Name: חיזוי ותיקוף של גן בקרה אלמנטים הופעל במהלך החומצה הרטינואית מושרה גזע עובריים התמיינות תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: למדו לזהות ולאמת אלמנטים רגולטוריים גנומיים (enhancers) באמצעות ניתוח ChIP-seq ומערכות תאיות שונות. שיטה זו מאפשרת חקר תפקידם ברגולציית גנים ובהתמיינות תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד"ר בנס דניאל, מאט פלוקווין, ד"ר אנדרה ברטה, ד"ר באלינט ל באלינט וחברי מעבדת נאג'י על הדיונים וההערות על כתב היד. L.N נתמך על ידי מענקים מקרן המחקר המדעי ההונגרית (OTKA K100196 ו-K111941) ובמימון משותף של הקרן החברתית האירופית והקרן האירופית לפיתוח אזורי והתוכנית ההונגרית לחקר המוח - מענק מס. KTIA_13_NAP-א-י/9.

<ol><li>Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+enhancers%3A+new+insights+into+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Distal enhancers: new insights into heart development and disease.</a> Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers%3A+five+essential+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancers: five essential questions.</a> Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).</li>
<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+welcome+to+the+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: welcome to the new frontier.</a> Nature methods. 4, 613-614 (2007).</li>
<li>Muller, F., Tora, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+DNA+sequences+in+defining+promoters+for+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation.</a> Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).</li>
<li>Ounzain, S., Pedrazzini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+enhancer-associated+long+noncoding+RNAs+in+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration.</a> Trends Cardiovasc Med. , (2015).</li>
<li>Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNAs+and+regulated+transcriptional+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs.</a> Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).</li>
<li>Dickel, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function-based+identification+of+mammalian+enhancers+using+site-specific+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration.</a> Nature methods. 11, 566-571 (2014).</li>
<li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle%3A+the+role+of+MyoD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li>
<li>Vermunt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+coregulated+enhancer+networks+in+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports+9%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain.</a> Cell reports 9. , 767-779 (2014).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Mahony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-dependent+dynamics+of+retinoic+acid+receptor+binding+during+early+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis.</a> Genome Biol. 12 (R2), (2011).</li>
<li>Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+retinoic+acid+receptor+signaling+coordinates+lineage+commitment+of+spontaneously+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells+in+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies.</a> FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38, 576-589 (2010).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).</li>
<li>Daniel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+active+enhancer+network+operated+by+liganded+RXR+supports+angiogenic+activity+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages.</a> Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+enhancer+transcription+and+activity+from+chromatin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications.</a> Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).</li>
<li>Visel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+predictive+chromatin+signatures+of+transcriptional+promoters+and+enhancers+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 311-318 (2007).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470, 279-283 (2010).</li>
<li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li>
<li>Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+DNA-binding+and+transcriptional+activation+functions+in+the+human+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor.</a> Cell. 49, 39-46 (1987).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40, e115(2012).</li>
<li>Rhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+Genome+Browser+database%3A+update+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The UCSC Genome Browser database: update 2010.</a> Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465, 182-187 (2010).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+transcription+by+distinct+classes+of+enhancers+functionally+defined+by+eRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA.</a> Nature. 474, 390-394 (2011).</li>
<li>Simandi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+and+PRMT8+regulate+retinoic+acid-dependent+neuronal+differentiation+with+implications+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology.</a> Stem Cells. 33, 726-741 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בשנים האחרונות, התקדמות בטכנולוגיית הריצוף אפשרה חיזוי בקנה מידה גדול של משפרים בסוגי תאים ורקמות רבים 7-9. זרימת העבודה שתוארה לעיל מאפשרת לבצע אפיון ראשוני של משפרי מועמדים שנבחרו על סמך נתוני ChIP-seq. השלבים וההערות המפורטים יעזרו לכל אחד להגדיר אימות משפר שגרתי במעבדה.
השלב הקריטי ביותר במבחן הדיווח של לוציפראז הוא יעילות הטרנספקציה. מומלץ לכלול מבנה GFP על מנת להעריך את יעילות הטרנספקציה בכל ניסוי. איכות טרייה וטובה של פלסמידים יכולה להיות קריטית ויכולה לשפר משמעותית את הטרנספ...

