שיטה מהירה ויעילה עבור טיהור של תאים האנדודרם המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים

המטרה הכללית של שיטה זו היא לטהר תאי אנדודרמה שהופקו מתאי גזע עובריים אנושיים (ES cells). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום תאי הגזע בנוגע לדיפרנציאציה אנדודרמלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג אוכלוסייה טהורה של תאי אנדודרמה לאחר הסרת תאים שאינם מובחנים.

לפני תחילת הפרוצדורה, יש לצפות שש פלטות תרבית תאים בעלת בארות ב-1 ml של basement membrane matrix לכל בארה, למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, כדי לקצור את תאי ה-ES האנושיים, יש לשאוב את המצע מתרבית תאי גזע עובריים אנושיים בהסמיכות (confluency) של 80% עד 90% באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית סטרילית.

שטפו את התאים עם 2 mL של PBS לכל באער. נערה את הפלטה ושאבו את התמימה המלוחית כדי להסיר תאים מתים ופסולת. לאחר מכן, פרקו בעדינות את מקבצי התאים באמצעות 1 mL של תמיסת מעבר (passaging solution) ללא אנזימים, בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide, עד שהתאים מראים סימנים ברורים של פירוק למקבצים קטנים יותר.

לאחר כמעט שבע דקות, הוסיפו מיליליטר אחד של מצע DMMF12 לבארות. בצעו פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים עם טיפ של פיפט של מיליליטר אחד כדי לשחרר את שארית תצבירי התאים לסuspended תלייה של תאים בודדים. באמצעות אותה פיפט, העבירו את התאים למבובת צנטריפוגה ושטפו את הבארות עם מיליליטר אחד של מצע DMMF12 טרי, תוך איסוף השטיפות לתוך המבובת.

לאחר ספינטדאון של התאים, השעו מחדש את המשקע בחמישה מיליליטר של מצע גידול לתאי ES המועשר ב-ROCK inhibitor. ספרו את התאים והזריעו 1.5-4×10⁵ תאים לבאר על פלטות מצופות בבסיס ממבנה הממברנה (basement membrane matrix) במצע גידול המועשר ב-ROCK inhibitor למניעת אפוֹפּטוזיס. דגרו את התאים למשך כ-24 שעות.

לאחר מכן, השתמשו בפיפט פסטור מזכוכית סטרילית כדי להחליף את המצע בכל באר ב-2 milliliters של מצע להשראת פס ראשוני (primitive streak induction medium). לאחר 24 שעות נוספות של תרבית, החליפו את המצע במצע להשראת אנדודרמה (endoderm induction medium) לדגירה של 48 שעות עם החלפות מצע יומיות. ביום האחרון של התרבית ולפחות שעה אחת לפני קצירת התאים, הוסיפו מעכב ROCK טרי למצע התרבית.

לאחר מכן, השתמשו בפיפט פסטור מזכוכית סטרילית כדי לשאוב את המצע מכל אחת מהבארות, והפרידו את התאים באמצעות תמיסת מעבר ללא אנזימים כפי שהודגם זה עתה. כאשר הושגה סספנסיה של תאים בודדים, ספרו את התאים וסובבו אותם בצנטריפוגה. ודאו שמרגע זה ואילך, כל המצעים והבופרים מכילים ROCK inhibitor כדי למנוע את מות התאים.

אחר כך, הם לא ייצמדו כראוי לאחר הנסיגה. השביו מחדש את המשקע ב-100 microliters של בופר PEB, בתוספת מעכב ROCK עבור 1 times 10 to the seventh תאים. לאחר מכן, הוסיפו לתאים נוגדן CXCR4 APC.

נקישה עדינה של המבחנה כדי לערבב. לאחר 15 דקות ב-4 °C, שטפו את התאים ב-1 עד 2 מיליליטר של בופר PEB והשתמשו בפיפט פסטור זכוכית סטרילי כדי לשאוב את העילוי. השעו מחדש את המשקע ב-80 µl של בופר PEB לכל 1×10⁷ תאים והוסיפו לתאים 20 µl של חרוזי מיקרו anti-APC.

