איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

המטרה הכוללת של פרוטוקול אימונוכימי זה היא להעריך את ההתפלגות המרחבית של צורות מותאמות של ציטוזין בהקשרים שונים של רקמות ותאים בהתבסס על שימוש בנוגדנים משניים מצומדים של פרוקסידאז והגברת אות טירמיד. שיטה זו מתגברת על המגבלה של טכניקות אחרות שאינן מספקות מידע מרחבי הדרוש להבנת התפקוד הביולוגי של צורות שונות של ציטוזין. בנוסף, שיטה זו מאפשרת זיהוי משותף של צורות שונות של ציטוזין עם סמני שושלת חלבונים וניתן להשתמש בה כדי לחקור את הלוקליזציה הגרעינית שלהם.

כדי להתחיל בהליך זה, תקן קטעי רקמה מיובשים של עוברי עכברי CD1 ורקמות מוח בוגרות על ידי הנחתם בקור קרח של 4% PFA או 4%FA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את הקיבוע העודף על ידי שטיפת החלקים ב- PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לחלחל את חלקי הרקמה על ידי הנחתם בצנצנת קופלין מלאה במרכזיה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את ה- PBX העודף על ידי שטיפת החלקים תוך זמן קצר ב- PBT. כעת, הנח את החלקים החדירים ב-2 N HCl למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר לצורך דעיכת DNA. לאחר מכן, העבירו את החלקים ל-10 מילי-מולרי Tris-HCL למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנטרל את ה-HCl.

לחלופין, שטפו את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד ב-PBS. דגרו את החלקים ב-PBT למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר בזהירות את הנוזל מהאזור המקיף את חלקי הרקמות.

בינתיים, שמור על חלקי הרקמה לחים. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי להקיף את החלקים מבלי לגעת בהם. לאחר מכן, דגרו את החלקים ב 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח.

לאחר מכן, דגרו את חלקי הרקמה ב-100 מיקרוליטר של דילול של 1:5000 של נוגדן ראשוני חד-שבטי נגד 5hmC של עכבר ודילול של 1:1000 של נוגדן ראשוני פוליקלונלי אנטי-5caC של ארנב בתמיסה חוסמת למשך שעה בטמפרטורת החדר. לחלופין, בצע את הדגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר עודפי נוגדנים על ידי שטיפת החלקים בצנצנת קופלין מלאה ב- PBT שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר עודף PBT, ובמידת הצורך, הקף את החלקים שוב בעט מחסום הידרופובי מכיוון ש-PBT מכיל חומר ניקוי שעלול להחליש את המחסום ההידרופובי. לאחר מכן, בצע דילול של 1:400 של נוגדן מצומד HRP נגד ארנב עז ודילול של 1:400 של נוגדן מצומד נגד עכבר 555 של חמור בתמיסת חסימה. לאחר מכן דגרו את חלקי הרקמה ב-100 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים המשנית למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח.

לאחר מכן, שטפו את חלקי הטישו בצנצנת קופלין מלאה ב-PBT שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן העבירו את חלקי הרקמה ל-100 מיקרוליטר טירמיד בדילול של 1:200 במאגר הגברת אות הטירמיד למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. זמן הדגירה היה תמיסת הטירמיד צריכה להיות אופטימיזציה ניסויית עבור כל אצווה בודדת של ערכת הגברת אות טירמיד שבה נצפה קשר ליניארי בין עוצמת האות ומשך הגברת האות המבוססת על טירמיד.

מיד לאחר מכן, הסר עודף תמיסת טירמיד על ידי שטיפת השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת ב-PBT. הסר בזהירות עודף PBT וכסה מיד את החלקים בטיפת מדיום הרכבה. הניחו בעדינות פתק כיסוי על חלקי הרקמה ואטמו את החלקת הכיסוי עם לק.

לאחר מכן שמור את חלקי הרקמה בארבע מעלות צלזיוס למשך מספר שעות לפני בדיקה מיקרוסקופית. כדי לקבוע את התפלגות 5hmC בקטעי רקמת המוח, הזיהוי המשותף של שינוי אפיגנטי זה בוצע עם סמן לנוירונים פוסט-מיטוטיים, NeuN. ניתוח אימונוהיסטוכימי גילה כי בעוד שצביעת 5hmC הבולטת התמקמה עם תאים חיוביים ל-NeuN, לתאי גליה שליליים של NeuN היו רמות נמוכות יותר של 5hmC גנומי.

כדי לקבוע את התפלגות 5caC בתאי גזע עצביים מתמיינים בוצעה צביעה של סמן זה עם סמן גליה, GFAP, על תרביות קבועות של תאי גזע עצביים שלושה ימים לאחר השראת התמיינות גליה. בניגוד לתאי גזע עצביים או אסטרוציטים בוגרים, נצפה אות חזק של 5caC בחלק גדול מהתאים המבטאים GFAP. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין את כל הריאגנטים והחומרים יחד עם הדגימות שלך. לאחר הליך זה, ניתן לבצע הדמיה קונפוקלית על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי הפצה גרעינית של צורות שונות של ציטוזין. זה יכול לתרום לפענוח התפקוד הביולוגי הפוטנציאלי שלהם.

אל תשכח שעבודה עם 2 N Hcl עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון ארון בטיחות ובלאי מגן בעת ביצוע הליך זה.