הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות מולקולות קטנות המווסתות את הרמות התוך-תאיות של השליח השני cyclic-di-GMP בפתוגן האופורטוניסטי, Pseudomonas aeruginosa, באמצעות סריקת ביו-רפורטר (bio-reporter) בסבב גבוה. שיטה זו יכולה לסייע בחשיפת מולקולות קטנות המפריעות למידע הביולוגי של Pseudomonas aeruginosa, וחלקיקים אחרים, באמצעות ויסות של cyclic-di-GMP. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא חסונה ורב-גונית מאוד, ומאפשרת סריקה של למעלה מ-3,500 תרכובות בתוך 48 שעות.

ההשלכות של טכניקה זו נשמעות לפיתוח טיפולים חדשניים שעשויים להגביר את הרגישות של Pseudomonas aeruginosa למערכת החיסון או לאנטיביוטיקה קיימת, תוך הפעלת לחץ סלקטיבי נמוך יותר על החיידקים. יש להוסיף מושבה בודדת של P.aeruginosa ל-5 mL של מרק ליסוגני, או מצע LB, ולהדגיר ב-37 °C תוך ניעור ב-200 rpm. לאחר מכן, יש להעביר 2 mL מהתרבית של הלילה ל-200 mL של מצע LB טרי בבקבוק של 1 L, ולהדגיר ב-37 °C תוך ניעור ב-200 rpm.

נטרו את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר או OD 600, מדי 30 דקות, על ידי לקיחת דגימה של 1 milliliter מהבקבוק ובדיקתה באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר ה-OD 600 מגיע לערך שבין 0.3 ל-0.5, העבירו 40 millileters מהתרבית לשפופרת צנטריפוגה קונוית של 50 mililiter. השקיעו את התאים באמצעות צנטריפוגציה במהירות של 8000 rpm למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.

יש להסיר את הנוזל העליון ולסבנסיד (resuspend) את התאים ב-40 milliliters של תמיסת סוכרוז סטרילית בריכוז 300 millimolar קרה מאוד (בטמפרטורת קרח). לאחר סבב צנטריפוגה שני של התאים, יש לסבנסיד אותם ב-20 milliliters של תמיסת סוכרוז סטרילית בריכוז 300 millimolar קרה מאוד. יש לצנטריפוג את התאים שוב ולסבנסיד אותם ב-400 microliters של תמיסת הסוכרוז בריכוז 300 millimolar. יש לקירר את התאים על קרח למשך 30 דקות, לאחר מכן הם יהיו מוכנים לאלקטרופורציה.

בשלב הבא, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסה בריכוז 0.2 מיקרוגרם למיקרוליטר של פלסמיד המקודד את הפרומוטור של CdrA לגן המקודד את החלבון הפלואורסצנטי הירוק ל-40 מיקרוליטר של תאי P.Aeruginosa אלקטרו-קומפטנט שהוכנו, בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר שקוללה מראש על קרח. ערבב את התרחיף והעבר אותו לקובטה לאלקטרופורציה עם מרווח אלקטרודות של 2 מילימטר שקוללה מראש. הסר לחות מהחלק החיצוני של הקובטה באמצעות נייר סופג והנח את הקובטה בתא הדגימות של מכשיר האלקטרופורציה.

בצע פולס למסלול במתח של 2.5 kilovolts, קיבול של 25 microfarad והתנגדות של 200 ohms. הוצא את הקובטה והוסף מיליליטר אחד של מצע LB. לאחר מכן, העבר את התאים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה סטרילית של 1.5 milliliter והדגר למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם ניעור ב-200 rpm.

לאחר הדגירה, פזרו מנות (aliquots) של 10 מיקרוליטר, 50 מיקרוליטר ו-100 מיקרוליטר מהתרבית על צלחות LB agar סטריליות בתוספת Ampicillin, ודגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. אששו את ביטוי ה-GFP על ידי בחינת הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה בערוץ GFP סטנדרטי. בחרו מושבה בודדת והחדירו אותה לתוך 5 מיליליטר של LB. לאחר דגירה של לילה, ערבבו 0.5 מיליליטר מהתרבית שדגרה למשך לילה עם 0.5 מיליליטר של 50% glycerol בתוך מבחנה עם מכסה הברגה בנפח של 2 מיליליטר, ואחסנו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.

יומיים לפני הסריקה, זרע את זן ה-P.aeruginosa שהוכן ממאגר של 80- מעלות צלזיוס על צלחת LB agar על ידי פריסה עדינה של החיידקים על פני הצלחת באמצעות לולאת הזרקה סטרילית. דגרי את הצלחת למשך לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בערב שלפני הסריקה, הזרק מושבה בודדת של P.aeruginosa מהצלחת לתוך מבחנה המכילה 10 milliliters של מצע LB.

דגרו את תרבית המקור (pre-culture) למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם ניעור במהירות של 200 rpm. ביום הסריקה, הכינו תרבית משנית (subculture) מתרבית המקור שגדלה למשך לילה על ידי דילול ראשוני עם מצע LB טרי עד ל-OD 600 של 1.0, ולאחר מכן דילול נוסף עם 5%LB עד ל-OD 600 של 0.4. הוסיפו מגנט ערבוב סטרילי למכל וערבבו את התרבית במהירות מינימלית על בוחש מגנטי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

פעולה זו מאפשרת לחיידקים להסתגל למצע לפני העברתם לפלטות בעלות 384 בארות. להכנת הביקורת החיובית, יש להוסיף 20 µL של Tobramycin Sulfate ל-10 mL של תרבית המשנה שהוכנה ולערבב בעדינות. יש להעביר בפיפט 40 µL מתרבית הביקורת החיובית לבארות A23 עד P23.