התפתחות של אורגניזם רב-תאי דורשת ביטוי מווסת במדויק של אלפי גנים על פני רקמות מתפתחות. ויסות ביטוי הגנים מושג במידה רבה על ידי משפרים. משפרים הם רכיבי DNA קצרים שאינם מקודדים שיכולים להיות קשורים לגורמי שעתוק (TFs) ולפעול מרחוק כדי להפעיל שעתוק של גן מטרה1. משפרים הם בדרך כלל פועלים סיס ונמצאים לרוב ממש במעלה הזרם של אתר התחלת השעתוק (TSS), אך מחקרים אחרונים תיארו גם דוגמאות בהן משפרים נמצאו הרבה יותר במעלה הזרם, על 3' של הגן או אפילו בתוך האינטרונים והאקסונים2. 
ישנם מאות אלפי משפרים פוטנציאליים בגנום של בעלי חוליות1. שיטות עדכניות המבוססות על משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP) מספקות נתוני תפוקה גבוהה של הגנום כולו שניתן להשתמש בהם לניתוח משפר3-9. למרות שנתונים המתקבלים מניסויי ChIP-seq מגדילים מאוד את הסבירות לזהות משפרים ספציפיים לתאים ולרקמות, חשוב לזכור שאתרי קשירה שזוהו אינם בהכרח מזהים קשירת DNA ישירה ו/או משפרים פונקציונליים. לפיכך, ניתוח פונקציונלי נוסף של משפרים שזוהו לאחרונה הוא הכרחי. בעבודה זו, אנו מציגים תהליך בסיסי בן שלושה שלבים של זיהוי ואימות משפר פעיל משוער. זה כולל: 1) בחירת אתרי קשירה משוערים של גורם שעתוק על ידי ניתוח ביואינפורמטי של נתוני ChIP-seq, 2) שיבוט ואימות של רצפים רגולטוריים אלה במבנים מדווחים, ו-3) מדידת RNA משפר (eRNA). 
חשיפה של תאי גזע עובריים (ES) לחומצה רטינואית (RA) משמשת לעתים קרובות לקידום התמיינות עצבית של התאים הפלוריפוטנטיים 10. RA מפעיל את השפעותיו על ידי קשירה לקולטני RA (RARα, β, γ) וקולטני רטינואיד X (RXRα, β, γ). RARs ו-RXRs בצורה של הטרודימר נקשרים למוטיבים של DNA הנקראים אלמנטים של תגובת RA, המסודרים בדרך כלל כחזרות ישירות של רצף AGGTCA (הנקרא חצי אתר) ומווסתים את השעתוק. ניסויים בטיפול בליגנדים אפשרו זיהוי של מספר גנים המווסתים על ידי חומצה רטינואית בתאי ES 11,12. עם זאת, אלמנטים משפרים עבור רבים מהגנים הללו עדיין לא תוארו. כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש בזרימת העבודה המתוארת כאן לזיהוי ואימות משפרים, אנו מראים צעד אחר צעד את הבחירה והאפיון של שני משפרים תלויי חומצה רטינואית בתאי גזע עובריים.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA פולימראז</td><td>Merck Millipore</td><td>71085-3</td><td>להגברת PCR של משפר מ- gDNA</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & ערכת טישו&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>לבידוד DNA גנומי</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR מהירה QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>לטיהור מוצר PCR</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>למיצוי ג'ל אם יש יותר מוצר PCR</td></tr><tr><td>אנזים הגבלה</td><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td></tr><tr><td>אנזים הגבלה</td><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136L</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>שחרור של קבוצות 5'- ו-3'-פוספט מ-DNA</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>לקשירה</td></tr><tr><td>QIAprep ערכת Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>לבידוד פלסמיד</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ES media</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>ES media</td></tr><tr><td>MEM חומצת אמינו לא חיונית</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>ES מדיה</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>ES מדיה</td></tr><tr><td>בטא מרקפטואתנול</td><td>סיגמא</td><td>M6250</td><td>ES מדיה</td></tr><tr><td>FuGENE HD&nbsp;</td><td>מגיב טרנספקציה</td> <td>Promega</td><td>E2311</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>לטרנספקציה</td></tr><tr><td>All-trans חומצה רטינואית</td><td>סיגמא</td><td>R2625</td><td>ליגנד, להפעלת RAR/RXR</td></tr><tr><td>96-well צלחת</td><td>שקופה גריינר</td><td>655101</td><td>לבדיקת בטא גלקטוזידאז</td></tr><tr><td>96 בארות צלחת</td><td>לבנה גריינר</td><td>655075</td><td>לבדיקת לוציפראז</td></tr><tr><td>D-לוציפרין, מלח אשלגן</td><td>Goldbio.com</td><td>115144-35-9</td><td>לבדיקת לוציפראז</td></tr><tr>מלח<td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td><td>לבדיקת לוציפראז</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>לבדיקת לוציפראז</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>לבדיקת לוציפראז</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>431478-50G</td><td>לבדיקת בטא גלקטוזידאז</td></tr><tr><td>NaH2PO4 &#8226; H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638-25G</td><td>לבדיקת בטא גלקטוזידאז</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>לבדיקת בטא גלקטוזידאז</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>לבדיקת בטא גלקטוזידאז</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&beta;-D-galactosidase)</td><td>Sigma</td><td>N1127-1G</td><td>לבדיקת בטא גלקטוזידאז</td></tr><tr><td>TRIzol&reg;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>בידוד RNA</td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה</td><td>Life Technologies</td><td>4368814</td><td>שעתוק הפוך של eRNA</td></tr><tr><td>ללא Rnase Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>טיפול ב-Dnase</td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green</td><td>BioRad</td><td></td><td>750000105-RT-qPCR mastermix</td></tr><tr><td>CFX384 Touch&trade; מערכת זיהוי PCR בזמן אמת</td><td>מכונת BioRad</td><td></td><td>qPCR BioTek</td></tr><tr><td>Synergy 4 קורא מיקרו-פלטות</td><td>מונה זוהר</td> <td>BioTek</td><td></td></tr></tbody></table>

