Name: הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: למד טכניקת patch-clamp תת-תאית להקלטות מדנדריטים של נוירוני דופמין nigralיים. שיטה זו מאפשרת מיפוי תפקוד ערוצי יונים ברמת התת-תאית לחקר תפקוד נוירונלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אני מודה ד&quot;ר וינסנט Seutin בתמיכה המתמשכת שלו, Christelle Gillissen ולורן Massotte לקבלת סיוע טכני מעולה, ד&quot;ר ז&#39;אן Defourny וסנדרה Ormenese עבור עצות עם מיקרוסקופ confocal, ד&quot;ר ז&#39;אק ארגנה על המתנה של מגבר Axopatch 200B השני, הדמית GIGA פלטפורמה לשיתוף המיקרוסקופ confocal ותוכנת Imaris וד&quot;ר סטיבן פרימן לקריאת כתב היד באופן ביקורתי. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של FRS בלגי - FNRS (U.N002.13 ו T.N0015.13) ופורסם בתמיכת קרן אוניברסיטת הבלגית (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

הכותב מצהיר שאין לו שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

דו&quot;ח זה מתאר פרוטוקול צעד אחר צעד ליישם קלטות somatodendritic כל תא כפולות וקלטות הדנדריטים מקומיות. זה שימושי לקביעת ההשפעה של תעלות יונים (כלומר, אני ח) על מהלך הזמן של הפוטנציאלים postsynaptic ומיפוי חלוקת ערוץ יון (אני ח) לאורך תחום somatodendritic של נוירונים DA nigral, בהתאמה. כתוצאה מדידות אלקטרו משולבים כדי לפרסם הוק היסטוכימיה להתאושש מורפולוגיה התא. ההליך הועסק לחקור נוירונים DA ממוקמים nigra substantia, אבל ניתן להכליל עבור נוירונים GABA nigral שכנות, נוירונים DA הטגמנטום הגחוני או נוירונים מוח תיכונים אחרים. כל השלבים ניתן בעקבות לבחון גם תעלות יונים אחרים הביעו דנדריטים של נוירונים nigral בלי שינויים חשובים. הוק הודעה להדמיה הוא רלוונטי במיוחד עבור נוירונים עם נושאות האקסוןדנדריטים, כגון נוירונים nigral 25,26, interneurons oriens-alveus בהיפוקמפוס 21 או כמה עצב פירמידליים CA1 67. מעניין לציין, כי נוירונים שיתוף תכונה זו נראה יותר נפוץ ממה שמקובל לחשוב 67. ניתוח מורפולוגי חושף גם את המיקום המדויק של האלקטרודות האקסון. הגילוי של זה האחרון עשוי להיות מותאם על ידי התיוג של חלבונים הביעו במגזר הראשוני האקסון (ערוצי Na + מתח מגודר או Ankyrin G) באמצעות אימונוהיסטוכימיה 68,69. מהימנותם של נתונים שנאספו עם קלטות הדנדריטים וסימון עצבי עוקב תמיד תלויה באיכות הפרוסה. מאמץ מקסימאלי צריך אפוא להיות מיושם כדי לשמר את הכדאיות של תאים בתוך הרקמה. זו מושגת באמצעות טיפול עדין של בעלי חיים בריאים, כלים איכותיים ריאגנטים, חמצון מספיק של טמפרטורות הרקמות קרות כקרח לאורך כל הכנת פרוסות. תנאי הקלטה יציבים להסתמך על הבחירה של נוירונים בריאים. במצב כל התא, התנגדות סדרה צריכה תחילה להיות נמוכה ככל האפשר ומתוחזק קבועה לאורך כל הניסוי. היציבות של הקלטות היא עוד תלויה מניפולטורים באיכות גבוהה נטול להיסחף ותנודות. ניתן להפחית הפרעות אלו על ידי אופטימיזציה של יציבות פיפטה: בדיקת החיבור לבעל פיפטה וכדי headstage, שליטה שכבלי micromanipulator מופשלים, הימנעות שינויים פתאומיים בטמפרטורה או תנועה הבמה לבדיקת המנגנון של המניפולטור. עבור הקלטות כפולות, methylsulfate 13,15,21 נכלל הפתרון התאי, אבל גלוקונאט 9,14,25 יכול להיות מועסק לסירוגין. עם זאת, האניון העיקרי עשוי לשנות את קרום פוטנציאל 70,71 וכמה זרמים תלויי מתח 72. פתרון תאי ניתן להשלים עם ATP, GTP ו phosphocreatine לשמר את physioloפונקציות gical של נוירונים. בנוסף, הוספת צבע פלואורסצנטי בפתרון פיפטה (למשל, Alexa 594 או Sulforhodamine 101 41) כדי להמחיש את דנדריטים במהלך ההקלטה סומטיים יכול להיות שימושי למשל להציב יישום הלחץ (איור 7 נ&quot;צ. 41) או מגרה חשמל פִּיפֵּטָה. הפתרון פיפטה להקלטות מצורפות תא מכיל ריכוז גבוה K + ואין Na + להקליט ח ט גדול. ראוי לציון יחס ריכוז Na + / K + משפיע על משרעת הנוכחית 10, פוטנציאל ההיפוך של 11 הנוכחי ואת gating של אני ח 73. לחלופין, אני ח יכול גם להקליט באמצעות מחוץ-outs 10. בתצורת הקלטה זו אולם, המילייה התאי הקרבה של הערוצים עשוי להיות מוטרד. כתוצאה