חיזוי ותיקוף של גן בקרה אלמנטים הופעל במהלך החומצה הרטינואית מושרה גזע עובריים התמיינות תאים

המטרה הכוללת של סרטון זה היא לספק סט משולב של שיטות לזיהוי ואימות ניסיוני של אלמנטים רגולטוריים גנומיים הנקראים משפרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשעתוק ובקרה של אירועים ביולוגיים, כולל בחירה ושימוש במשפר, שימוש בהתמיינות תאים או בתגובה לגירויים חיצוניים. היתרון העיקרי לזרימת העבודה המוצגת הוא שניתן להתאים פרוטוקול בקלות ולהשתמש בו בכל מערכת מודל סלולרי.

אדגים את שלבי ההליך. כדי להתחיל, בחר משפר מועמד על סמך ניתוח רצף שבבים קיים. השתמש בדפדפן גנום כדי להציג את תוצאות ניסוי רצף השבבים הרצוי, ולזהות אתרי קישור בקרבת הגן המעניין.

בחר הגדר אזור עניין כדי לקבל רצף של 200-400 זוגות בסיסים של האזור הגנומי שנבחר, והשתמש ברצפים לעיצוב פריימר עוקב. בעזרת טכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות, הגבירו ושכפל את האזור הגנומי שנבחר למבנה פלסמיד מדווח. כדי לבדוק את פעילות המשפר, העביר את מבנה המדווח לתאי גזע עובריים המוניים על ידי הוספת 200 מיקרו ליטר של תמיסת ג'לטין 0.1% לבאר ל-48 צלחות באר.

דגרו את הצלחות למשך 30 דקות לפני הציפוי. יום לפני הטרנספקציה, גזע עוברי ללא מזין צלחות, או תאי ES, ב-250 מיקרו ליטר של מדיום ES בצפיפות של שלוש פעמים 10 לתאים הרביעיים לבאר. ביום הטרנספקציה, הכינו את תערובות הפלסמיד, מה שמספיק לשמונה בארות מכל תערובת.

הוסף מדיום סרום מופחת באיכות טרנספקציה לכל תערובת פלסמיד כדי להביא את הנפח ל-106 מיקרו ליטר. לאחר מכן, הוסף 4.5 מיקרו ליטר של ריאגנט טרנספקציה באיכות ES, וערבב בזהירות על ידי פיפטינג 15 פעמים למעלה ולמטה. דגרו את תערובת הטרנספקציה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה מוסיפים לתאים 13 מיקרו ליטר לבאר מתערובת הטרנספקציה ומערבבים היטב על ידי פיפטינג. לאחר מכן, הכניסו את התאים בחזרה לאינקובטור במהלך הלילה לפני הטיפול בחזזיות. יעילות טרנספקציה היא צעד קריטי.

אם נעשה שימוש בסוג תא אחר, שלב זה דורש מיטוב. השתמש בסוג התא הרלוונטי ביותר כדי לבדוק את פעילות המשפר כדי למזער את ההשפעות תלויות ההקשר. למחרת, הסר בזהירות את המדיום על ידי שאיפה, והוסף 250 מיקרו ליטר של מדיום טרי לכל באר המכיל מיקרו טוחנת אחת של חומצה טראנס רטינואית, או DMSO כרכב.

דגרו על התאים למשך 24-48 שעות. לאחר הכנת מאגר ליזה על פי פרוטוקול הטקסט, שאפו בזהירות את המדיום מהתאים. השתמש ב-1X PBS כדי להעלות את התאים פעם אחת, ולאחר מכן הוסף 200 מיקרו ליטר של מאגר ליזה 1X לכל באר.

לנער את התאים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן, לליזה מלאה של התאים, הקפיאו את הליזאטים של התא בצלחת בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. לאחר הפשרה מלאה של הליזטים, השתמש בפיפט אלקטרוני רב ערוצי כדי להעביר 80 מיקרו ליטר של ליזט התא לצלחת שקופה של 96 באר עבור הבטא גלקטוזידאז, ו-40 מיקרו ליטר של הליזאט לצלחת לבנה למדידת לוציפראז.

כדי לבצע את הבטא גלקטוזידאז, מערבבים מיליליטר אחד של מאגר המצע בטא גל עם ארבעה מיליגרם OMPG. לאחר מכן, הוסף 3.5 מיקרו ליטר של בטא מרקפטואתנול לתערובת והוסף מיד 100 מיקרו ליטר של המאגר ל-80 מיקרו ליטר של ליזאט תאים. דגרו על התגובות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להתפתחות הצבע הצהוב הקלוש.