ערבבו את הדגימה באמצעות נקישות עדינות. לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות. בסיום הדגירה, שטפו את התאים עם 1-2 mL של בופר PEB בתוספת מעכב ROCK.

שחזר את המשקע ב-500 microliters של תמיפת PEB טרייה בתוספת מעכב. כדי לבודד תאי +CXCR4 באמצעות הפרדה של חרוזי מגנט, טען עמודת מגנט בגודל בינוני על מגנט מתאים ושטוף מראש את העמודה עם 500 microliters של תמיפת PEB בתוספת מעכב ROCK. לאחר שכל נוזל השטיפה התנקז מחלק העליון של העמודה, העבר את כל נפח התאים המסומנים בחרוזי מגנט אל העמודה, ואסוף את הנוזל העובר לפרועת קונוית.

שטפו את העמודה בשלוש הפעלות של 500 µL של באפר PEB בתוספת מעכב ROCK. לאחר מכן, העבירו את העמודה מהמגנט לשפופרת איסוף מתאימה. העבירו 1 mL של באפר PEB בתוספת מעכב ROCK דרך העמודה כדי לאסוף את תאי ה-CXCR4+.

באופן רב גוני, ניתן לאסוף את כל דגימות השטיפה (flow through) בנפרד, ולהשתמש במכסות (aliquots) של 20 microliter מכל דגימה כדי לקבוע את אחוז התאים CXCR4+ בכל מכסה באמצעות ציטומטריה של זרימה. ניתן לחזור על הליך זה עם השטיפה הראשונה כדי לאסוף תאים שלא נקשרו לעמודה. לאחר מכן, יש לאחד את כל דגימות ה-CXCR4+ שנלקחו ולסבב אותן בצנטריפוגה.

לבסוף, השעו מחדש את המשקע במיליליטר אחד של מצע השראה לאנדודרם (endoderm) בתוספת מעכב ROCK, וזרעו את התאים בצפיפות המתאימה בכלי לתרבית תאים מצופה במטריצת ממбраנה בסיסית. טרם התמיינותם, תאי ES אנושיים מביעים רמות גבוהות של סמן הרב-פוטנציאליות SOX2, בעוד שהסמן של האנדודרם הסופי, FOXA2, אינו מזוהה.

בעת הגבייה, תאי ה-ES עוברים שינויים דרסטיים בביטוי הגנים והחלבונים שלהם. ואכן, לאחר ארבעה ימים במצע גבייה, SOX17 ו-FOXA2 מבוטאים יחד באופן אחיד בגרעיני רבים מתאי ה-ES לשעבר, סימן היכר למחויבות לאנדודרמה דפיניטיבית. חלק מהתאים עמידים לתהליך הגבייה, ואינם מבטאים אף אחד משני חלבוני הסימון.

ולמעשה, הם שומרים על ביטוי של SOX2, סמן הפלוריפוטנציות שלהם. בניסוי מייצג זה, ביום השלישי של הדפרנציאציה, כמעט 60% מתאי ה-ES שנאספו ביטאו CXCR4, אשר טהרתו הועשרה למעל 85% לאחר מיון של תאי פלוריפוטנציה ותאי שושלות אחרים בלתי רצויים באמצעות חרוזי מגנט. לאחר זריעת תאי CXCR4+ המופקדים, מזוהים רק מספר מצומצם של תאי SOX2+, כאשר רוב התאים שנזרעו מבטאים FOXA2.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להשלימה תוך שעתיים, במידה שהיא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות דומות, כגון אימונוהיסטוכימיה או QPCR, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לתהליך הדיפרנציאציה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן טיהור תאי אנדודרם באמצעות מיון של חרוזי מגנט.