מכך, הבדלים הפעלה תלוי המתח של לי &lt;sub&gt; h הוא ציין כאשר זרמי השוואה שהושגו באמצעות טלאים מצורפי תא ומחוץ-outs 10. נפיחות של נוירונים הוא נתקל מדי פעם במהלך ההקלטה תיקון- clamp, ולעתים קרובות מתעוררת מגורמים ברורים, כגון איכות נמוכה של מים, חוסר איזון חזקה osmolarity או pH בין התוך ואת הפתרונות תאיים 39 או טעויות בהרכב של פתרונות. איכות הקלטות אלקטרו יש שכיחות ישירה על איכות המורפולוגיה של נוירונים התאושש. טפטפות סומטיים עמידות גבוהה משמשות להקלטות כפולות (6 - 10 MΩ, כמו שופטים 6,11.) ו להקלטות סומטיים אחת אחרי הקלטות מצורפות תא כדי למזער את הדילול של המילייה התאית 14. ההקלטה סומטיים כל התא בעקבות הקלטת התא מצורף ולכן הוא כל זמן קצר (&lt;10 דקה &#39;). בחוץ-אאוט תיקונים משני טפטפות סומטיים הדנדריטים חיוניים סגירה תקינה של גell קרום וההתאוששות הבאה של מורפולוגיה התא. בנוסף של מבנה התא, התוכן הנוירוכימיים עשוי להיקבע על נוירונים רשמו 59,74. למשל, hydroxylase החלבון טירוזין תאיים ניתן immunolabeled לזיהוי חד-משמעי של נוירונים DA 13. נוירונים DA מרוכזים בעיקר SN pars compacta, עם צפיפות נמוכה בהרבה נוכח SN pars reticulata, שם הם מתערבבים עם מספר גבוה יותר של נוירונים GABA 75. בעוד גוף התא של הנוירונים DA הוא לעיתים קרובות גדול יותר מזה של נוירונים GABA, זיהוי חזותי של תאים אלה עם IR-videomicroscopy אינה ודאית הפריע חלקית את אטימות compacta pars. כדי לעקוף מגבלות אלו, הבחירה מראש של נוירונים DA ניתן להקל על ידי השימוש של עכברים מהונדסים המבטא בסמן פלורסנטי באוכלוסייה ספציפית של נוירונים (TH 65 או DAT נוירונים DA, GADעבור נוירונים GABA) ואת התאורה epifluorescence. לחלופין, פלורסנט לצבוע עשוי להיכלל הפתרון של האלקטרודה סומטיים כדי להקל על ויזואליזציה של דנדריטים. רזולוציה מוגברת של התא פלורסנט מובא על ידי confocal דיסק מסתובב ניפקוב 14,22,30 או שני הפוטונים מיקרוסקופיה 7 בשילוב IR-DGC 6. כמה יתרונות קשורים DGC בהשוואת דסק&quot;ש. ראשית, כפי מנסרות דסק&quot;ש אינן נדרשות, תמונת IR-DGC ניתן ועליהן 49,52,53,76 תמונת קרינה. שנית, DGC ניתן לשלב עם photostimulation ו optogenetics 77. חסרון של הכנת פרוסה הוא השמירה על השלמות של נוירונים. נוירונים DA להאריך הדנדריטים שלהם בשלושת המטוסים מרחבית 78,79 ולכן עיצור של תא הדנדריטים לא ניתן להימנע לחלוטין פרוסות 80. הבחירה של האורינטציה של פרוסות (עטרה, אופקי או פסקsagittal) היא trade-off. מקורו של העצבוב ואת תכנון הניסוי חייב להיחשב כדי לבחור את כיוון הזכות פרוסה. תיקון הדנדריטים ישיר הוא הטכניקה המשמשת כדי למפות את התפלגות תעלות יונים פונקציונליות במדורים השונים של תאים. בנוסף, טכניקה זו מציעה לקבוע את השתנות תכונות פעילות של ערוצים 20. כהשלמה המיקום וצפיפות של תעלות יונים ניתן לקביעה באמצעות אימונוהיסטוכימיה על מיקרוסקופ אור ואלקטרוניקה רמות 17,23. גישה זו גם מציעה את האפשרות לקבוע את צפיפות הערוץ במבני קליבר קטנים אשר אינם נגישים טפטפות תיקון. עם זאת ערוצים אלה עשויים להיות במצב תפקודי ברור 24 או אפילו פעילים בהשוואה לאלו אשר נרשמו באמצעות טכניקות תיקון- clamp. טכניקות שניהם לכן, יש לקבל תמונה מלאה על המיקום והמאפיינים שלתעלות יונים באזור תאי ספציפי 17. עם התפתחותה של צבעים מתח רגיש, הדמיה מתח נעשה שימוש כדי לבחון את התפשטות של APS ו EPSPs בנוירונים במקומות מרובים 81. כחלופה להקלטות תיקון- clamp כפולות, גישה זו ניתן ליישם גם עבור דנדריטים דק שאינם נגישים טפטפות תיקון אבל מחייבים כיול מדויק של האות ו המיצוע. בעוד נוירונים DA ב SN ואזור tegmental גחון נחקרים נרחב באמצעות הקלטות סומטיים בהקשר הפיזיולוגי pathophysiological, את המאפיינים התפקודיים של הדנדריטים שלהם נותרים עלומים בעיקר בשני התנאים. תיקון מ דנדריטים יושם עבור נוירונים דופמין nigral על ידי מספר קבוצות עם הצלחה 13,25,26 ונשאר שיטת הבחירה לנתח תכונות להתרגש מבני subcellular בסדר אלה 8. הקלטות דנדריטים לספק opportu נוסףnity לבחון את היעילות ואת הפלסטיות של שידור הסינפטי פלסטיות של רגישות הדנדריטים 82,83.

