות.העבירו את הנוזל העליון למבחנת מיקרוצנטריפוגה חדשה ושמרו את המבחנה על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה למשך חמש דקות כדי לשקע את הגרעינים והמיטוכונדריה. לאחר מכן, הסירו בזהירות 1 ml מהחלק העליון של מדרג סוכרוז שהוכן מראש.הסף את הסוכרוז טיפה אחר טיפה עם העילוי מהליזאט הציטוזולי. כעת, כאשר הדגימה טעונה בחלק העליון של המדרג, הורד בזהירות את המבחנה ואת מבחנת האיזון לתוך הסלים של רוטור עם סלים נעים (swinging bucket rotor). סבב את המדרג בצנטריפוגה למשך 100 דקות.לאחר אולטרה-צנטריפוגציה, השאירו את המבחנות בסלים למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, כדי לאפשר למדרג להתייצב. לאחר מכן, הוציאו בזהירות את מבחנת הדגימה והניחו אותה על מכשיר האיסוף של מערכת הפרדה לפי מדרג צפיפות. אספו פרקציות של מיליליטר אחד תוך ניטור בליעת חומצות גרעין ב-260 ננומטר באמצעות גלאי אור UV-visible, והניחו אותן על קרח.בשלב הבא, הכינו מנות של 30-40 µL מהfracions המבוקשים ושמרו אותן על קרח. אם הדגימות לא ישמשו באופן מיידי, אחסנו אותן בטמפרטורה של 80- °C ונקטו במעמדים להגבלת מספר מחזורי ההקפאה וההפשרה. כדי להכין דגימות לדימות AFM, כסו תחילה פלטת מיקה שטופה ב-200 µL של ניקל ii סולפ sogenannte 1 mM והדגרימו את הפלטה למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן הסירו את התמיסה, ייבשו את פני השטח בעזרת אוויר דחוס, והניחו את פטרית הפטרי על קרח. כעת, הוסיפו בזהירות את כל המנה מהפרק הרלוונטי, טיפה אחר טיפה, על המיקה. בעזרת טיפ של 100 או 200 microliter, פזרו את הדגימה על פני כל שטח המיקה, והדגירו את הדגימה על קרח למשך שלוש דקות.לאחר מכן, כסו את לוח המיקה טיפה אחר טיפה ב-200 µL של AFM buffer קר והדגירו את הדגימה על קרח למשך שעה אחת. שמירת הדגימה בטמפרטורה של 40 מעלות ושימוש בבופר קר שהוכן במים נקיים מ-RNase חיוניים כדי לשמר את ארגון הפוליריבוסומים. לאחר הדגירה, הסירו בזהירות את הבופר ושטפו את המיקה שלוש עד ארבע פעמים עם 200 µL של AFM buffer קר כדי להסיר שאריות סוכרוז.לאחר מכן, שטפו את המיקה שלוש פעמים עם תמיסת שטיפה קרה וסננו את עודפי המים מהמיקה באמצעות נייר. הסרה מלאה של סוכרוז מהדגימות הסופגות היא קריטית כעת, לאחר שהפרדתם הן את הריבוזומים והן את ה-RNA החופשי (naked RNA) בפוליסום. השאירו את הדגימה להתייבש תחת מזהם כימי כאשר מכס פטרי המעבדה פתוח חלקית.לאחר שעתיים, סגרו את פטריית המצע. כעת ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורת החדר. הצמידו את הדגימה שהוכנה למחזיק הדגימות של ה-AFM באמצעות סרט דביק דו-צדדי.לאחר מכן, הכניסו את מחזיק הדגימה לבמה של ה-AFM בהתאם להוראות היצרן. לאחר הכיול, התקרבו לדגימה עד שקצה הקנטילבר (cantilever) יבוא במגע עם הפני השטח. בחרו שטח סריקה של שני על שני מיקרונים, רזולוציה של לפחות 512 x 512 פיקסלים, בחרו במצב חיסור רקע בזמן אמת (live background subtraction), ובחרו קנה מידה של Z בטווח של 20-25 ננומטרים.לאחר מכן, התחילו ברכישת התמונה. בחנו את התמונה וחפשו נוכחות של עצמים עגולים המאופיינים בגובה שבין 10 ל-15 ננומטרים בעת רכישת תמונות באוויר. לאחר מכן, כווןנו את נקודת הset point ואת פרמטרי המשוב עד להדמיה של עצמים חדים.במדגמים טובים, הרקע אמור להיראות שטוח יחסית עם מספר עצמים בגובה של שני עד ארבעה ננומטרים. ברגע שהתמונה נראית טובה, בצעו מספר סריקות של שני על שני מיקרון באזורי מדגם שונים. לאחר השקיעת מנות של סוכרוז על מיקה, AFM מספק תיאורי גודל מדויקים של פוליסומים בודדים, הנראים כצבירי ריבוזומים דחוסים.בחינה מקרה של אחד מהפיקים הריבוסומליים באמצעות ניתוח חתך רוחב מגלה כי גובה הפיקים הריבוסומליים הוא כ-14 nanometers. נתון זה תואם את מה שנצפה בעבר עבור ריבוסומים ופוליסומים אנושיים לאחר ייבוש באוויר. בתמונה מימין, נעשה שימוש במאקרו כדי לזהות את מיקום הריבוסומים ולסמן כל ריבוסום בעיגול אדום.באמצעות מידע זה, ניתן לנתח את התפלגות השכיחות של מספר הריבוזומים לכל פוליסום. התפלגות ניסיונית זו הותאמה לעקומה גאוסיאנית שהייתה מרוכזת ב-5.8 ריבוזומים לכל פוליסום, עם סטיית תקן של 1.3. ברגע שהטכניקה תישלט, השלב שבין גריס המוח לרכישת תמונות הפוליריבוזומים יכול להסתיים בפחות משמונה שעות אם הוא מבוצע כראוי.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על הדגימה על קרח ולהשתמש בתמיכים (buffers) קרים לצורך השקיעת הדגימה על המיקה. באמצעות ביצוע פרוצדורה זו, ושימוש בתוסף ImageJ של מפתח שיהיה זמין במאמר שלכם, תוכלו לספור במדויק את מספר הריבוזומים לכל פוליסום. לאחר כל פיתוח, טכניקה זו תסלול את הדרך להבנת הקינטיקה של היווצרות הפוליסומים ולזיהוי שינויים בארגון הפוליסומים ותנאיהם התאיים או הרקמתיים השונים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשיג אלפי תמונות של פוליסומים לצורך ניתוח שיטתי ובחינה של ארגונם.

