מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי
March 16th, 2016
בעוד שמבנה הריבוזום אופיין בהרחבה, ארגון הפוליזומים עדיין לא נחקר. כדי להתגבר על חוסר ידע זה, אנו מציגים כאן פרוטוקול הכנה מפורט להדמיה מדויקת של פוליזומים של יונקים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) באוויר ובנוזל.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק צינור מפורט לטיהור ושקיעה מדויקים של פוליריבוזומים במוח על נציץ ולהשיג אלפי תמונות ברזולוציה ננומטרית ללא צורך בניתוחי עיבוד כבדים או שחזור תלת מימד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי תרגום ובקרת תרגום, כגון הבנת ההשפעה של ארגון ריבוזומים בתוך פוליזומים במהלך חיווט מחדש של ביטוי גנים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שאין צורך בקיבוע או תיוג דגימה, וניתן לבצע מדידות בתנאים כמעט פיזיולוגיים כדי לזהות בקלות את הריבוזומים ואת עמדות ה-RNA העירומות.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ארגון הפוליריבוזום של יונקים, ניתן ליישם אותה גם על מיקרואורגניזמים אחרים, כגון שמרים, חיידקים וחרקים, כמו גם סטטוס הכרוך בבקרות תרגומיות של ביטוי גנים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הטיפול בדגימה פוליזומלית לספיגת נציץ ושלבי הכביסה הם די מסובכים ודורשים מיומנויות טיפול וניסיון. מי שידגים את ההליך יהיו פאולה ברנבו ולורנצו לונלי.
כדי להתחיל, אסוף והקפיא רקמת מוח כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, משוך את הרקמה הקפואה מהמקפיא והביא אותה לספסל. מניחים את רקמת המוח הקפואה והחנקן הנוזלי במכתש מקורר מראש ומרסקים אותו בעזרת עלי עד ליצירת אבקה.
העבירו כ-25 מיליגרם מאבקת המוח לצינור מיקרו-צנטריפוגה קר והוסיפו מיד 0.8 מיליליטר של מאגר ליזה. פיפטו את התערובת למעלה ולמטה 25 פעמים במהירות כדי לשבש את התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה של הצינור ב-12,000 x גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את הפסולת התאית.
העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש והשאירו את הצינור על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור למשך חמש דקות כדי לגלול גרעינים ומיטוכונדריה. לאחר מכן, הסר בזהירות מיליליטר אחד מהחלק העליון של שיפוע סוכרוז שהוכן בעבר.
שכבו את הסוכרוז טיפה אחר טיפה עם הסופרנטנט מהליזאט הציטוזולי. כאשר הדגימה נטענת כעת על גבי השיפוע, הורד בזהירות את הצינור וצינור איזון לתוך הדליים של רוטור דלי מתנדנד. צנטריפוגה את השיפוע למשך 100 דקות.
לאחר אולטרה-צנטריפוגה, השאירו את הצינורות בדליים שלהם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, כדי לאפשר לשיפוע להתייצב. לאחר מכן, הסר בזהירות את צינור הדגימה והתקן אותו על מכשיר האספן של מערכת פיצול שיפוע צפיפות. אסוף שברים של מיליליטר אחד תוך ניטור הספיגה של חומצות גרעין ב-260 ננומטר עם גלאי אור נראה UV והניח אותם על קרח.
לאחר מכן, הכינו 30-40 מיקרוליטר של חלקי העניין, ושמרו אותם על הקרח. אם הדגימות לא ישמשו מיד, אחסן אותן ב-80 מעלות צלזיוס ונקוט בצעדים להגבלת מספר מחזורי ההקפאה-הפשרה. להכנת דגימות להדמיית AFM, יש לכסות תחילה יריעת נציץ שטופה ב-200 מיקרוליטר של ניקל II סולפט מילי-מולרי אחד ולדגור את הסדין למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן הסר את התמיסה, יבש את המשטח באוויר דחוס והניח את צלחת הפטרי על קרח. לאחר מכן, הוסף בעדינות את כל ה-aliquot משבריר הריבית טיפה אחר טיפה על הנציץ. בעזרת קצה של 100 או 200 מיקרוליטר, מורחים את הדגימה על פני כל שטח הנציץ, ומדגרים את הדגימה על קרח למשך שלוש דקות.
לאחר מכן, כסו את יריעת הנציץ טיפה אחר טיפה ב-200 מיקרוליטר AFM מאגר קר ודגרו את הדגימה על קרח למשך שעה. שמירה על הדגימה ב-40 מעלות ושימוש במאגר קר שהוכנו במים נטולי RNase חשובים לשמירה על ארגון הפוליריבוזום. לאחר הדגירה, הסר בזהירות את המאגר ושטוף את הנציץ שלוש עד ארבע פעמים עם 200 מיקרוליטר AFM קר כדי להסיר עודפי סוכרוז.