נוירונים לקבל מידע הסינפטי בעיקר על הדנדריטים שלהם. מעורר אותות הסינפטי מעכבים להפיץ מהאתר שלהם של דור לאתר האינטגרציה שבו פוטנציאל פעולה (APS) הם עוררו את אות המוצא. בדרכם, פוטנציאלים הסינפטי מושפעים הוא מבחינת המבנה של דנדריטים האינטראקציה בין תכונות הממברנה פסיביות ואקטיביות. השילוב של פרמטרים משתנים מאוד אלה מרחיב את כוח החישוב של נוירונים 1,2. עם זאת, הקוטר הקטן של דנדריטים מעכבים אולם המחקר של התכונות החשמליות שלהם. הפיתוח המתמיד של טכניקת תיקון- clamp 3, אופטיקה 4 והעידון של שיטות להכנת פרוסה 5 במהלך העשורים האחרונים אפשרו הקלטות מן דק מאוד (0.7 - 3 מיקרומטר O) דנדריטים 6,7. שיטות אלה היו, והם, עדיין במידה רבה להשתמש כדי לבחון את הרגישות של דנדריטים במגוון of נוירונים 8. קלטות הדנדריטים ישירות חיוניות כדי לקבוע את החלוקה 9-19 ו הבדלים בתכונות הפונקציונליות 20-22 של תעלות יונים בתאים עצביים ברורים. נתונים אלו הם משלימים ההכרחיים של הפצות ערוץ יון מזוהות עם אימונוהיסטוכימיה בשילוב מיקרוסקופ אור האלקטרונים 23,24. קלטות somatodendritic Dual יושמו לחקור את התפשטות פוטנציאל פעולה 9,13-15,21,22,25-27 והפצת פוטנציאלים הסינפטי 13,16,18 לאורך תחום somatodendritic של נוירונים, להשיג דגמי כבל פסיביים מפורטים 28. 30 ולחקור ההחלטה הזמנית של אינטגרציה עצבית 31. Nigra substantia (SN) הוא אזור הממוקם במוח התיכון מעורב בכמה פונקציות כגון שליטה על תנועה, הקידוד של גמול והתנהגויות רגילות. הירידה של דופמין עקב אל הפרטאובדן דופאמין (DA) נוירונים SN קשור הפרעות המוטוריות אצל חולים הסובלים ממחלת פרקינסון 32. מעגל nigral מורכב משני סוגי תאים עיקריים: נוירונים דופאמינרגיים GABAergic. מעניין, הנוירונים האלה יש כמה תכונות ספציפיות המבדילות אותם נוירונים אחרים. האקסון של חלק גדול של נוירונים DA וכמה נוירונים GABA מקורו מאתר הדנדריטים המציין כי סוכת הדנדריטים היא הטרוגנית (האקסון נושאות דנדריטים-חסר האקסון) 25,26,33. המורפולוגיה של נוירונים אלה ניגודים ולכן עם בארגון טיפוסי של נוירונים שבו העברת מידע בהתאם לחוק של קיטוב דינמי הנפלטת קחאל: החל דנדריטים, כדי סומה ולבסוף האקסון 34. נוירונים DA ידועים גם לשחרר דופמין מן הדנדריטים שלהם 35, ליצור פעילות התפוצצות 36 הפלסטיות NMDA קולטן 37. dissection של תופעות אלה הוא חמקמק ללא הקלטות ישירות מהאתר שבו הם יזמו. כדי לקבל תובנה לתוך הקשר בין המיקום המדויק תכונות פעילות של תעלות יונים ותפקידם העברת הרגישות ומידע הדנדריטים בנוירונים nigral, קלטות הדנדריטים ישירות הן את שיטת בחירה. דו&quot;ח זה מתאר הליך מפורט, שניתן להשתמש בם כדי להשיג הקלטות יחידות כפולות תיקון- clamp מ דנדריטים של נוירונים nigral ואת תיוג biocytin פוסט הוק המקביל. העקרונות הבסיסיים עבור תיקון והגופני ואת קרום הדנדריטים הם מאוד דומים. למעשה זאת, הקלטות מאתרים הדנדריטים דורשות אופטימיזציה ספציפית בהשוואה להקלטות סומטיים. קלטות הדנדריטים מוצלחות לסמוך על האיכות של הפרוסות, התאמה אופטימלית של אופטיקה, גישה עדינה של פיפטה את התיקון והיציבות של ההקלטות.

