Name: תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: למדו פרוטוקול סקרינג בנוזל לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן וגילוי תרופות באמצעות C. elegans. השיטה מאפשרת בדיקת גורמי עקה ומולקולות קטנות בנפחים קטנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מכון המחקר של טקסס (CPRIT) פרס RR150044, ולש קרן מחקר גרנט C-1930, ומניעת סרטן על ידי את נבחרת מוסדות של בריאות K22 AI110552 מוענק NVK. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

<ol><li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae%2C+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections%3A+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li>
<li>Hsueh, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+causing+nosocomial+infections+in+a+university+hospital%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+among+hospitalised+patients%3A+clinical+features%2C+risk-factors+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes.</a> Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequences+of+pandrug-resistant+Serratia+marcescens+clinical+isolates+harboring+blaNDM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1.</a> Genome Announcements. 5 (3), (2017).</li>
<li>Utari, P. D., Quax, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism.</a> Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).</li>
<li>Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+novel+anti-infectives+using+a+C.+elegans+pathogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).</li>
<li>Kirienko, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+disrupts+Caenorhabditis+elegans+iron+homeostasis%2C+causing+a+hypoxic+response+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death.</a> Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).</li>
<li>Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content%2C+phenotypic+screen+identifies+fluorouridine+as+an+inhibitor+of+pyoverdine+biosynthesis+and+pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence.</a> mSphere. 1 (4), (2016).</li>
<li>Manning, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+content+microscopy+assay+to+determine+drug+activity+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> Methods. 127, 3-11 (2017).</li>
<li>Marwaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acylated+derivatives+of+sulfamethoxazole+and+sulfafurazole+inhibit+intracellular+growth+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).</li>
<li>Kota, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+high-content+imaging+and+chemical+genetics+to+probe+host+cellular+pathways+critical+for+Yersinia+pestis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection.</a> PLoS One. 8 (1), e55167(2013).</li>
<li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+infection+caused+by+Listeria+monocytogenes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion.</a> Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).</li>
<li>Jayamani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Francisella+tularensis-Caenorhabditis+elegans+pathosystem+for+the+evaluation+of+therapeutic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li>
<li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189(2014).</li>
<li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18(2007).</li>
<li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540(2009).</li>
<li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li>
<li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li>
<li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li>
<li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine%2C+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa%2C+translocates+into+C.+elegans%2C+removes+iron%2C+and+activates+a+distinct+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li>
<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921(2003).</li>
<li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li>
<li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876(2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li>
<li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li>
<li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

זה assay (או מבחני דומה שבו פתוגנים אחרים המוחלפים aeruginosa פ או faecalis א) שימושי למגוון רחב של מטרות, לרבות גילוי תרופות. זה שימושי גם למיעון שאלות הביולוגיים הבסיסיים, כגון בזיהוי הגורמים התקפה אלימה, הבהרה של המארח ההגנה מסלולים, וקביעת את הרגולציה והמיכון באינטראקציה פתוגן-פונדקאי.
למרות וזמינותו aeruginosa פ הרג נוזלי עמיד, ישנן מספר נקודות איפה צריך להיות משולם תשומת לב כדי למזער את הסיכוי לכשל. ראשית, כאמור, הצלחת מקור חיידקי על ההזרקות aeruginosa פ</e...

