סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

המטרה הכוללת של שיטה ניסויית זו היא לאפשר מחקר בזמן אמת של איתות תוך תאי באמצעות הדמיית FRET של תאים המשובצים בתוך הידרוג'לים תלת מימדיים המחקים רקמות טבעיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, הפרמקולוגיה והרפואה הרגנרטיבית, כגון פיתוח ביו-חומרים אופטימליים וסינון תרופות בתפוקה גבוהה במיקרו-רקמות תלת מימדיות מהונדסות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש ב-FRET על מספר רב של תאים בסוגי הידרוג'ל רבים באמצעות מערכות מיקרוסקופ שדה רחב קונבנציונליות.

לאחר ייצור תבניות ליציקת הידרוג'ל ותליית תאים מתורבתים בתמיסת הידרוג'ל, על פי פרוטוקול הטקסט, במכסה מנוע לתרבית רקמות, הוסף את התא המכיל מבשר לתבניות היציקה בטכניקה סטרילית. לפני הצלבה, סנטרפוג את התאים התלויים במבשר הידרוג'ל כדי לייעל את ההדמיה על ידי הגבלת התאים למישור מוקד יחיד, ומזעור האות מחוץ למישור. לאחר מכן, כדי להצליב הידרוג'לים למחשב, השתמש במקור אור UVA לזמן חשיפה השווה ל-3.2 ג'אול לסנטימטר רבוע למילימטר עובי כדי להקרין את התא המכיל קודמן.

לחלופין, השתמש במנורת שיניים ידנית זולה יותר. הימנע מחשיפת יתר של ההידרוג'ל, מכיוון שהדבר יפחית את כדאיות התאים. הידרוג'לים צולבים פיזית ממוקמים במקום זאת ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר הצלבה, הסר את תבנית יציקת ההידרוג'ל PDMS והחלף אותה בצלחת ה-PDMS שהוכנה בעבר. השתמש במרית סטרילית כדי ללחוץ את ה-PDMS כלפי מטה על הזכוכית כדי להדביק אותה. הוסף מדיום נטול פנול ללא סרום או מדיום מוגדר כימית לבאר שנוצרה בצלחת ה-PDMS עם כיסוי כדי לשמור על ההידרוג'ל שקוע.

דוגרים את המנה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר שצלחת ה-PDMS עם ההידרוג'ל אובטחה בשלב המיקרוסקופ והשמן הוחל על המטרה, השתמש באור המועבר כדי למצוא לפחות 15 תאים להדמיה, ואמת טרנספקציה באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. בתוכנת המיקרוסקופ, הגדר את הגדרות המצלמה עבור ערוצי התמונה של FRET על ידי בחירה בין כמה תאים ליד מרכז שדה הראייה, וייעל את החשיפה והרווח לכל ערוץ תמונה לפי פרוטוקול הטקסט.

בחר תאים הקרובים למרכז ההידרוג'ל, בתוך שדה התאורה השטוח יחסית שאינם בהירים מדי או עמומים מדי, ועם יחס FRET בין 00 ל-1.0. לאחר מכן, בחר שדות ראייה מרובים כדי להשיג תמונות עבור לפחות 15 תאים שעברו טרנספטציה. כבה את האור בסיום כדי להגביל את החשיפה.

כדי להגדיר את קצב הלכידה לרכישת תמונות דולג זמן, הזן את המחזוריות של הלכידות. השתמש בקצב מהיר עבור לכידת האות הבסיסי, כגון כל חמש שניות לכל שדה ראייה, ובקצב איטי יותר עבור קינטיקה של איתות לטווח ארוך לאחר מכן. בחר הפעל עכשיו כדי ליזום רכישת תמונות וללכוד תמונות למשך חמש דקות כדי ליצור קו בסיס לתגובת בדיקה בשדה הראייה המיועד.

לאחר חמש הדקות של רכישת התמונה, הכניסו פיפטה לאגוניסט או לאנטגוניסט הרצוי, ערבבו על ידי פיפטינג והמשיכו בהדמיה. לאחר ביצוע כיול FRET בהתאם לפרוטוקול הטקסט, בתוכנת המיקרוסקופ בחר את החץ בסמל אזור העניין ברקע ובחר צייר אזור עניין רקע אליפטי. צייר והקצה אזור עניין אחד, או החזר ROI, לכל שדה ראייה ליד התאים כדי להגדיר את רמת הרקע.