<table><tbody><tr><td>מים מזוקקים כפולים</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Resistivity >14 M&Omega; ס"מ, אידיאלי 18.2 M&Omega; ס"מ ב-25&nbsp; &deg; C, מסונן (0.22 ומיקרו; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>נרות מיקרופילטר</td><td>Robu</td><td>נקבוביות 3, קוטר 6 מ"מ או 13 מ"מ</td> פורס רקמות עם vibroprobe פרמטרי חיתוך Leica VT1200: מהירות 0.07, משרעת 1.40 פורס רקמות Dosaka DTK-1000 פרמטרי חיתוך: מהירות 4, תדר 7 סכיני גילוח <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> כלי חיתוך <td>ג'ילט</td><td>סופר סילבר</td><td></td></tr><tr><td></td><td>בראון, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא</td><td></td><td></td> מילואים <td>בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>PP beckers</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 מ"ל</td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &micro; m</td><td></td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט&nbsp;</td><td>UHU</td><td>"Sekunden Kleber"</td>דבק <td>נוזלי</td></tr><tr><td>תא הקלטה&nbsp;</td><td>לואיגס & Neumann</td><td>Slice מיני תא</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטות אופקי</td><td>Sutter Instruments</td><td>חום-בוער P-97</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות</td><td>הילגנברג</td><td>1807524</td><td>2 מ"מ OD/1 מ"מ תעודת זהות זכוכית, קצוות מלוטשים, שטוף</td></tr><tr><td>שעווה דנטלית</td><td>Colt&egrave; ne/Whaledent</td><td></td><td>רצועות שעווה של מגש אורתודונטי</td></tr><tr><td>רשת</td><td></td><td></td> פלטינה <td>לעיגון פרוסות בתא ההקלטה, בהתאמה אישית עם דיסק פלטינה</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>לקצות פיפטה באש</td></tr><tr><td>אשלגן מתיל סולפט</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr>בדיקות <td>מולקולריות</td><td>ביוציטין</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>מנומטר</td><td>GREISINGER אלקטרוני</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt שיפוע ניגודיות</td><td>Luigs & מניפולטורים נוימן</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>לואיגס & </td> תופס מסגרת Neumann <td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td></td><td>מקור ההדמיה</td><td>מצלמת DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מעבה</td><td>Zeiss</td><td></td><td>צמצם מספרי גבוה עובד עם שמן</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X הגדלה, למרחקים ארוכים, צמצם מספרי גבוה 1.0 טבילה במים המטרה</td></tr><tr><td>מחליף ארבעה</td>: <td>Luigs & נוימן</td><td></td><td>בין המצלמה למיקרוסקופ</td></tr><tr><td>צג וידאו בשחור-לבן</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16 אינץ', 850 קווי טלוויזיה,</td></tr><tr><td>בקבוקי דגימה אנלוגיים, זכוכית ענבר, עם מכסה</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>להעברת פרוסות מההתקנה לחדר ההיסטולוגיה</td></tr><tr><td>מדריך האקסון</td><td>ספר</td><td>התקנים</td><td></td> מולקולריים</tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>ניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>ראה גיליון נתוני בטיחות והנחיית חומרים מסוכנים (EU) לפני השימוש</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים באר</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>לצביעה של פרוסות קבועות</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>ראה גיליון נתוני בטיחות והנחיית חומרים מסוכנים (EU) לפני השימוש</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-TH חד שבטי ראשוני</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>ריכוז עבודה: 1/1,000</td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד עכבר עזים - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>ריכוז עבודה: 1/500</td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>בדיקות מולקולריות - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Avidin DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td> <td>plugin for ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>שחזור נוירונים מלאים בביוציטין</td></tr><tr><td>נוירומנטי</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td> <td>שחזור נוירונים מלאים בביוציטין</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>ניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים</td></tr></tbody></table>