בזיהוי ופיתוח של אפקטיביות, ותתנו לו אנטיביוטיקה, עכשיו כמעט לפני מאה שנה, הוביל רגע של התעוררות בתחום בריאות הציבור איפה שהיתה אמונה פרושות לרווחה כך זיהומיות מחלות יהיה יסורים של העבר. בתוך כמה עשורים קצר, האופטימיות הזו החלה לדעוך, כמו הפתוגן לאחר הפתוגן פיתחו מנגנוני ההתנגדות המוגבלת הטיפולים פעם מופלא. כבר כמה זמן, מרוץ החימוש בין במאמצי הגילוי סמים פתוגנים נראה מאוזן. עם זאת, ניצול לרעה של antimicrobials שהגיע לשיא לאחרונה לצמיחתה של זנים עמידים בפני פאן-התרופה של pneumoniae קלבסיאלה, Acinetobacter baumanii, בסרישיה marcescensו פ aeruginosa1, 3, 2,4.
Aeruginosa פ הוא הזדמנותית, גראם שלילי, מרובה מארחים הפתוגן שמהווה איום חמור לחולים עם כוויות חמורות, מי immunocompromised, או בעלי סיסטיק פיברוזיס. הוא גם יותר ויותר מזוהה בתור סוכן סיבתי זיהומים nosocomial חמורה, במיוחד בשל רכישתה מתמשך של עמידות מיקרוביאלית. כדי להתחיל לתת מענה לאיום הזה, השתמשנו את מתועדת היטב C. elegans-aeruginosa פ זיהום מערכת5. המעבדה שלנו יש ממונף מערכת זו לפתח פלטפורמה ההקרנה בנוזל, תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן כדי לזהות תרכובות הרומן להגביל את יכולתם של המחלה להרוג את המארח6. מסקרן, תרכובות אלו נראה שייך לפחות לשלוש קטגוריות כלליות, כולל antimicrobials7 והתקפה אלימה מעכבי8. אחרים מבחני גילוי סמים גבוהה-תוכן C . elegans דווחו Mycobacterium tuberculosum, כלמידיה trachomatis, Yersinia pestis, ליסטריה, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, קנדידה אלביקנס, ו Enterococcus faecalis, בין היתר9,10,11,12,13,14,15,16. סוגים אלה של מבחני יש מספר יתרונות מוכרת היטב, כגון הגבלת כניסות חיובי כוזב עלולים להיות רעילים הן המארח הפתוגן, גדל הסיכוי הזמינות הביולוגית לעומת מסך כימי, ואת היכולת לזהות את הלהיטים מעבר פשוט הגבלת צמיחת חיידקים, כגון אנטי-virulents, מערכת החיסון מולקולות מופחתים או תרכובות אחרת להטות את האיזון של אינטראקציה פתוגן-פונדקאי לטובת לשעבר. בנוסף, תרכובות גילה במסכים אלה הם לעתים קרובות יעיל בתרבית של המארחים.
ראוי לציין כי לפחות שני אחרים מבחני17,18 זמינים לביצוע בתפוקה גבוהה מסכי C . elegans בנוזל. עם זאת, כל אלה מבחני הוא שינוי המאפשר וזמינותו מעיים-קולוניזציה הטיפוסי, המכונה לאט-הרג, שיש לבצע בנוזל, הגדלת התפוקה ומאפשר תרכובות שיוקרנו בקלות רבה יותר. אפיון זהיר הוכיחה באופן סופי כי המנגנון של התקפה אלימה חיידקי הם שונים בין אלה מבחני שלנו בנוזל מסך7. מאז שני סוגי התקפה אלימה הם נצפו מערכות יונקים, חשוב לקחת בחשבון אילו דטרמיננטה התקפה אלימה רלוונטי ביותר עבור האינטרסים של הנסיין לפני בחירה וזמינותו.
כאן אנחנו מדגימים גירסה אופטימיזציה של בנוזל assay aeruginosa elegans-עמ' ג . אנחנו גם לדווח על ההסתגלות בשיטה assay בנוזל שלנו כדי להכיל את פתוגן חיידקי גראם חיוביים Enterococcus faecalis. כמו aeruginosa פ, א faecalis יותר ויותר מזוהה איום רציני nosocomial עם חימוש הגוברת של עמידות מיקרוביאלית מסלולים1. למרות שיטה קודמת להקרנה תפוקה גבוהה של אי faecalis קיים14, זה דורש preinfection עם המחלה, אשר מסבך את ההליך, מגבירה את הסבירות של מזהם ציוד כמו FlowSort COPAS. פרוטוקול שלנו מבטלת את הצורך לפני הפגיעה, לשפר את פרופיל הבטיחות. לבסוף, אנו מדווחים על אמצעי שבאמצעותו משני מבחני אלה יכול להיות משולב עם האכלה RNAi, המאפשר למשתמש לחפש גורמים מארח לשחק תפקיד בהקמת, או התנגדות, זיהום.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>אובייקט גדול זרימת ציטומטר / סדרן תולעים</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 מכונת כביסה מתקן</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 עמוק באר RB בלוק</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384 בארות צלחת</td><td>גריינר Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>מצע גידול נמטודות (NGM)</td><td></td><td></td> <td>כמות לליטר: 18 גרם אגר, 3 גרם NaCl, 2.5 גרם פפטון, 1 מ"ל CaCl2 (1 מ'), 1 מ"ל MgSO<תת>4 (1 מ'), 25 מ"ל מאגר פוספט ו-973 מ"ל של</td></tr><tr><td>צלחות</td><td></td><td></td> <td>הרג איטי (SK) של מים מילי-Qכמות לליטר: 18 גרם אגר, 3 גרם NaCl, 3.5 גרם פפטון, 1 מ"ל CaCl2 (1 M), 1 מ"ל MgSO4 (1 M), 25 מ"ל מאגר פוספט ו-973 מ"ל של</td></tr><tr>חומר <td></td><td></td><td>הרג איטי (SK)</td> של מים milli-Q <td>כמות לליטר:&nbsp; 3 גרם NaCl, 3.5 גרם פפטון, 1 מ"ל CaCl2 (1 M), 1 מ"ל MgSO4 (1 M), 25 מ"ל מאגר פוספט ו-973 מ"ל של מי milli-Q</td></tr><tr><td>מרק ליזוגני (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion Broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> <td>אקונומיקה תולעיםכמות ל-100 מ"ל: 10 מ"ל של תמיסת 5 M NaOH, 20 מ"ל של תמיסת נתרן היפוכלוריט 5% ו-70 מ"ל של מים סטריליים</td></tr><tr>כמות<td>בסיסית</td><td></td><td></td><td>לליטר: 5.85 גרם NaCl, 6 גרם KH2PO4, 1 גרם K2HPO4, ו-1 ליטר מים מילי-Q</td></tr><tr><td>אגר</td><td>USBמדעי החיים האיולוגיים</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaCl USBמדעי החיים האיולוגיים</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>פפטון</td><td>USBמדעי החיים האיולוגיים</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBמדעי החיים האיולוגיים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr>כמות <td>מאגר</td><td></td><td></td> פוספט <td>לליטר: 132 מ"ל של K2HPO4 (1M) ו-868 מ"ל של KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5% תמיסת נתרן היפוכלוריט</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>מגוון ביוטק</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX כתם חומצת גרעין כתום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td><זני חיידקים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa (PA14)<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> em>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זני תולעים <</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל c. elegans pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

