תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

שיטה זו יכולה לענות על שאלות באינטראקציה עם פתוגן מארח וגילוי תרופות, כגון החשיבות של גורמי אלימות שונים ויכולתן של מולקולות קטנות להשתפר עם היווצרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מתרחשת בפורמט נוזלי עם נפחים קטנים. כדי להתחיל, תוך כדי עבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית BSL 2, פס P.aeruginosa ממלאי קפוא על צלחת LB Agar.

דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות, ולאחר מכן אחסנו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. יומיים לפני הקמת לוחות הבדיקה, השתמש במושבה אחת מהצלחת כדי לחסן שלושה עד חמישה מיליליטר של מרק LB סטרילי. דגרו על התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות.

לאחר הכנת ההריגה האיטית או המדיה SK על פי פרוטוקול הטקסט, עם 350 מיליליטר של p. Aeruginosa מתרבית LB הלילה הטרייה, זרע כל צלחת SK של 10 סנטימטר. השתמש במפזר חיידקים סטרילי כדי לפזר את החיידקים באופן שווה, ואפשר לצלחות להתייבש בארון הבטיחות הביולוגית.

לאחר מכן, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. כדי לבדוק מספר זני חיידקי RNAi במקביל בבאר אחת של צלחת באר בעומק 24 בארות, יש לחסן מושבה אחת מכל שיבוט של חיידקים המכילים RNAi שהוכנו בעבר לארבעה מיליליטר של קרבניצילין בתוספת LB. הכניסו את הצלחות לאינקובטור רועד המותאם לצלחות מרובות בארות ב-37 מעלות צלזיוס ו-950 סל"ד למשך 16 שעות, ולאחר מכן אספו את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-2,000 גרם למשך 5 דקות. שפכו את הסופרנטנט על ידי היפוך הצלחת וניעור נמרץ.

שימוש ב-100 מיקרוליטר של S בזאלי משהה מחדש את חיידקי ה-RNAi. פיפט את החיידקים המרחפים למספר מתאים של בארות של צלחת NGM מרובת בארות בתוספת IPTG וקרבניצילין ואפשר לצלחת להתייבש. לאחר הכנת תולעי L1 על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו צלחות לניסויים בסיסיים על ידי פיפטינג של כ-5,000 תולעים לצלחת של 10 סנטימטרים, שנזרעו עם מזון-על RNAi או OP50.

כדי להגדיר מסך RNAi, פיפטה כ -300 תולעים לבאר בצלחת של 24 בארות זרועה ב- RNAi. אם הזן בו נעשה שימוש הוא סטרילי מבחינת טמפרטורה, דגרו על התולעים בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך כ-16 שעות ולאחר מכן העבירו אותן ל-25 מעלות צלזיוס למשך 44 שעות כדי להשלים את ההתפתחות ולמנוע אמבריוגנזה. כדי לבצע בדיקת הרג נוזלים השתמש במגרד תאים כדי להסיר את ה-P.aeruginosa מצלחת SK ולהשעות מחדש את החיידקים בכ-5 מיליליטר של S.Basal.

באמצעות ספקטרופוטומטר מודד את ה-OD 600 של תרחיף החיידקים. הכן 24 מיליליטר של מלאי מדולל של P.Aeruginosa ב-S.Basal ב-OD 600 השווה ל-09, ולאחר מכן הוסף 21 מיליליטר של מדיה SK נוזלית, ובעזרת פיפטה רב-ערוצית, העביר 45 מיקרוליטר של חיידקים ומדיה לכל באר של צלחת 384 בארות. שטפו את התולעים ממקורן לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, ואפשרו להן להתיישב בכוח הכבידה.

שאפו את הסופרנטנט ל-5 מיליליטר, ואז השתמשו בסך הכל ב-50 מיליליטר של S.Basal כדי להשעות מחדש את התולעים, וחזרו על השטיפה פעמיים נוספות. בעזרת סדרן תולעים, מיין כ-22 תולעים לכל באר של צלחת 384 בארות, על פי פרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן השתמש בסרט חדיר גז כדי לאטום את הצלחת ולדגור אותה ב-25 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות. בזמן הרצוי, השתמש במכונת כביסה מיקרופלייט וב- S.Basal כדי לשטוף את צלחת 384 הבאר בסך הכל 5 פעמים.

