סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

המטרה הכוללת של שיטה ניסויית זו היא לאפשר מחקר בזמן אמת של סיגנלינג תוך-תאי באמצעות דימוי FRET של תאים המוטמעים בתוך הידרוגלים תלת-ממדיים המדמים רקמות טבעיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית, הפרמקולוגיה והרפואה הרגנרטיבית, כגון פיתוח ביו-חומרים אופטימליים וסריקת תרופות בתוספת של תפוקה גבוהה ברקמות מיקרו-מבניות תלת-ממדיות מהונדסות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש ב-FRET על מספר רב של תאים במגוון סוגי הידרוגלים באמצעות מערכות מיקרוסקופ רחב-שדה קונבנציונליות.

לאחר הכנת התבניות ליציקת ההידרוג'ל ותליה של תאים מתורבתים בתמיסת הידרוג'ל, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, ובתוך מנדף לתרביות רקמה, העבירו את התמיסה המקדימה המכילה את התאים לתבניות היציקה תוך שימוש בטכניקה סטרילית. לפני הצלבת התמיסה, סובבו בצנטריפוגה את התאים התלויים בתמיסה המקדימה של ההידרוג'ל כדי לאפטמיזציה של הדימות על ידי הגבלת התאים למישור מוקד יחיד, וצמצום האותים מחוץ למישור. לאחר מכן, כדי להצליב הידרוג'לי PC, השתמשו במקור אור UVA למשך זמן חשיפה השווה ל-3.2 joules per centimeter squared לכל millimeter של עובי כדי להקרין את התמיסה המקדימה המכילה את התאים.

לחלופין, ניתן להשתמש במנורת שיניים ידנית זולה יותר. יש להימנע מחשיפת יתר של ההידרוג'ל, שכן הדבר יפחית את חיוניות התאים. הידרוג'לים בעלי קשירה צולבת פיזית ימוקמו במקום זאת בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר הצלבת הקשרים, הסר את תבנית היציקה של הידרוג'ל ה-PDMS, והחלף אותה בצלחת ה-PDMS שהוכנה מראש. השתמש בשפכטל סטרילי כדי להצמיד את ה-PDMS למשטח הזכוכית. הוסף מצע ללא סרום וללא פנול או מצע מוגדר כימית לבאר שנוצרה בצלחת ה-PDMS, והנח לוחות כיסוי כדי לשמור על ההידרוג'ל טבול במצע.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר שצלחת ה-PDMS עם ההידרוג'ל קובעה עלבמה של המיקרוסקופ ונשפך שמן על העדשה, השתמשו באור תמסור כדי למצוא לפחות 15 תאים לצילום, ואששו את התעתוק באמצעות דימוי פלואורסצנטי. בתוכנת המיקרוסקופ, הגדירו את הגדרות המצלמה עבור ערוצי דימויי ה-FRET על ידי בחירת מספר תאים קרובים למרכז שדה הראייה, ובצעו אופטימיזציה של זמן החשיפה וההגבר (gain) עבור כל ערוץ דימוי בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

בחרו תאים הנמצאים קרוב למרכז ההידרוג'ל, בתוך שדה ההארה השטוח יחסית, שאינם בהירים מדי או עמומים מדי, ובעלי יחס FRET שבין 0.0 ל-1.0. לאחר מכן, בחרו מספר שדות ראייה כדי לרכוש תמונות של לפחות 15 תאים שעברו טרנספקציה. כבו את האור בסיום כדי להגביל את החשיפה.

כדי להגדיר את קצב הלכידה עבור רכישת תמונות בשיטת time lapse, הזינו את המחזוריות של הלכידות. השתמשו בקצב מהיר עבור לכידת אות הבסיס, כגון כל חמש שניות לכל שדה ראייה, ובקצב איטי יותר עבור קינטיקה של אותות לטווח ארוך בהמשך. בחרו ב-Run now כדי להתחיל ברכישת התמונות וללכוד תמונות למשך חמש דקות, על מנת לבסס קו בסיס לתגובת הגשש בשדה הראייה שנקבע.

לאחר חמש דקות של רכישת תמונות, הוסף בעזרת פיפט את האגוניסט או האנטגוניסט הרצוי, ערבב על ידי פיפוט והמשך בדימות. לאחר ביצוע כיול FRET בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בחר בתוכנת המיקרוסקופ בחץ שעל סמל אזור העניין של הרקע ובחר ב-Draw Elliptical Background Region of Interest. שרטט והגדר אזור עניין אחד, או ROI, לכל שדה ראייה בקרבת התאים כדי להגדיר את רמת הרקע.