מספר תרופות חדשות שזוהו על ידי מסורתית, מסכי במבחנה נחלשה, הפחתת ההצלחה של גישה זו בחיפוש אחר נשק חדש למאבק רב תרופתיים. זה הוביל למסקנה כי החוקרים אינם רק צורך למצוא תרופות חדשות, אבל גם צריך לפתח דרכים חדשות למצוא אותם. בין המועמד המבטיח ביותר שיטות הן כל-אורגניזם, ויוו assays המפרט את השימוש תפוקה גבוהה, פנוטיפי ומארח שנעים בטווח שבין Caenorhabditis elegans ל רזבורה rerio. מארחים אלה יש מספר יתרונות רב עוצמה, כולל הפחתה דרמטית כניסות חיובי כוזב, שחרורן תרכובות רעילים המארח ו/או biounavailable הם בדרך כלל במסך הראשוני, לפני בצע יקר למעלה.
הנה אנחנו מראים כיצד נעשה שימוש assay שלנו לחקור מארח את הוריאציה מתועדת היטב C. elegans—Pseudomonas aeruginosa הרג נוזלי pathosystem. אנחנו גם להוכיח מספר הרחבות של טכניקה זו הסתדר היטב. לדוגמה, אנו מסוגלים לבצע את מסכי גנטי תפוקה גבוהה באמצעות RNAi ב 24 - או 96-ובכן צלחת תבניות לגורמים מארח שאילתה באינטראקציה זה פתוגן-פונדקאי. שימוש assay הזה, מסכי הגנום כולו ניתן להשלים רק כמה חודשים, אשר יכול באופן דרמטי לפשט את המשימה של זיהוי מטרות סמים, שעשוי להיות ללא צורך גישות טיהור הביוכימי מפרך.
אנחנו גם מדווחים כאן וריאציה של השיטה שלנו, שמחליפה את חיידק גראם חיוביים Enterococcus faecalis עבור המחלה גראם שליליים aeruginosa פ. כמו כן עבור aeruginosa פ, הרג מאת faecalis אי הוא תלוי-זמן. בניגוד הקודם C. elegans– מבחניאי faecalis , וזמינותו שלנו עבור faecalis אי לא דורשת preinfection, שיפור פרופיל הבטיחות שלה והפחתת הסיכוי לזיהום ציוד למיון נוזלי. וזמינותו היא חזקה מאוד, מציג ~ 95% שיעורי המוות 96 h פוסט זיהום.