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה somatodendritic של נוירונים nigral דופמין

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

דנדריטים של נוירונים דופאמינרגיים לקבל ולהעביר קלט סינפטי, פוטנציאל פעולה תמיכה לאחור-לריבוי שחרור הנוירוטרנסמיטר. הבנת פונקציות בסיסיות אלה ישפכו אור על העברת מידע בנוירונים אלה. קלטות תיקון- clamp דנדריטים לספק את האפשרות לבחון את התכונות החשמליות ישירות של דנדריטים תעלות יוני מתח מגודר בסיסיות. עם זאת, מבנים בסדר אלה אינם נגישים בקלות טפטפות תיקון בגלל הקוטר הקטן שלהם. דו&quot;ח זה מתאר צעד אחר צעד הליך כדי לאסוף הקלטות יציבות ואמינות מן דנדריטים של נוירונים דופאמינרגיים פרוסים חריף. מדידות אלקטרו משולבות עם התאוששות פוסט הוק של מורפולוגיה תא. ניסויים מוצלחים להסתמך על הכנת שיפור של פרוסות, פתרונות טפטפות, התאמה נאותה של אופטיקה והיציבות של פיפטה במגע עם המבנה המוקלט. עקרונות תקן של סוםהקלטת תיקון- clamp atic מוחלת דנדריטים אבל עם גישה מתונה יותר של פיפטה. טכניקות צדדיות אלו יכולות להיות מיושמות על מנת לענות על שאלות שונות לגבי הנכסים להתרגש של דנדריטים.