peering-at-brain-polysomes-with-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

בסרטון זה אנו מדגימים מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי כדי לדמיין נוקלאוזומים מורכבים. טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה זו מאפשרת לחקור את מבנה הנוקלאוזומים.

מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי להדמיה ואפיון של נוקלאוזומים מורכבים

Source: Lunelli, L., et. al. הצצה בפוליזומים במוח עם כוח אטומי מיקרוסקופיה. J. Vis. Exp.(2016).סרטון זה מדגים הדמיה של פוליזומים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. יריעת נציץ מצופה יוני ניקל מעגנת RNA עם ריבוזומים מחוברים. הדגימה נשטפת, מיובשת ומותקנת על במת המיקרוסקופ. קצה השלוחה סורק את פני הדגימה, רושם סטיות לייזר כדי למפות את הטופולוגיה. תוכנה משמשת לתיקון עיוותים ולהמחשת מבני פוליזום ברזולוציה גבוהה.

 הדמיית פוליזומים שבודדו ממוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

שיטה לחקירת המבנה של קולטן אור חלבון באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מתוארת במאמר זה. מיפוי מאפיינים ננו-מכניים כמותי של PeakForce (PF-QNM) חושף דימרים חלבונים שלמים על משטח נציץ.

מיקרוסקופית כוח האטומי של אורות אדומים קולטני אור שימוש במיפוי PeakForce כמותי nanomechanical נכס

אנו מתארים את הליכים מפורטים על מנת למדוד את תכונות מכניות מסלולים מכני התגלגלות של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. אנו גם מראים תוצאות נציג כנקודת התייחסות הבחירה ואת ההצדקה של הקלטות מולקולת חלבון אחד טוב.

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפיון חלקיקים נוקלאוזום ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי ו בצילום מואץ (AFM) טכניקות הדמיה. שיטת functionalization פני השטח המתואר מאפשרת לכידתו של המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים ב ברזולוציה גבוהה ב הננומטרי.

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

אנו מציגים פרוטוקול לפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התלויה מנופים עם תא T יחיד וחלקיק חרוז למחקרים אימונולוגיים. הליכים לחקור בודד זוג תא תא דנדריטי כריכה על ידי AFM ולפקח על התגובה התאית בזמן אמת של מקרופאגים לחלקיק אחיד אחד על ידי AFM עם הדמיה פלואורסצנטית מוצגים.

הפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי מנופים עם תאים חד-טי או חלקיק יחיד לספקטרוסקופיית של כוח בודד אימונולוגיים

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אוליגודנדרוציטים טעונים במיקרוטובולים במודל של טובולינופתיה באמצעות גישה פשוטה וחדשנית של מיקרוסקופיה הרמונית מהדור השני.

אופטיקה לא ליניארית ללא תווית לחקר פגמים תלויי טובולין במיאלין המרכזי

למד שיטת הדמיה של פוליסומים במוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי ללא צורך בקיבוע או סימון. הטכניקה מאפשרת זיהוי ריבוזומים ורנ"א בקרבה לתנאים פיזיולוגיים.

מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

גלה סרטונים נוספים