הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות Pseudomonas aeruginosa

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות מולקולות קטנות המווסתות את הרמות התוך תאיות של השליח השני ציקלי-די-GMP בפתוגן האופורטוניסטי, Pseudomonas aeruginosa באמצעות מסך ביו-מדווח בעל תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע בחשיפת מולקולות קטנות המפריעות למידע הביולוגי של Pseudomonas aeruginosa וחלקיקים אחרים באמצעות אפנון מחזורי-di-GMP. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא חזקה ורב-תכליתית מאוד, ומאפשרת הקרנה של למעלה מ-3,500 תרכובות תוך 48 שעות.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על פיתוח טיפולים חדשניים שעלולים להיות רגישים ל-Pseudomonas aeruginosa, למערכת החיסון או לאנטיביוטיקה קיימת תוך הפעלת לחץ פחות סלקטיבי על החיידקים. לחסן חמישה מילילטרים של מרק ליזוגני, או מדיום LB, עם מושבה אחת של P.aeruginosa, שבע מעלות צלזיוס, עם טלטול ב-200 סל"ד. לאחר מכן, העבירו שני מיליליטר מתרבית הלילה ל-200 מיליליטר של מדיום LB טרי בבקבוק של ליטר אחד, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד.

עקוב אחר הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר או OD 600, כל 30 דקות על ידי לקיחת דגימה של 1 מיליליטר מהבקבוק ובדיקה באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר ה-OD 600 מגיע בין 0.3 ל-0.5, הנח 40 מילילטר של התרבית לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 8000 סל"ד למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-40 מיליליטר של תמיסת סוכרוז סטרילית קרה כקרח של 300 מילי-מולאר. לאחר צנטריפוגה של התאים בפעם השנייה, השעו מחדש ב-20 מיליליטר של תמיסת סוכרוז סטרילית של 300 מילי-מולרית צנטריפוגה שוב את התאים והשעו מחדש ב-400 מיקרוליטר מתמיסת סוכרוז 300 מילי-מולארי. מצננים את התאים על קרח למשך 30 דקות, ולאחר מכן הם מוכנים לאלקטרופורציה.

לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסה של 0.2 מיקרוגרם למיקרוליטר של פלסמיד המקודד את מקדם ה-CdrA לגן המקודד את החלבון הפלואורסצנטי הירוק ל-40 מיקרוליטר של התאים המוכשרים האלקטרו-מוכשרים P.Aeruginosa בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר שצונן מראש על קרח. מערבבים את המתלה ומעבירים אותו לקוביית אלקטרודה מקוררת מראש של 2 מילימטר. הסר לחות בחלק החיצוני של הקובט בעזרת נייר טישו והנח את הקובט בתא הדגימה של האלקטרופורטור.

דופק את התמיסה במתח של 2.5 קילו-וולט, קבלים של 25 מיקרופאראד והתנגדות של 200 אוהם. הסר את הקובט והוסף מיליליטר אחד של מדיום LB. לאחר מכן, העבירו את התאים לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר ודגרו במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד.

לאחר הדגירה, מורחים 10 מיקרוליטר, 50 מיקרוליטר ו-100 מיקרוליטר של התרבית על צלחות אגר LB סטריליות המצורפות באמפיצילין ודוגרים על הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אשר את ביטוי ה-GFP על ידי בחינת הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערוץ GFP סטנדרטי. בחר מושבה אחת וחסן בחמישה מיליליטר LB. לאחר הדגירה של הלילה, מערבבים 0.5 מיליליטר מתרבית הלילה עם 0.5 מיליליטר של 50% גליצרול בצינור הברגה של 2 מיליליטר ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס.

יומיים לפני המסך, צלחו את זן P.aeruginosa המוכן ממלאי מינוס 80 מעלות צלזיוס על צלחת אגר LB על ידי פיזור עדין של החיידקים על הצלחת באמצעות לולאת חיסון סטרילית. דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. בערב שלפני ההקרנה, חסנו מושבה אחת של P.aeruginosa מהצלחת לתוך 10 מיליליטר של מדיום LB בשפופרת.

דגרו את טרום התרבית למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד. ביום המסך, הכינו תת-תרבות מתרבית הלילה על ידי דילול תחילה במדיום LB טרי ל-OD 600 של 1.0, ולאחר מכן דילול נוסף עם 5% LB ל-OD 600 של 04. הוסף מוט ערבוב מגנטי סטרילי למיכל וערבב את התרבית במהירות מינימלית על מערבל מגנטי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

זה מאפשר לחיידקים להתאקלם למדיה לפני שהם מופצים לצלחות של 384 בארות. להכנת הבקרה החיובית, הוסיפו 20 מיקרוליטר של טוברמיצין סולפט ל-10 מיליליטר מתת-התרבית המוכנה וערבבו בעדינות. פיפטה 40 מיקרוליטר של תרבית הבקרה החיובית לבארות A23 עד P23.