פרמטרים חשובים לביצועים assay
הבנה נכונה של הביולוגיה שבבסיס assay הזה הוא הכרחי עבור פתרון בעיות ומיטוב וזמינותו. לשם כך, אנו מתייחסים קודם בכמה עיתונים מרכזיים שחקרתי על מנגנוני פתוגנזה של פ aeruginosa-מתווכת הורג נוזלי7,20. ובלבד השלבים המתוארים לעיל עוקבים (ראו איור 1 סכימטי של פרוטוקול assay) רצח תלויי-זמן של C. el...

כאן נתאר פרוטוקול הוא מתאקלם מהר, כל מחשב מארח, כלי סינון גבוהה-תוכן יכול להיות מנוצל כדי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי ולשמש לצורך גילוי תרופות.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

שיטה זו יכולה לענות על שאלות באינטראקציה עם פתוגן מארח וגילוי תרופות, כגון החשיבות של גורמי אלימות שונים ויכולתן של מולקולות קטנות להשתפר עם היווצרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מתרחשת בפורמט נוזלי עם נפחים קטנים. כדי להתחיל, תוך כדי עבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית BSL 2, פס P.aeruginosa ממלאי קפוא על צלחת LB Agar.דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות, ולאחר מכן אחסנו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. יומיים לפני הקמת לוחות הבדיקה, השתמש במושבה אחת מהצלחת כדי לחסן שלושה עד חמישה מיליליטר של מרק LB סטרילי. דגרו על התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות.לאחר הכנת ההריגה האיטית או המדיה SK על פי פרוטוקול הטקסט, עם 350 מיליליטר של p. Aeruginosa מתרבית LB הלילה הטרייה, זרע כל צלחת SK של 10 סנטימטר. השתמש במפזר חיידקים סטרילי כדי לפזר את החיידקים באופן שווה, ואפשר לצלחות להתייבש בארון הבטיחות הביולוגית.לאחר מכן, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. כדי לבדוק מספר זני חיידקי RNAi במקביל בבאר אחת של צלחת באר בעומק 24 בארות, יש לחסן מושבה אחת מכל שיבוט של חיידקים המכילים RNAi שהוכנו בעבר לארבעה מיליליטר של קרבניצילין בתוספת LB. הכניסו את הצלחות לאינקובטור רועד המותאם לצלחות מרובות בארות ב-37 מעלות צלזיוס ו-950 סל"ד למשך 16 שעות, ולאחר מכן אספו את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-2,000 גרם למשך 5 דקות. שפכו את הסופרנטנט על ידי היפוך הצלחת וניעור נמרץ.שימוש ב-100 מיקרוליטר של S בזאלי משהה מחדש את חיידקי ה-RNAi. פיפט את החיידקים המרחפים למספר מתאים של בארות של צלחת NGM מרובת בארות בתוספת IPTG וקרבניצילין ואפשר לצלחת להתייבש. לאחר הכנת תולעי L1 על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו צלחות לניסויים בסיסיים על ידי פיפטינג של כ-5,000 תולעים לצלחת של 10 סנטימטרים, שנזרעו עם מזון-על RNAi או OP50.כדי להגדיר מסך RNAi, פיפטה כ -300 תולעים לבאר בצלחת של 24 בארות זרועה ב- RNAi. אם הזן בו נעשה שימוש הוא סטרילי מבחינת טמפרטורה, דגרו על התולעים בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך כ-16 שעות ולאחר מכן העבירו אותן ל-25 מעלות צלזיוס למשך 44 שעות כדי להשלים את ההתפתחות ולמנוע אמבריוגנזה. כדי לבצע בדיקת הרג נוזלים השתמש במגרד תאים כדי להסיר את ה-P.aeruginosa מצלחת SK ולהשעות מחדש את החיידקים בכ-5 מיליליטר של S.Basal.באמצעות ספקטרופוטומטר מודד את ה-OD 600 של תרחיף החיידקים. הכן 24 מיליליטר של מלאי מדולל של P.Aeruginosa ב-S.Basal ב-OD 600 השווה ל-09, ולאחר מכן הוסף 21 מיליליטר של מדיה SK נוזלית, ובעזרת פיפטה רב-ערוצית, העביר 45 מיקרוליטר של חיידקים ומדיה לכל באר של צלחת 384 בארות. שטפו את התולעים ממקורן לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, ואפשרו להן להתיישב בכוח הכבידה.