איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

המטרה הכללית של פרוטוקול אימונוכימי זה היא להעריך את ההתפלגות המרחבית של צורות מושנות של ציטוזין בהקשרים תאיים ורקמתיים שונים, בהתבסס על שימוש בנוגדנים שניים המשוררים לפרוקסידאז והגברת אות באמצעות טירמיד. שיטה זו מתגברת על המגבלה של טכניקות אחרות שאינן מספקות מידע מרחבי הדרוש להבנת התפקוד הביולוגי של צורות מושנות של ציטוזין. בנוסף, שיטה זו מאפשרת זיהוי משותף של צורות מושנות של ציטוזין עם סממני שושלת חלבונים ויכולה לשמש למחקור הלוקליזציה הגרעינית שלהן.

כדי להתחיל בנוהל זה, קבעו חתכי רקמה שעברו רהידרציה של עוברי עכבר CD1 מסוג wild-type ושל רקמות מוח בוגרות על ידי הנחתם ב-4% PFA או 4% FA קרים בקרח למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את עודפי המקבע על ידי שטיפת החתכים ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו פרמיליזציה לחתכי הרקמה על ידי הנחתם בצנצנת קופלין מלאה ב-PBX למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסירו את שאריות ה-PBX על ידי שטיפה קצרה של החתכים ב-PBT. כעת, העבירו את החתכים המפרומים ל-2 N HCl למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר לצורך דפורינציה של ה-DNA. לאחר מכן, העבירו את החתכים ל-10 millimolar Tris-Hcl למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנטרל את ה-HCl.

לחלופין, שטפו את הנגדים שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת ב-PBS. דגרו את הנגדים ב-PBT למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו בזהירות את הנוזל מהאזור שסביב נגדי הרקמה.

בינתיים, יש לשמור על נתחי הרקמה לחים. השתמשו בטוש למסכם הידרופובי (hydrophobic barrier pen) כדי להקיף את הנתחים מבלי לגעת בהם. לאחר מכן, דגרו את הנתחים ב-100 µL של תמיסת חסימה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתוך תא לחות.

לאחר מכן, דגרו את נתחי הרקמה ב-100 µL של דילול 1:5000 של נוגדן ראשוני מונוקלונלי לעכבר נגד 5hmC ודילול 1:1000 של נוגדן ראשוני פוליקלונלי לארנב נגד 5caC בתמיסת חסימה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לחלופין, בצעו את הדגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, הסירו נוגדנים עודפים על ידי שטיפת הנתחים בצנצנת קופלין (Coplin jar) מלאה ב-PBT שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסירו את ה-PBT העודף, ובמידת הצורך, הקיפו שוב את החתכים בעזרת עט למחסום הידרופובי, כיוון ש-PBT מכיל דטרגנט שעלול להחליש את המחסום ההידרופובי. לאחר מכן, הכינו דילול של 1:400 של נוגדן שועי anti-rabbit המשולב עם HRP ודילול של 1:400 של נוגדן חמור anti-mouse המשולב עם 555 בתמיסת חסימה. לאחר מכן, הדגירו את חתכי הרקמה ב-100 µL של תערובת הנוגדנים המשניים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתוך תא לחות.

לאחר מכן, שטפו את חתיכי הרקמה בתוך צנצנת קופלין (Coplin jar) המלאה ב-PBT שלוש פעמים, למשך חמש דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את חתיכי הרקמה ל-100 microliters של tyramide בדילול של 1:200 בתוך תמיסת tyramide signal amplification buffer למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. יש לבצע אופטימיזציה ניסיונית של זמן האינקובציה של תמיסת ה-tyramide עבור כל ערכה של tyramide signal amplification kit בנפרד, כאשר נצפה קשר ליניארי בין עוצמת האות לבין משך זמן הגברת האות המבוססת על tyramide.

מיד לאחר מכן, הסירו את עודפי תמיסת הטיראמיד על ידי שטיפת השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם ב-PBT. הסירו בזהירות את עודפי ה-PBT וכסו מיד את החתכים בטיפה של תמיסת קיבוע (mounting medium). הניחו בעדינות זכוכית כיסוי על חתכי הרקמה ואטמו את זכוכית הכיסוי בעזרת לק.

לאחר מכן, יש לשמור את חיתוכי הרקמה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך מספר שעות לפני הבדיקה המיקרוסקופית. כדי לקבוע את התפוצה של 5hmC בחיתוכי רקמת מוח, בוצע זיהוי משותף של שינוי אפיגנטי זה עם NeuN, המשמש כסמן לנוירונים פוסט-מיטוטיים. ניתוח אימונוהיסטוכימי גילה כי בעוד שהצביעה הבולטת של 5hmC נמצאה במיקום משותף עם תאים חיוביים ל-NeuN, תאים גליאליים שליליים ל-NeuN הראו רמות נמוכות יותר של 5hmC גנומי.

כדי לקבוע את התכורה של 5caC בתאי גזע עצביים המבדילים, בוצע צביעה משולבת של סמן זה עם סמן גליאלי, GFAP, על תרביות מקובעות של תאי גזע עצביים שלושה ימים לאחר השראת בידול גליאלי. בניגוד לתאי גזע עצביים או לאסטרוציטים בוגרים, נצפה אות 5caC חזק בחלק גדול מהתאים המבטאים GFAP. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בכשמונה שעות אם היא מבוצעת כהלכה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להכין את כל الريאגנטים והחומרים יחד עם הדגימות. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע דימוי קונפוקאלי כדי להשיב על שאלות נוספות בנוגע להתפלגות גרעינית של צורות שונויות של ציטוזין. דבר זה עשוי לתרום לפענוח התפקוד הביולוגי הפוטנציאלי שלהן.

יש לזכור כי עבודה עם 2 N Hcl עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במabilis מly-מנשף (מגירה כימית) ולבישת ציוד מגן, בעת ביצוע הליך זה.