קרא את הספיגה ב-420 ננומטר על קורא לוחות, וייצא את הנתונים. כדי לבצע את בדיקת הלוציפראז, לאחר הכנת מגיב המצע על פי פרוטוקול הטקסט, יש לחמם את מגיב מצע הלוציפראז לטמפרטורת החדר לפני שמתחילים. לאחר מכן, הכניסו 100 מיקרו ליטר לכל באר של הצלחת הלבנה המכילה את 40 המיקרו ליטר של ליזאט התאים.

השתמש מיד במכונת מונה זוהרת כדי למדוד את האות. השג את הפעילויות מלפחות שלושה טרנספקציות וניסויים עצמאיים. בצע חישובים עבור שתי הבדיקות בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

כדי לעצב את הפריימרים לזיהוי eRNA על ידי RTCPR, בחר אזור גנומי שנמצא במרחק של לפחות 1.5 עד שני קילו בסיסים מכל תעתיקי גנים מבוארים. לזהות את הכיוון היחסי של הגן, ולקבוע את מיקום תעתיקי החישה והאנטי-חושים. כדי לעצב פריימרים לכימות ה-RNA המשפר, בחר אזורים 200-1,000 זוגות בסיסים ממרכז אתר קשירת גורם השעתוק.

אם הגן ממוקם על גדיל המינוס, העתק 200-300 זוגות בסיסים של הגדיל החיובי והמר את הרצף כדי לקבל את רצף המשלים ההפוך. לאחר מכן, השתמש ברצף זה לעיצוב פריימר לאחר מכן. הגדר את טווח מידות המוצר בין 80-150 זוגות בסיסים.

כדי למדוד שעתוק eRNA, לאחר בידוד ה-RNA הכולל מהתאים המטופלים על פי פרוטוקול הטקסט, זהה eRNA מתומלל הפוך על ידי RTCPR באמצעות הליך סטנדרטי. למדוד mRNA שאינו תלוי טיפול לנורמליזציה. כפי שמוצג כאן, ניתוח ביואינפורמטי של נתוני רצף שבב RXR שהתקבלו מתאי ES שטופלו בחומצה רטינואית חשף את ההעשרה של חצי אתר הקולטן הגרעיני מתחת לאתרים הכבושים ב-RXR.

באמצעות אלגוריתם ביואינפורמטיקה, תוצאות החיפוש של המוטיב עבור חצי האתר מופו בחזרה לנתוני השבב RXR. ניתוח זה זיהה פסגות שבב החופפות לאתרי קשירה של קולטנים גרעיניים קנוניים. הדמיה של האתרים ב-IGV הצביעה על העשרה של גורמי השעתוק הקרובים ל-Hoxa1.

יעד RAR RXR שאופיין בעבר. זוהה גם משפר עונשין לשרשרת יעד חדשה של RA, PRMT8. אזורי המשפרים שזוהו שובטו לווקטור מדווח TK luciferase, ותאי ES הועברו עם מבנים אלה.

פעילות לוציפראז נמדדה בהיעדר ובנוכחות של דלקת מפרקים מפרקים. המבנים המכילים את אלמנט תגובת ה-RA, או RARE, הראו עוצמת אות לוציפראז מוגברת בטיפול ב-RA, בעוד שהמבנה ללא ה-RARE לא הושרה. כדי לוודא אם ביטוי ה-eRNA החישתי והאנטי-חושי של משפר ה-Hoxa1 RAR RXR קשור לביטוי ה-mRNA של הגן, נמדדה גם רמת ה-eRNA של Hoxa1. התוצאות אישרו כי פעילות המשפר נגרמת על ידי טיפול קצר טווח בדלקת מפרקים שגרונית.

לאחר שליטה, ניתן לבצע עומס עבודה זה תוך מספר ימים על ידי ביצוע ניסוי מלכודת המשפר המתואר וכימות משפר, ניתן לספק ראיות פונקציונליות חזקות לפעילות משפר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות ולאפיין משפרי ענישה. לאחר זיהוי ותיקוף משפר, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון לכידת אישור כרומוזומלי, או CCC, על מנת לענות על שאלות חשובות נוספות, כמו איזה גן מווסת על ידי המשפר המאומת?