ודא שהאפשרות Keep Update Background Offset נבחרה, ולאחר מכן הפעל את התצוגה של אזור העניין ברקע על-ידי לחיצה על הסמל Background Region of Interest. לחלופין, בחר את סמל אזור העניין והגדר את מאפייני אזור העניין כ- השתמש כאזור עניין ברקע, ואזורי עניין שונים בכל נקודה מרובה. השתמש בסמל הרקע של אזור העניין, בחר Subtract Background Using Region of Interest.

בחלון המוקפץ, תחת Subtract Background Region of Interest, בחר Every Image ותחת Apply To, בחר All Frames. לכל אחד משדות התצוגה, להגדרת אזור עניין סביב התא באמצעות ערוץ הפליטה המקבל ומסיכה בינארית, השתמשו בתפריט בינארי, 'הגדר סף' ובחרו 'החל על המסגרת הנוכחית'. לאחר מכן, התאם את הסף התחתון כדי לבחור את התאים.

לאחר מכן, השתמש בפונקציה Binary Close כדי למלא חורים במסיכה הבינארית, במידת הצורך. לאחר מכן, השתמש בסמל אזור עניין כדי לבחור העתק בינארי לאזור עניין כדי לשמור את המסיכה הבינארית כאזורי עניין. צרף את אזורי העניין עבור שדות הראייה הבאים למאגר הקיים של אזורי עניין.

מחק את כל אזורי העניין המזוייפים. לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על אזורי העניין ובדוק שהנכסים שלהם משמשים כאזור עניין סטנדרטי ואזורי עניין שונים בכל Multi Point. ניתן לצייר את אזור התא של תחומי העניין ביד, אך יש להקפיד להסיר ערכים מזויפים.

הפרוטוקול מכיל נהלים לתאים שנמצאים מחוץ לשדה התאורה השטוח ולמיקרוסקופים שאין להם שדה שטוח. צנטריפוגה של קודמני ההידרוג'ל לפני הג'לציה הגדילה את מספר התאים במישור מוקד אחד ליד החלקת הכיסוי. זה מזער רעשי רקע והגדיל את תפוקת ההדמיה.

בניסוי FRET זה, לחישוב יחס הפליטה המרווה, או QE, FRET, נדרשו רק שתי תמונות עבור בדיקת ICUE1 בינארית של שרשרת אחת, כולל QE שווה ל-CFP CFP עבור עירור ופליטה, ופליטת מקבל שווה ל-YFP YFP עבור עירור ופליטה. נבחרו שדות ראייה מרובים בהם שכנו מספר תאים בתוך אזור התאורה ההומוגני כפי שמוצג כאן. החזר ROI לתיקון רקע של אותות ערוצים ולניתוח תאים יועדו באמצעות תמונות פליטת מקבל סף מתחילת הניסויים.

בנוסף, כפי שמוצג כאן, נבחרו תאים המבטאים בדיקה מספקת. חושבו יחסי ה-QE והפליטה הרגישה לפיקסל ויחס ה-FRET הממוצע לתא. ההופכי של יחס ה-SE חושב ושני היחסים נורמלו.

תחת גירוי הפורסקולין, גם יחסי ה-FRET המבוססים על QE וגם SE מזהים את פעילות ה-AMP המחזורית המוגברת בכונדרוציטים. גם ג'לים מקושרים פיזית וגם מקושרים כימית הראו עלייה ביחס QE FRET לאורך זמן, מה שמעיד על תגובת איתות AMP מחזורית מוגברת לתוספת פורסקולין. ניתן להשתמש בהליך זה עם טכניקות מיקרוסקופיה אחרות כגון FRAP, flim fret ומדידת שריגים ואניזוטרופיה, כדי לענות על שאלות כגון, מהם ההבדלים בחדירות ובסינגלינג תאי בין סוגי מיקרו-רקמות שונים.

מכיוון שקישור צולב מרווה ליד ה-PDMS, חשוב לזכור לתכנן את התבניות עבור ההידרוג'לים המצולמיים בקוטר מעט גדול יותר מההידרוג'לים עצמם.