להכנת הבקרה השלילית, הוסיפו 30 מיקרוליטר דימתיל סולפוקסיד ל -10 מיליליטר מתת-התרבות המוכנה וערבבו בעדינות. פיפטה 40 מיקרוליטר של תרבית הבקרה השלילית לבארות A24 עד P24. עבור כל אחת מהצלחות המורטבות במולקולות הקטנות, יש לחסן נפח של 40 מיקרוליטר מתרביות הלילה המדוללות לבארות A1 עד P22.

אוטמים את הצלחות עם אטם כיסוי חדיר אוויר ודוגרים במשך שש שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס. כ-30 דקות לפני המדידה הספקטרופוטומטרית יש לחמם מראש את קורא הלוחות ל-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע עיבוי. הסר בעדינות את אטם הכיסוי החדיר לאוויר מהצלחת לפני הקריאה.

לאחר מכן מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לבאר וזמן התייצבות של 0.2 שניות. לפני מדידת הקרינה, בצע התאמת רווח ומוקד אוטומטית על סמך באר הבקרה השלילית A24 והגדר את ערך יעד הרווח ל-75%בחר התאמת מיקוד וערוץ A בצד ימין של החלון. מדוד את הקרינה ממדווח ה-GFP בעירור מקסימלי של 485 ננומטר ופליטה מקסימלית של 520 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לבאר וזמן שקיעה של 0.2 שניות.

אסוף נתונים מכל הלוחות שנבדקו. קריאות הנתונים נשמרות אוטומטית כברירת מחדל על ידי תוכנת בקרת קורא הלוחות. כדי לנתח את הנתונים, צפה בקריאות על ידי לחיצה על סמל מאדים בתוך תוכנת הבקרה כדי לפתוח את חבילת הניתוח הסטטיסטי.

אחזר נתונים על ידי לחיצה כפולה על מספר הלוחית המעניינת כדי לגשת לנתונים לניתוח. הערך את האחידות והשחזור של הבדיקה באמצעות ניתוח ראשוני Z חזק. לאחר מכן, חשב את אחוז עיכוב הצמיחה והעריך את אחוז העיכוב של הרמה התוך-תאית של c-di-GMP כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

איור זה מתאר נתונים גולמיים מייצגים עבור OD 600 ו-GFP ממסך התפוקה הגבוהה. מפת חום שיפוע צבע עם צבעים חמים עד קרים המציינים ערכים נמוכים עד גבוהים הוחלה על ערכי הבאר. הנתונים שנוצרו מנותחים לעיכוב באחוזים ומיוצגים כאן הן עבור קריאות OD 600 והן עבור GFP.

מולקולות קטנות שעלולות לעכב צמיחה ו-c-di-GMP תוך-תאי נוטות להיות בצבע ירוק, בעוד שמולקולות קטנות שעלולות לקדם צמיחה ורמות c-di-GMP תוך-תאיות נוטות להיות בצבע אדום. תרשימי פיזור משמשים להשוואת אחוז העיכוב המתקבל מכל מולקולה קטנה שנבדקה. כל מולקולה קטנה מיוצגת על ידי נקודה קטנה ומוצגת התפלגות אחוזי העיכוב עבור כל אחת מקריאות OD 600 ו-GFP.

חיתוך פלוס מינוס 50% נבחר לזיהוי פגיעות. פגיעות פוטנציאליות מודגשות באדום. מבחני מינון-תגובה מתבצעים על כל תרכובת מעניינת.

כאן, שתי תרכובות שזוהו נבדקות בבדיקת תגובת מינון של 10 נקודות עם ריכוז עליון של שני מילימולר וסדרת דילול כפולה. התאמת פונקציה לוגיסטית של ארבעה פרמטרים לנתונים, הניבה ערכי ריכוז מעכב חצי מקסימלי עבור כל תרכובת של 158 מיקרומולר ו-193 מיקרומולר. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לסנן למעלה מ-3,500 תרכובות תוך 48 שעות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנן בצורה חזקה Pseudomonas aeruginosa עבור תרכובות המפריעות לאיתות מחזורי di-GMP. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תנאי ההקרנה דומים בעת הקרנה במשך מספר ימים. מעקב אחר מסך נקודתי יחיד המפעיל מסך תגובת dirsk באמצעות אותו פרוטוקול יכול לאמת את הכניסות.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לזהות מולקולות קטנות פוטנציאליות המפריעות למידע דו-צדדי של Pseudomonas aeruginosa ועמידות לאנטיביוטיקה. חשוב לציין, ניתן להתאים את הטכניקה הזו לשימוש עבור כל חיידק מעניין וניתן לשנות אותה כדי לבחון תפוקות או תשומות אחרות כגון השפעה על כדאיות החיידקים. לבסוף, אל תשכח שעבודה עם Pseudomonas aeruginosa עלולה להיות מסוכנת.

ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.