הקלטות מהדק טלאי תת-תאיות מציעות את האפשרות לחקור את התכונות הפונקציונליות של דנדריטים. עם זאת, מבנים עדינים אלה אינם נגישים בקלות בשל קוטרם הקטן. הפרוטוקול המתואר כאן נועד להקל על איסוף הקלטות יציבות ואמינות מהדנדריטים של נוירוני דופמין בפרוסות במבחנה.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון כיצד תעלות יונים תלויות-מתח בודדות תורמות לתפקודיהם של נוירונים ספציפיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מיפוי של תפקודי תעלות היונים ברמה התת-תאית בנוירונים. התחילו את הפרוצדורה על ידי הנחת המוח בתוך צלחת פטרי בקוטר 9 centimeter שתחתיתה מכוסה בשכבה של SiliGuard.בשלב הבא, הקיפו את המוח ב-sucrose-ACSF קר מאוד. להכנת פרוסות קורונליות, בצעו שני חתכים כדי להסיר את המוחון ואת החלק הרוסטרלי של המוח. לאחר מכן, מרחו דבק ציאנואקרילט על מגש הדגימה, והדביקו את גוש המוח למגש כך שהחלק הרוסטרלי פונה לעמדת החיתוך.לאחר מכן, טפטפו מספר טיפות של sucrose-ACSF על המוח והשקיעו לאט את המגש אל תוך תא החיתוך. לאחר מכן, כווןו את להב התער בנקודת זווית של 15 מעלות ביחס למישור האופקי. חתכו פרוסות מוח קורונליות בעובי של כ-500 micrometers בכיוון caudal-nasal לפני ההגעה ל-substantia nigra.לאחר מכן, כווננו את העובי לחיתוך של פרוסות בעובי 300 micrometer המכילות את אזור העניין. הפרידו את הפרוסות מבלוק הרקמה בעזרת מחט דיסקוורסית דקה מאוד המחוברת למזרק, במקביל לקצה להב התער. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לתא השמירה בטמפרטורה של 34 degrees Celsius למשך שעה אחת.בפרוצדורה זו, העבירו פרוסה של מוח לתא ההקלטה. קבעו את הפרוסה לתחתית תא ההקלטה באמצעות טבעת פלטינה, וודאו כי הפרוסה באיכות טובה ובעלת פני שטח חלקים ואחידים. לאחר מכן, בחרו נוירון עם דנדריט הנשירים למרחק רב באותו מישור, וודאו שניתן לעקוב אחר הדנדריט הנבחר עד לסומה מוגדרת היטב.בשלב הבא, מלאו את פיפטת ה-patch בתמיסת אלקטרודות. כדי לבצע patch לדנדריט במצב cell-attached, זהו והתמקדו בחלק מהדנדריט. הפעילו לחץ חיובי על הפיפטה, והורידו אותה באמצעות המיקרו-מניפולטור.כעת מקם את הפיפטה קרוב לממברנה וכייל את הלחץ כדי ליצור שקע קטן. לאחר מכן, שחרר את הלחץ מקצה הפיפטה ובצע patch לדנדריט, תוך בקרה על התנגדות הפיפטה. השתדל להשיג התנגדות חסימה הגבוהה מ-1 gigaohm, ובמידת האפשר בין 3 ל-10 gigaohms, עבור הקלטות מסוג cell-attached.לאחר מכן, הרחיקו את הפיפטה מהממברנה, בכמה מיקרומטרים, כדי למנוע עיוות של הדנדריט. זרמי הפעולה הנראים כאן מייצגים פוטנציאלי פעולה ספונטניים של נוירונים בניגרה. כדי לדכא את זרמי הפעולה, הוסיפו חוסמי תעלות סידן ונתיריום ל-ACSF.לאחר מכן, החילו קפיצת מתח של 90 millivolts, מפוטנציאל החזקה של zero millivolts, כדי לעורר את זרם הקטיונים המופעל על ידי היפר-פולריזציה. בסוף ההקלטה, קרעו את ה-patch כדי להגיע למצב whole cell. לאחר מכן, הוציאו באיטיות ובזהירות את פיפטת הדנדריטים מהממברנה הנוירונלית כדי לקבל outside-out patch.