חיזוי ותיקוף של גן בקרה אלמנטים הופעל במהלך החומצה הרטינואית מושרה גזע עובריים התמיינות תאים

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

התפתחות עוברת היא תהליך רב שלבי מעורבי הפעלה ודיכוי של גנים רבים. אלמנטים Enhancer בגנום ידועים לתרום תקנה רקמות תאים מסוג מסוים של ביטוי גנים במהלך התמיינות תאים. לכן, זיהוי שלהם לחקירה נוספת חשוב על מנת להבין כיצד גורל תא נקבע. אינטגרציה של נתוני ביטוי גנים (למשל, microarray או RNA-seq) ותוצאות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) מחקרים הגנום כולו מבוסס (שבב seq) מאפשרת זיהוי בקנה מידה הגדולה של אזורים רגולטוריים אלה. עם זאת, אימות פונקציונלית של משפר ספציפי תא מהסוג דורשת עוד במבחנת פרוצדורות vivo. כאן אנו מתארים כיצד משפרים פעילים ניתן לזהות ומאומתים באופן ניסיוני. פרוטוקול זה מספק עבודה צעד-אחר-צעד, הכוללת: 1) זיהוי של אזורים רגולטוריים על ידי ניתוח נתונים שבב seq, 2) שיבוט experאימות imental פוטנציאל רגולציה משוערת של רצפי הגנום המזוהים ב assay כתב, ו -3) קביעת הפעילות משפר in vivo על ידי מדידת רמת תעתיקי הרנ&quot;א משפר. הפרוטוקול המובא מפורט מספיק כדי לעזור למישהו להקים זרימת עבודה זו במעבדה. חשוב לציין כי הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות והשתמש בכל מערכת מודל הסלולר.

השתמשנו נוגדני RXR הפאן הספציפיות על מנת לזהות גנים יש עשר קולטן אשר הגנום כולו מוסדר RA בסמיכות שלהם. ניתוח ביואינפורמטיקה של נתונים שבב seq RXR המתקבל תאים ES שטופלו החומצה הרטינואית חשף את העשרת האתר חצי רצפטור גרעיני (AGGTCA) תחת RXR הכבושים אתרים (איור 1). באמצעות אלגוריתם ביואינפורמטיקה מיפינו חזרה לתוצאות חיפוש מוטיב עבור אתר חצי לנתונים RXR שבב seq (איור 2). ניתוח זה עזר לנו לזהות את אלה שבב פסגות במדויק אי...