להכנת הביקורת השלילית, הוסף 30 µL של Dimethyl Sulfoxide ל-10 mL של התרבית המשנית שהוכנה וערבב בעדינות. העבר בפיפט 40 µL מתרבית הביקורת השלילית לבארות A24 עד P24. עבור כל אחת מהצלחות שהורטבו במולקולות הקטנות, זהר נפח של 40 µL מהתרביות המדוללות שגדלו למשך לילה לבארות A1 עד P22.

אטמו את הפלטות באמצעות כיסוי חדיר-אוויר והדגירו למשך שש שעות ב-37 °C. כ-30 דקות לפני המדידה הספקטרופוטומטרית, חממו מראש את קורא הפלטות ל-37 °C כדי למנוע עיבוי. הסירו בעדינות את הכיסוי החדיר-אוויר מהפלטה לפני הקריאה.

לאחר מכן, מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 nanometers בהגדרה של 10 הבזקים לבאר וזמן התייצבות של 0.2 seconds. לפני מדידת הפלואורסצנציה, בצע התאמה אוטומטית של ההגבר (gain) והמיקוד על בסיס באר הביקורת השלילית A24, והגדר את ערך היעד של ההגבר ל-75%. בחר בהתאמת מיקוד ובערוץ A בצד ימין של החלון. מדוד את הפלואורסצנציה של ה-GFP reporter בשיא עירור של 485 nanometers ושיא פליטה של 520 nanometers, בהגדרה של 10 הבזקים לבאר וזמן התייצבות של 0.2 seconds.

אספו נתונים מכל הפלטות שנבדקו. קריאות הנתונים נשמרות באופן אוטומטי כברירת מחדל על ידי התוכנה השולטת בקורא הפלטות. כדי לנתח את הנתונים, צפו בקריאות על ידי לחיצה על סמל ה-Mars בתוך תוכנת הבקרה כדי לפתוח את חבילת הניתוח הסטטיסטי.

שלוף את הנתונים על ידי לחיצה כפולה על מספר המגש הרלוונטי כדי לגשת לנתונים לצורך ניתוח. הער את האחידות והשחזוריות של הבדיקה באמצעות ניתוח Z prime חסון. לאחר מכן, חשב את אחוז עיכוב הצמיחה והער את אחוז העיכוב של הרמה התו-תאית של c-di-GMP כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.

איור זה מציג נתונים גולמיים מייצגים עבור OD 600 ו-GFP מהסריקה בבthroughput גבוה. מפת חום עם גרדיאנט צבעים, שבו צבעים חמים לקרירים מציינים ערכים נמוכים לגבוהים, הוחלה על ערכי הבארות. הנתונים שהתקבלו נותחו לצורך קביעת אחוז העיכוב, והם מוצגים כאן עבור both קריאות ה-OD 600 וה-GFP.

מולקולות קטנות שעשויות לעכב צמיחה ורמות של c-di-GMP תוך-תאיות יופיעו בדרך כלל בירוק, בעוד שמולקולות קטנות שעשויות לעודד צמיחה ורמות תוך-תאיות של c-di-GMP יופיעו בדרך כלל באדום. תרשימי פיזור משמשים להשוואת אחוז העיכוב שהתקבל מכל מולקולה קטנה שנבדקה. כל מולקולה קטנה מיוצגת על ידי נקודה קטנה, ומוצגת התפלגות אחוז העיכוב עבור כל אחת מקריאות ה-OD 600 וה-GFP.

נקודת חיתוך של פלוס או מינוס 50% נבחרה לזיהוי פגיעות (hits). פגיעות פוטנציאליות מסומנות באדום. בדיקות תגובה למינון מבוצעות עבור כל תרכובת מעניינת.

כאן, שני תרכובות מזוהות נבדקות במערך תגובה למנה (dose-response) של 10 נקודות, עם ריכוז עליון של 2 mM וסדרת דילול של פי שניים. התאמת פונקציה לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים לנתונים הניבה ערכי ריכוז עיכוב חציוני (half-maximal inhibitory concentration) עבור כל תרכובת של 158 µM ו-193 µM. לאחר השתלטות על הטכניקה, ניתן להשתמש בה לסריקה של למעלה מ-3,500 תרכובות בתוך 48 שעות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע סריקה חסונה של Pseudomonas aeruginosa עבור תרכובות המפריעות לאיתות של cyclic-di-GMP. בעת ביצוע נוהל זה, חשוב לזכור לשמור על תנאי סריקה ברי-השוואה כאשר הסריקה נמשכת על פני מספר ימים. בעקבות סריקה בנקודה אחת, ביצוע סריקת תגובת מינון (dose response screen) באמצעות אותו פרוטוקול יכולים לתקף את הפגיעות (hits).

טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים לזהות מולקולות קטנות פוטנציאליות המפריעות למידע ביופילמי ועמידות לאנטיביוטיקה של Pseudomonas aeruginosa. חשוב לציין כי ניתן להתאים טכניקה זו לשימוש עבור כל חיידק רלוונטי, וניתן לשנות אותה כדי לבחון תפוקות או קלטים אחרים, כגון השפעה על חיות חיידקית. לבסוף, אין לשכוח כי עבודה עם Pseudomonas aeruginosa עלולה להיות מסוכנת.

יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי, בעת ביצוע פרוצדורה זו.