כדי לבצע הקלטה מהסומה המתאימה במצב תא שלם (whole-cell mode), איתרו את הסומה השייכת לדנדריט. הורידו פיפט עם התנגדות של בין 5 ל-10 megaohms המכילה תמיסה תוך-תאית מבוססת אשליום אל גוף התא. לאחר מכן, הפעילו לחץ שלילי קצר בקצה הפיפט כדי לקרוע את הממברנה ולהגיע למצב תא שלם.בדקו את זהות הנוירון במצב clamp-current על ידי החלת מדרגות זרם היפר-בוליים ודפולריזציה ארוכות, ואפשרו ל-biocytin מהפיפט להדיף לאורך הדנדריטים. לאחר 10 דקות, הוציאו את הפיפט כדי להשיג patch מסוג outside-out. השתמשו ברצף של תנועות קצרות, לצדיות ומעלה, כדי לסייע בסגירה תקינה של ממברנת התא, ברגע שהפיפט נמצא מעל הפרוסה, כדי לצאת לחלוטין מתא ההקלטה.השאירו את הפרוסה בתא ההקלטה למשך 15 דקות נוספות ב-ACSF סטנדרטי כדי לאפשר שיווי משקל של הביוציטין והנוירון המוקלט. לאחר מכן, העבירו בעדינות את הפרוסה לבקבוקר זכוכית ענברי בנפח 25 מיליליטר המכיל ACSF סטנדרטי להיסטולוגיה. בהליך זה, אתרו באופן כללי את הנוירון המסומן פלואורסצנטית בפרוסה באמצעות אפי-פלואורסצנציה.בחנו בקצרה את העץ הדנדריטי של הנוירונים ואתרו את האקסון ואת הבליטה האקסונית (axonal bleb) באמצעות עדשה של 10X. לאחר מכן, עברו למיקרוסקופ הקונפוקלי ובחרו בדיודה של לייזר 488 ננומטר כדי לעורר את הנוירון המסומן. עקבו אחר התפשטות האקסון והדנדריטים בציר Z, והקליטו תמונות עקביות כדי להשיג Z stack של התא כולו.כוון את רזולוציית ציר ה-Z ואסוף את התמונות הקונפוקאליות של התא בהגדלה נמוכה וגבוהה. לסיום, פתח את קובץ התמונה של הנוירון באמצעות תוכנה לעיבוד תמונות. השווה בעין את תמונת היטלי ה-Z (Z projection) לתמונת IR-DGC כדי לאתר את המיקום המדויק של פיפטת ה-patch במהלך ההקלטה האלקטרופיזיולוגית.כאן מוצגת תמונת IR-DGC של נוירון דופמין ופיפט על הדנדריט הפרוקסימלי. עקבת הזרם מראה את קיבולת זרמי הדליפה של EN בתגובה לפקודת מתח של חמישה מיליוולט, בתצורת cell-attached, עם התנגדות אטימה של חמישה גיגה-אוהם. קפיצת מתח היפר-פולריזצית, מפוטנציאל ממברנה של אפס מיליוולט, השחיתה זרם קטיוני המופעל על ידי היפר-פולריזציה המופעל באיטיות.העקבה הנוכחית הומרה לערכים הפוכים והותאמה לפונקציה מעריכית אחת, מה שהניב קבוע זמן של 632 milliseconds. להלן תגובות המתח של התא השלם (whole cell) שנרשמו מהסומה למול פולסי זרם היפר-בולריים ודה-פולריים למשך שנייה אחת, בנוכחות חוסמי זרמי נתרן וסידן תלויי-מתח כדי למנוע פוטנציאלי פעולה במהלך הקלטה מסוג cell attached. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ביום אחד, אם היא מבוצעת כהלכה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשיג רקמה בריאה ותנאי הקלטה יציבים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון immunohistochemistry, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון זהותו של הנוירון שהוקלט. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירופיזיולוגיה לחקור את התפקוד, התכונות והתפקיד של תעלות יונים תלויות-מתח בתאים עירורים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מקליטים ובוחנים את התפלגות הזרמים הזורמים דרך תעלות יונים תלויות-מתח בדנדריטים.