שאפו את הסופרנטנט ל-5 מיליליטר, ואז השתמשו בסך הכל ב-50 מיליליטר של S.Basal כדי להשעות מחדש את התולעים, וחזרו על השטיפה פעמיים נוספות. בעזרת סדרן תולעים, מיין כ-22 תולעים לכל באר של צלחת 384 בארות, על פי פרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן השתמש בסרט חדיר גז כדי לאטום את הצלחת ולדגור אותה ב-25 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות. בזמן הרצוי, השתמש במכונת כביסה מיקרופלייט וב- S.Basal כדי לשטוף את צלחת 384 הבאר בסך הכל 5 פעמים.אחת הטעויות הקלות ביותר לעשות היא לשאוב את צלחת הבאר 384 לפני שהתולעים התייצבו לחלוטין. נדרש תרגול כדי לראות במדויק אם התולעים שקעו לחלוטין. לאחר הכביסה האחרונה, שאפו את הסופרנטנט עד 20 מיקרוליטר.לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של 98 כתם חומצת גרעין מיקרומולרית לבאר, לריכוז סופי של 0.7 מיקרומולר. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 12 עד 16 שעות. לאחר תקופת הדגירה הרצויה, השתמש במכונת הכביסה של המיקרופלייט כדי לשטוף את הצלחות לפחות שלוש פעמים.לרכישת נתונים השתמש בספקטרופוטומטר או במיקרוסקופ אוטומטי כדי לצלם גם אור מועבר וגם פלואורסצנטי. הוסף מיליליטר אחד של S בזל לכל באר של צלחת של 24 בארות המכילה 300 תולעים לבאר. מערבבים בעדינות את התולעים על ידי ניעור הצלחת, ואז מעבירים תולעים לצלחת באר ריקה וסטרילית בעומק 24.אפשר לתולעים להתיישב בכוח הכבידה, כחמש דקות. שאפו את הסופרנטנט, השאירו כמיליליטר אחד לבאר, ואז הוסיפו 7 מיליליטר של S בזאלי לכל באר. חזור על הכביסה פעמיים נוספות, ולאחר מכן לאחר הכביסה הסופית שאפו את כל הנוזלים מלבד כ -400 מיקרוליטר של סופרנטנט.לאחר פיזור החיידקים לתוך 384 צלחות באר כדי למנוע רעב, באמצעות פונקציית הדגימה מחדש של סדרן התולעים מיין 22 תולעים לכל באר של צלחת באר 384. לבסוף, לאחר המיון, הוסף מולקולות קטנות או חומרים ספציפיים אחרים לניסוי. כפי שמודגם בגרף זה, כאשר הצעדים המתוארים בסרטון זה מתבצעים, הרג תלוי זמן של C.elegans ייצפה רק בנוכחות P.aeruginosa.לעומת זאת, בהיעדר תוספי תזונה חיידקיים מרכזיים, ייצפה הרג מועט עד אפסי. כפי שמוצג כאן, הדגירה הדו-שלבית של P.aeruginosa ב-37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן 25 מעלות צלזיוס, שהיא קריטית לבדיקות הרג איטי קונבנציונליות, ויושמה במקור בהרג נוזלי, ניתנת לביטול בבדיקה זו. הפרוטוקול סובל טווח רחב של ריכוזי חיידקים ראשוניים, החל מ-OD 600 השווה ל-0025, ועדיין מציג הרג תלוי זמן וריכוז, אם כי התזמון משתנה.בנוסף, לעתים קרובות מספיקות רק ארבע בארות כדי להשיג נתונים מובהקים סטטיסטית. דוגמה לתועלת העיבוד מוצגת כאן כאשר יחס האות לרעש גבוה, כמו בדוגמה זו, הניתוח פשוט וההבחנה בין תנאים חיוביים לשליליים היא טריוויאלית. במקרים אלה, ניתן לזהות בקלות אפילו פגיעות חלשות.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-60 עד 75 דקות של ידיים בזמן לכל צלחת באר 384, לא כולל מיון. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להוסיף את כל הרכיבים למדיה שלך, אחרת האלימות תיפגע. בדיקה זו מפשטת את היישום של סינון מבוסס פנוטיפ של אורגניזם שלם לגילוי תרופות במחקר פתוגן מארח.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקות פתוגנזה מבוססות נוזל C elegans. ניתן לשנות הליך זה על ידי החלפה בפתוגנים אחרים, כגון E.Faecalis ב-P.Aeruginosa, מה שמקל על החיפוש אחר טיפולים לזיהומים חיידקיים אחרים. אל תשכח שעבודה עם חיידקים זיהומיים כמו P.Aeruginosa או E.Faecalis עלולה להיות מסוכנת.תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים, כגון הכשרה מתאימה, ציוד מגן אישי טוב וטכניקה נכונה, בעת ביצוע הליך זה.