אחת הטעויות הקלות ביותר לעשות היא לשאוב את צלחת הבאר 384 לפני שהתולעים התייצבו לחלוטין. נדרש תרגול כדי לראות במדויק אם התולעים שקעו לחלוטין. לאחר הכביסה האחרונה, שאפו את הסופרנטנט עד 20 מיקרוליטר.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של 98 כתם חומצת גרעין מיקרומולרית לבאר, לריכוז סופי של 0.7 מיקרומולר. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 12 עד 16 שעות. לאחר תקופת הדגירה הרצויה, השתמש במכונת הכביסה של המיקרופלייט כדי לשטוף את הצלחות לפחות שלוש פעמים.

לרכישת נתונים השתמש בספקטרופוטומטר או במיקרוסקופ אוטומטי כדי לצלם גם אור מועבר וגם פלואורסצנטי. הוסף מיליליטר אחד של S בזל לכל באר של צלחת של 24 בארות המכילה 300 תולעים לבאר. מערבבים בעדינות את התולעים על ידי ניעור הצלחת, ואז מעבירים תולעים לצלחת באר ריקה וסטרילית בעומק 24.

אפשר לתולעים להתיישב בכוח הכבידה, כחמש דקות. שאפו את הסופרנטנט, השאירו כמיליליטר אחד לבאר, ואז הוסיפו 7 מיליליטר של S בזאלי לכל באר. חזור על הכביסה פעמיים נוספות, ולאחר מכן לאחר הכביסה הסופית שאפו את כל הנוזלים מלבד כ -400 מיקרוליטר של סופרנטנט.

לאחר פיזור החיידקים לתוך 384 צלחות באר כדי למנוע רעב, באמצעות פונקציית הדגימה מחדש של סדרן התולעים מיין 22 תולעים לכל באר של צלחת באר 384. לבסוף, לאחר המיון, הוסף מולקולות קטנות או חומרים ספציפיים אחרים לניסוי. כפי שמודגם בגרף זה, כאשר הצעדים המתוארים בסרטון זה מתבצעים, הרג תלוי זמן של C.elegans ייצפה רק בנוכחות P.aeruginosa.

לעומת זאת, בהיעדר תוספי תזונה חיידקיים מרכזיים, ייצפה הרג מועט עד אפסי. כפי שמוצג כאן, הדגירה הדו-שלבית של P.aeruginosa ב-37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן 25 מעלות צלזיוס, שהיא קריטית לבדיקות הרג איטי קונבנציונליות, ויושמה במקור בהרג נוזלי, ניתנת לביטול בבדיקה זו. הפרוטוקול סובל טווח רחב של ריכוזי חיידקים ראשוניים, החל מ-OD 600 השווה ל-0025, ועדיין מציג הרג תלוי זמן וריכוז, אם כי התזמון משתנה.

בנוסף, לעתים קרובות מספיקות רק ארבע בארות כדי להשיג נתונים מובהקים סטטיסטית. דוגמה לתועלת העיבוד מוצגת כאן כאשר יחס האות לרעש גבוה, כמו בדוגמה זו, הניתוח פשוט וההבחנה בין תנאים חיוביים לשליליים היא טריוויאלית. במקרים אלה, ניתן לזהות בקלות אפילו פגיעות חלשות.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-60 עד 75 דקות של ידיים בזמן לכל צלחת באר 384, לא כולל מיון. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להוסיף את כל הרכיבים למדיה שלך, אחרת האלימות תיפגע. בדיקה זו מפשטת את היישום של סינון מבוסס פנוטיפ של אורגניזם שלם לגילוי תרופות במחקר פתוגן מארח.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקות פתוגנזה מבוססות נוזל C elegans. ניתן לשנות הליך זה על ידי החלפה בפתוגנים אחרים, כגון E.Faecalis ב-P.Aeruginosa, מה שמקל על החיפוש אחר טיפולים לזיהומים חיידקיים אחרים. אל תשכח שעבודה עם חיידקים זיהומיים כמו P.Aeruginosa או E.Faecalis עלולה להיות מסוכנת.

תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים, כגון הכשרה מתאימה, ציוד מגן אישי טוב וטכניקה נכונה, בעת ביצוע הליך זה.