לאחר מכן, שטפו את הנציץ שלוש פעמים בתמיסת כביסה קרה ונקזו את עודפי המים מהנציץ באמצעות נייר. ההסרה המלאה של סוכרוז מדגימות הסופג היא קריטית כעת לאחר שחתכת גם את הריבוזום וגם את ה-RNA העירום בפוליזום. השאירו את הדגימה לייבוש מתחת למכסה המנוע הכימי כשהחלק העליון של צלחת הפטרי פתוח חלקית.
לאחר שעתיים סוגרים את צלחת הפטרי. כעת ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורת החדר. חבר את הדגימה המוכנה למחזיק המדגם של ה-AFM באמצעות סרט דו צדדי.
לאחר מכן, הכנס את מחזיק המדגם ל-AFM tagבהתאם להוראות היצרן. לאחר הכיול, התקרב לדגימה עד שקצה השלוחה יתחבר למשטח. בחר אזור סריקה של שניים על שני מיקרון, רזולוציה של 512 x 512 פיקסלים לפחות, בחר מצב חיסור רקע חי ובחר סולם Z של 20-25 ננומטר.
לאחר מכן, התחל ברכישת תמונה. בדוק את התמונה, חפש נוכחות של עצמים עגולים המאופיינים בגובה שבין 10 ל -15 ננומטר בעת רכישת תמונות באוויר. לאחר מכן, התאם את נקודת ההגדרה ופרמטרי המשוב עד להדמיית אובייקטים חדים.
הרקע אמור להיראות שטוח יחסית בדגימות טובות עם עצמים בגובה של שניים עד ארבעה ננומטרים. ברגע שהתמונה נראית טוב, רכוש מספר סריקות שתיים על שתיים מיקרון באזורי דגימה שונים. לאחר שקיעת הסוכרוז על נציץ, AFM מספק תיאורי גודל מדויקים של פוליזומים בודדים המופיעים כאשכולות של ריבוזומים ארוזים היטב.
מבט מקרוב על אחת הפסגות הריבוזומליות באמצעות ניתוח חתך מגלה שגובה הפסגות הריבוזומליות הוא בסביבות 14 ננומטר. זה תואם את מה שנצפה בעבר עבור ריבוזומים ופוליזומים אנושיים לאחר ייבוש באוויר. בתמונה מימין, נעשה שימוש במאקרו כדי לזהות את מיקום הריבוזום ולסמן כל ריבוזום בעיגול אדום.
באמצעות מידע זה ניתן לנתח את התפלגות התדירות של מספר הריבוזומים לפוליזום. התפלגות ניסויית זו הותאמה לעקומה גאוס שמרכזה ב-5.8 ריבוזומים לפוליזום, עם סטיית תקן של 1.3. לאחר שליטה, טכניקה זו מריסוק מוח לרכישת תמונות פוליריבוזום יכולה להיעשות תוך פחות משמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את הדגימה על קרח ולהשתמש במאגרים קרים לתצהיר הדגימה על הנציץ. בעקבות הליך זה, ושימוש בתוסף ImageJ של מפתח כדי להפוך אותו לזמין במאמר שלך, אתה יכול לספור במדויק את מספר הריבוזום לכל פוליזום. לאחר כל פיתוח, טכניקה זו תסלול את הדרך להבנת הקינטיקה של היווצרות פוליזומים וזיהוי השינויים בארגון הפוליזומים ותנאי התא או הרקמה השונים שלהם.
לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג אלפי תמונות פוליזומים לניתוח ולימוד שיטתי של הארגון שלהם.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיית פוליזומים של יונקים באמצעות מיקרוסקופיה כוח אטומית (AFM). השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ללא צורך בקיבוע או תיוג של הדגימה.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה תאית
רקע
- ארגון הפוליזומים אינו נחקר מספיק למרות אפיון מבני נרחב של הריבוזומים.
- הבנת הארגון של הריבוזומים היא חיונית להבנת ויסות ביטוי הגנים.
- שיטה זו יכולה להיות מיושמת על אורגניזמים שונים, כולל שמרים וחיידקים.
- הדגמה חזותית חיונית עקב המורכבות של הטיפול בדגימות פוליזומליות.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול אמין להפרדה והדמיה של פוליריבוזומים במוח.
- להקל על חקר הבקרה התרגומית וביטוי הגנים.
- לאפשר הדמיה בתנאים קרובים לפיזיולוגיים.
שיטות ששימשו
- מיקרוסקופיה כוח אטומית (AFM) להדמיה.
- הפרדה של פוליריבוזומים במוח על מיקה.
- הדמיה ללא עיבוד פוסט אינטנסיבי או בנייה מחדש בתלת-ממד.
- טכניקות טיפול עבור ספיגה ושטיפה של הדגימות.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של פוליריבוזומים ברזולוציה ננומטרית.
- זיהוי של ריבוזומים וגדי רנ"א חשופים בדגימות.
- תובנות לגבי הארגון של פוליריבוזומים של יונקים.
- יישומים פוטנציאליים בחקר בקרה תרגומית באורגניזמים שונים.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את ההבנה של הארגון של הריבוזומים בפוליזומים.
- הוא מספק כלי חשוב לחוקרים החוקרים ביטוי גנים.
- היישום של השיטה על אורגניזמים שונים מרחיב את השפעתה.