וודאו כי האפשרות Keep Updating Background Offset מסומנת, ולאחר מכן הפעילו את התצוגה של אזור העניין של הרקע על ידי לחיצה על סמל ה-Background Region of Interest. לחלופין, בחרו בסמל אזור העניין (region of interest), והגדירו את מאפייני אזור העניין כ-Use as Background Region of Interest, וכן Regions of interest are different in each Multi Point. באמצעות סמל הרקע של אזור העניין, בחרו ב-Subtract Background Using Region of Interest.

בחלון הקופץ, תחת Subtract Background Region of Interest, בחרו ב-Every Image ותחת Apply To, בחרו ב-All Frames. עבור כל שדה ראייה, כדי להגדיר אזור עניין סביב התא באמצעות ערוץ הפליטה של המקבל ומסכה בינארית, השתמשו בתפריט Binary, Define Threshold, ובחרו ב-Apply To Current Frame. לאחר מכן, התאימו את הסף התחתון כדי לבחור את התאים.

בשלב הבא, השתמשו בפונקציית Binary Close כדי למלא חורים במסכה הבינארית, במידת הצורך. לאחר מכן, השתמשו בסמל ה-Region of Interest ובחרו ב-Copy Binary to Region of Interest כדי לשמור את המסכה הבינארית כמעגלי עניין (regions of interest). הוסיפו את מעגלי העניין של שדות ראייה עוקבים למאגר הקיים של מעגלי העניין.

מחק כל אזורי עניין (regions of interest) שגויים. לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על אזורי העניין וודא שהמאפיינים שלהם מוגדרים כ-Use as Standard Region of Interest ושהאפשרות Regions of Interest are different in each Multi Point מסומנת. ניתן לסמן את אזורי העניין של התאים באופן ידני, אך יש להקפיד להסיר ערכים שגויים.

הפרוטוקול כולל נהלים עבור תאים שנמצאים מחוץ לשדה התאורה שטוח (flat illumination field) ועבור מיקרוסקופים שאין להם שדה שטוח. צנטריפוגציה של חומרי המוצא להידרוג'ל לפני הג'לציה מקסה את מספר התאים במישור מוקד אחד קרוב לזכוכית המכסה. פעולה זו צמצמה את רעש הרקע והגדילה את תפוקת הדימות.

בניסוי FRET זה, לצורך חישוב יחס FRET של פליטה מושתקת, או QE, נדרשו שתי תמונות בלבד עבור גשושית ICUE1 בינארית בעלת שרשרת אחת, כולל QE השווה ל-CFP CFP עבור עירור ופליטה, ופליטת מקבל השווה ל-YFP YFP עבור עירור ופליטה. נבחרו מספר שדות ראייה שבהם נמצאו תאים מספר בתוך אזור ההארה ההומוגני כפי שמוצג כאן. אזורי עניין (ROIs) לתיקון רקע של אותי הערוצים ולניתוח תאים הוגדרו באמצעות תמונות פליטת מקבל עם סף (thresholded) מתחילת הניסויים.

בנוסף, כפי שמוצג כאן, נבחרו תאים שהביעו כמות מספקת של גשש. חושבו יחסי ה-FRET של ה-QE והפליטה הרגישה (sensitized emission) לכל פיקסל, וכן יחס ה-FRET הממוצע לכל תא. חושב ההופכי של יחס ה-SE ושני היחסים נורמלו.

תחת גירוי של forskolin, הן יחסי ה-Fret המבוססים על QE והן אלו המבוססים על SE מזהים עלייה בפעילות ה-cyclic AMP בתאי כונדרוציטים. ג'לים בעלי קשירה צולבת פיזית וכימית הראו שניהם עלייה ביחס ה-QE FRET לאורך זמן, מה שמעיד על תגובה מוגברת של איתות cyclic AMP להוספת forskolin. ניתן להשתמש בפרוצדורה זו עם טכניקות מיקרוסקופיה אחרות כגון FRAP, flim fret, ומדידות fret ואניזוטרופיה, כדי לענות על שאלות כגון, מהם ההבדלים בחדירות ובאיתות התאי בין סוגים שונים של מיקרו-רקמות.

כיוון שהקישור הצולב (crosslinking) נאלם בקרבת ה-PDMS, חשוב לזכור לתכנן את התבניות עבור ההידרוגלים בעלי הקישור הצולב הפוטו-כימי בקוטר הגדול מעט מההידרוגלים עצמם.