בעבודה זו אנו מספקים זרימת עבודה ניסיונית כיצד ניתן לזהות משפרים פעילים ולאמת אותם בניסוי.

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

המטרה הכוללת של סרטון זה היא לספק מערך משולב של שיטות לזיהוי ותיקוף ניסיוני של אלמנטים בקרה גנומיים המכונים enhancers. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתהליכי תעתוק ובבקרה של אירועים ביולוגיים, כולל בחירת enhancers ושימוש בהם, במהלך התמיינות תאים או כמענה לגירויים חיצוניים. היתרון המרכזי של זרימת העבודה המוצגת הוא שניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות ולהשתמש בו בכל מערכת של מודלים תאיים.אדגים את שלבי הפרוצדורה. כדי להתחיל, בחרו מאיץ מועמד על בסיס ניתוח chip seq קיים. השתמשו בדפדפן גנומי כדי לצפות בתוצאות ניסוי ה-chip seq הרצוי, וזהו אתרי קישור בסמיכות לגן המדובר.יש לבחור ב-Define a Region of Interest כדי לקבל רצף של 200-400 זוג בסיסים של האזור הגנומי שנבחר, ולהשתמש ברצפים לתכנון ראשונים (primers) בהמשך. באמצעות טכניקות סטנדרטיות של ביולוגיה מולקולרית, יש להגביר ולהשבית (clone) את האזור הגנומי הנבחר לתוך סמיסטראקט של פלסמיד ד reporter. כדי לבחון פעילות של מחזקים (enhancers), יש להחדיר (transfect) את סמיסטראקטי ה-reporter לתאי גזע עובריים של עכבר, תחילה על ידי הוספה של 200 µL של תמיסת ג'לטין בריכוז 0.1% לכל באר בפלטות בעלות 48 באערים.הדגרירו את הפלטות למשך 30 דקות לפני הזריעה. ביום שלפני התעתוק (transfection), זרעו תאי גזע עובריים (ES cells) ללא תאי מאכיל (feeder-free) ב-250 µL של מצע ES בצפיפות של 3×10⁴ תאים לבאר. ביום התעתוק, הכינו את תערובות הפלסמידים, בכמות המספיקה לשמונה בארות מכל תערובת.הוסיפו מצע סרום מופחת באיכות טרנספקציה לכל תערובת פלסמיד כדי להעלות את הנפח ל-106 micro liters. לאחר מכן, הוסיפו 4.5 micro liters של ריאגנט טרנספקציה באיכות ES, וערבבו בזהירות באמצעות 15 פעולות שאיבה ושחרור (pipetting) למעלה ולמטה. הדגירו את תערובת הטרנספקציה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, הוסף 13 µL לכל באר של תערובת הטרנספקציה לתאים וערבב היטב באמצעות פיפטה. לאחר מכן, החזר את התאים למדגרה למשך הלילה לפני הטיפול בחזזית. יעילות הטרנספקציה היא שלב קריטי.במידה ונעשה שימוש בסוג תא אחר, שלב זה דורש אופטימיזציה. השתמשו בסוג התא הרלוונטי ביותר לבדיקת פעילות המגביר (enhancer) כדי למזער השפעות תלויות-הקשר. למחרת, הסירו בזהירות את המצע באמצעות שאיבה, והוסיפו 250 µL של מצע טרי לכל באר, המכיל 1 µM של all trans retinoic acid, או DMSO כנושא (vehicle).דגרו את התאים למשך 24-48 שעות. לאחר הכנת תמיסת ליזיס (lysis buffer) בהתאם לפרוטוקול הכתוב, שאבו בזהירות את המצע מהתאים. השתמשו ב-1X PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת, ולאחר מכן הוסיפו 200 µL של 1X lysis buffer לכל באר.שקשקו את התאים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן, לצורך ליסיס מלא של התאים, הקפיאו את הליסיטים של התאים בתוך הפלטה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לאחר הפשרה מלאה של הליסיטים, השתמשו בפיפט רב-ערוצי אלקטרוני כדי להעביר 80 µL של הליסיט התאי לפלטה שקופה בעלת 96 בארות למדידת beta galactosidase, ו-40 µL של הליסיט לפלטה לבנה למדידת לוסיפרז.כדי לבצע את בדיקת ה-beta galactosidase, ערבבו מיליליטר אחד של בופר סובסטרט beta gal עם ארבעה מיליגרמים של OMPG. לאחר מכן, הוסיפו לתערובת 3.5 µL של beta mercaptoethanol והוסיפו מיד 100 µL מהבופר ל-80 µL של ליסאט תאים. דגרו את התגובות בטמפרטורה של 37 °C עד להופעת צבע צהוב חיוור.