a-high-throughput-high-content-liquid-based-c-elegans-pathosystem

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הליך culturing נוזלי מבוסס מחלק...

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

חוקרים יכולים להפעיל תנועה לפי דרישה ב-C. elegans על ידי הפעלת שדה חשמלי שתולעים חשות בו ומגיבות אליו. סרטון זה מציג התנהגות אלקטרוטקטית ומציג פרוטוקול דגימה שנעשה במכשיר מיקרופלואידי.

בדיקת Electrotaxis: שיטה לצפייה בתנועה ב- C. elegans

מקור: Anderson, Q. L. et al. C. elegans Pathosystem בעל תפוקה גבוהה, תכולה גבוהה, מבוסס נוזל. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים שיטת סינון בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת ב-Caenorhabditis elegans כדי לחקור הפלות גנים במהלך אינטראקציות מארח-פתוגן. הוא מתאר את הנוהל להכנת תולעי נוקדאון והעברתן ללוחות בדיקה כדי להעריך את ההשפעות של הרג תולעים הנגרמת על ידי פתוגנים.

בדיקה מבוססת נוזל Multiwell לסינון C. elegans Knockdowns

מקור: Anderson, Q. L., et al. C. elegans Pathosystem בעל תפוקה גבוהה, תכולה גבוהה, מבוסס נוזל. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון מדגים בדיקה מבוססת נוזל שבה זחלי C. elegans מהונדסים גנטית נחשפים לחיידקים פתוגניים במיקרו-צלחת. רעלנים חיידקיים המופרשים למדיום גורמים ללחץ ולמוות של המארח. צבע פלואורסצנטי מכתים תולעים מתות, ומאפשר כימות מבוסס הדמיה של התמותה כדי להעריך את הרגישות או העמידות הגנטית.

הערכת תמותה הנגרמת על ידי חיידקים פתוגניים בזחלי C. elegans

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies...

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

אנו מתארים את השלבים המפורטים של בדיקה כימית בעלת תפוקה גבוהה בנמטודה Caenorhabditis elegans המשמשת להערכת רעילות קו הנבט. בבדיקה זו, הפרעה בתפקוד קו הנבט בעקבות חשיפה לכימיקלים מנוטרת באמצעות מדווח פלואורסצנטי ספציפי לעוברים אנופלואידים.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת הפעילויות הנוירו-הגנתיות של תרכובות בדיקה ב - Caenorhabditis elegans, כולל צבירה של פוליגלוטמין, מוות עצבי והתנהגות כימואבואידית, כמו גם שילוב מופתי של פנוטיפים מרובים.

Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לגילוי תרכובות ביו-אקטיביות נגד רעילות עצבית בתיווך פוליגלוטמין

פרוטוקול זה מתאר הדמיית דולג זמן מבוססת מיקרופלואידית על פני כל ההתפתחות הפוסט-עוברית.

הדמיה ברזולוציה גבוהה של C. elegans בכל שלבי הזחל

כאן אנו מספקים הוראות לשימוש יעיל ב-SegElegans, מערכת למידה עמוקה שפיתחנו לפילוח אוטומטי של תולעים בודדות בתמונות מיקרוסקופיה רחבות, לשימוש מאוחר יותר בתוכנות ניתוח תמונות כגון ImageJ. אנו מספקים דרכים להשתמש במערכת הן באופן מקוון והן באופן לא מקוון.

ניתוח אוטומטי של תמונות פלואורסצנטיות של C. elegans באמצעות SegElegans

למדו פרוטוקול סקרינג בנוזל לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן וגילוי תרופות באמצעות C. elegans. השיטה מאפשרת בדיקת גורמי עקה ומולקולות קטנות בנפחים קטנים.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

גלה סרטונים נוספים