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד להחיל המוליכות לתוך נוירון דופאמין רשמה בתצורת תא שלם פרוסות המוח עכברוש. טכניקה זו נקראת מהדק דינמי.

יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי

טכניקת amperometric מודדת שחרור דופאמין מתא בודד על ידי גילוי נוכחי חמצונים המיוצרים על ידי חמצון דופמין ספונטני. מהדק המתח סימולטני ומתודולוגיה amperometry לחשוף את מערכת היחסים בין מכניסטית "הפעילות" הכוללת של טרנספורטר דופאמין ותפקיד הרגולציה של פעילות זו על ההובלה ההפוכה של דופמין.

מדידת תא בודדה של שחרור דופמין במתח-clamp וAmperometry סימולטני

סרטון זה מדגים טכניקה להקלטת מהדק טלאי מפני השטח של הממברנה הדנדריטית. זה עוזר לבחון ישירות את התכונות החשמליות של דנדריטים ותעלות יונים מגודרות מתח בסיסיות בנוירונים דופמינרגיים.

הקלטות מהדק טלאי מהדנדריט של נוירון דופמינרגי בפרוסת מוח

סרטון זה מדגים את ההליך לביצוע רישומים אלקטרופיזיולוגיים בתאי עצב מסוג substantia gelatinosa (SG) של פרוסות חוט השדרה, תוך שימוש בטכניקות של מהדק טלאי של תאים שלמים כדי לנתח דפוסי ירי של נוירונים. שיטה זו מאפשרת לחקור תגובות עצביות לגירויים בנוירוני SG של חוט השדרה.

רישום מהדק טלאי של תא שלם בנוירון ג'לטינוזה מהותי של פרוסת חוט השדרה

סרטון זה מדגים את בחינת עוררות תאי העצב התחושתיים בגרעיני השורש הגבי באמצעות טכניקת מהדק טלאי כדי למדוד את בסיס הריאוס ואת פוטנציאל הממברנה, תוך ניתוח תגובות הנוירונים לזריקות זרם מצטבר.

הקלטות מהדק טלאי של תא שלם על גרעיני שורש גבי חולדה שלמים

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

כתב יד זה מתאר כיצד להכין גרעיני שורש גב שלמים להקלטות מהדק טלאי. תכשיר זה שומר על המיקרו-סביבה עבור נוירונים ותאי גליה לווייניים, ובכך נמנע מהשינויים הפנוטיפיים והתפקודיים הנראים באמצעות נוירוני DRG מנותקים.

הצמד תיקון הקלטות על Intact השורש הגבי הגרעינים מן חולדות בוגרות

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע הקלטת תיקון מהדק כל תא על נוירונים ברשתית מן הכנת שטוח הר.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים של אמצעי הזהירות הנדרשים לביצוע תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך מולטיפלקס תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ. טכניקה זו היא שיטה פשוטה ויעילה כדי לנתח את פרופיל ביטוי של קבוצת גנים מתא יחיד מאופיין על ידי תיקון-קלאמפ הקלטות מראש.

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

מוצגות כאן שיטות המספקות הוראות מפורטות לניתוח, ניתוק, תרבית ורישום מהדק טלאי מגנגליון שיווי המשקל ונוירוני גנגליון ספירלי באוזן הפנימית.

בידוד וטיפוח סומאטה גנגליון ווסטיבולרי וספירלי ממכרסמים יילודים להקלטות טלאי

למד טכניקת patch-clamp תת-תאית להקלטות מדנדריטים של נוירוני דופמין nigralיים. שיטה זו מאפשרת מיפוי תפקוד ערוצי יונים ברמת התת-תאית לחקר תפקוד נוירונלי.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

גלה סרטונים נוספים