מדדו את הבליעה באורך גל של 420 nano meters באמצעות קורא פלטות, וייצאו את הנתונים. לביצוע בדיקת הלוסיפראז (luciferase assay), לאחר הכנת ריאגנט התסבס (substrate reagent) לפי הפרוטוקול הכתוב, חממו את ריאגנט התסבס של הלוסיפראז לטמפרטורת החדר לפני התחלת העבודה. לאחר מכן, העבירו בפיפטה 100 micro liters לכל באר בפלטה הלבנה המכילה 40 micro liters של ליסאט תאים.השתמשו מיד במכשיר מדידה לומניסצנטי כדי למדוד את האות. השגיעים את הפעילויות מתוך לפחות שלושה טרנספקציות וניסויים עצמאיים. בצעו את החישובים עבור שני המבחנים בהתאם לפרוטוקול הכתוב.כדי לתכנן את הפריימרים לזיהוי eRNA באמצעות RT-qPCR, יש לבחור אזור גנומי המרוחק לפחות 1.5 עד שני kilo bases מכל תמליל של גן מאותם (annotated). זהו את הכיוון היחסי של הגן, וקבע את מיקומי התמלילים של רצף ה-sense וה-anti-sense. לתכנון פריימרים עבור כימות של ה-enhancer RNA, בחר אזורים במרחק של 200-1,000 base pairs ממרכזו של אתר הקישור לגורם השעתוק (transcription factor binding site).אם הגן ממוקם על הגדיל השלילי (minus strand), העתיקו 200-300 זוגות בסיסים מהגדיל החיובי והמירו את הרצף כדי לקבל את רצף המשלימה ההפוכה (reverse complement). לאחר מכן, השתמשו ברצף זה לתכנון הפריימרים בהמשך. הגדירו את טווח גודל המוצר (Product Size Range) בין 80-150 זוגות בסיסים.כדי למדוד שעתוק של eRNA, לאחר בידוד RNA כולל מתאים מטופלים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, גלו eRNA שעבר שעתוק הפוך באמצעות RT-PCR תוך שימוש בהליך סטנדרטי. מדדו mRNA שאינו תלוי בטיפול לצורך נורמליזציה. כפי שמוצג כאן, ניתוח ביואינפורמטי של נתוני RXR chip-seq שהתקבלו מתאי ES שטופלו בחומצה רטינואית חשף העשרה של אתר חצי (half site) של קולטן גרעיני תחת אתרים מאוישים על ידי RXR.באמצעות אלגוריתם של ביואינפורמטיקה, תוצאות חיפוש המוטיבים עבור מחצית האתר (half-site) מופו חזרה אל נתוני ה-chip seq של RXR. ניתוח זה זיהה פסגות (peaks) של chip החופפות לאתרי קישור קנוניים של קולטנים גרעיניים. ויזואליזציה של האתרים ב-IGV הצביעה על העשרה של גורמי שעתוק בקרבת Hoxa1.מטרה של RAR RXR שאופיינה בעבר. כמו כן, זוהה מחזק (enhancer) פונקטיבי עבור שרשרת מטרות RA חדשה, PRMT8. אזורי המחזקים שזוהו שוכפלו לתוך וקטור דוח (reporter vector) של TK luciferase, ותאי ES עברו טרנספקציה עם מבנים אלו.פעילות לוקיפראז נמדדה בהיעדר ובנוכחות של RA. הקונסטרוקטים הכוללים את אלמנט התגובה ל-RA, או RARE, הראו עלייה בעוצמת אות הלוקיפראז לאחר טיפול ב-RA, בעוד שהקונסטרוקט ללא ה-RARE לא עבר השראה. כדי לבדוק האם ביטוי eRNA בחוש (sense) ובנגד-חוש (anti-sense) של המגביר הקשור ל-Hoxa1 RAR RXR נמצא במתאם עם ביטוי ה-mRNA של הגן, נמדדה גם רמת ה-eRNA של Hoxa1. התוצאות אישרו כי פעילות המגביר מופעלת על ידי טיפול קצר מועד ב-RA.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע עומס עבודה זה תוך מספר ימים; על ידי ביצוע ניסוי מלכודת המגברים (enhancer trap) והכימות של המגבר כפי שתוארו, ניתן לספק ראיות תפקודיות חזקות לפעילות המגבר. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות ולאפיין מגברים פונקטיביים. ברגע שמגבר זוהה ואומת, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון לכידה לאישור כרומוזומלי, או CCC, כדי לענות על שאלות חשובות נוספות, כגון איזה גן מ 의해 מוסדר על ידי המגבר המאומת?

prediction-validation-gene-regulatory-elements-activated-during

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

אנו מתארים assay כתב הקרינה במהירות לזהות ולאפיין את הגנים המווסתים גזע עובריים של עכברים תא תחזוקה עצמית והתחדשות.

Oct4GiP Assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות

הסרטון מדגים את השיטה להשראת התמיינות תאי גזע לאבות עצביים באמצעות חומצה רטינואית ושיטת תרבית הטיפות התלויות.

התמיינות תאי גוף עובריים לאבות עצביים באמצעות חומצה רטינואית

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת פעילות חומצה רטינואית בעוברי עכברים. לאחר בידוד התאים מעוברי העכברים, התאים עוברים תרבית משותפת עם תאי כתב חומצה רטינואית (RA). תאים עובריים מייצרים RA, אשר גורם לביטוי בטא-גלקטוזידאז בתאי כתב, מה שמעיד על פעילות RA בתאים העובריים.

העסקת תאי כתב בתרבית משותפת לחקר ייצור חומצה רטינואית על ידי תאים עובריים של עכברים

שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

ניתן להשיג מניפולציה של ביטוי גנים טמפורלי בהתמיינות תאי גזע עובריים (ESCs) באמצעות מערכות גנים הניתנות להשראה. עם זאת, יצירת קווי תאים אלה היא יקרה וגוזלת זמן. פרוטוקול זה משיג ביטוי מהיר של טרנסגן בהתמיינות תאים שמקורם ב-ES וניתוח לאחר מכן של התמיינות המטופויאטית במורד הזרם.

זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות

כאן אנו מתארים שיטה לטיהור של תאי גזע עובריים אנושיים הבדילו כי מחויב כלפי האנדודרם הסופי לשיפור יישומים במורד בידול נוסף.

שיטה מהירה ויעילה עבור טיהור של תאים האנדודרם המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים

שיטות למדידה מדויקת של רמות חומצה רטינואית (RA) בכמויות קטנות של רקמה אינן קיימות. פרוטוקול זה מתאר מדידה קלה וכמותית של רמות RA יחסיות בעוברים E8.5 ונוירוספרות באמצעות קו תאים מדווח RA.

מדידה כמותית של רמות חומצה רטינואית יחסית ב E8.5 עוברים neurosphere תרבויות באמצעות assay Reporter F9 נדיר- lacZ מבוססי תאים

אנו מתארים שיטה לשימוש בתאי גזע עובריים בעכברים ליצירה שניים או שלושה גופי embryoid ממדים. לאחר מכן נסביר כיצד להשרות התמיינות עצבית של תאי הגוף Embryoid ידי חומצה רטינואית, וכיצד לנתח מצב הבידול שלהם על ידי immunofluorescence סמן תא אב ו immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

בדיקת החרוזים הספוגים כוללת אספקה ממוקדת של ריאגנט הבדיקה בכל נקודת זמן התפתחותית כדי לחקור את ויסות התמיינות התאים והמורפוגנזה. מוצג פרוטוקול מפורט, החל על כל מודל ניסיוני של בעלי חיים, להכנת שלושה סוגים שונים של חרוזים מושרים והשתלתם באינטרדיגיט של עובר עוף.

ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

למדו לזהות ולאמת אלמנטים רגולטוריים גנומיים (enhancers) באמצעות ניתוח ChIP-seq ומערכות תאיות שונות. שיטה זו מאפשרת חקר תפקידם ברגולציית גנים ובהתמיינות תאים.

חיזוי ותיקוף של גן בקרה אלמנטים הופעל במהלך החומצה הרטינואית מושרה גזע עובריים התמיינות תאים

גלה סרטונים נוספים