הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון כיצד תעלות יונים בודדות עם שער מתח תורמות לתפקודים של נוירון ספציפי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת למפות את תפקוד תעלות היונים ברמה התת-תאית בנוירונים. התחל את ההליך הזה על ידי הנחת המוח על צלחת פטרי של 9 סנטימטרים, כשהחלק התחתון מכוסה בשכבה של SiliGuard.

לאחר מכן, הקיפו את המוח בסוכרוז קר כקרח-ACSF. להכנת פרוסות עטרה, בצע שני חתכים כדי להסיר את המוח הקטן ואת החלק הרוסטרלי של המוח. לאחר מכן מרחו דבק ציאנואקרילט על מגש הדגימה, והדביקו את גוש המוח למגש כך שהחלק הרוסטרלי פונה לשלב החיתוך.

לאחר מכן, מרחו כמה טיפות סוכרוז-ACSF על המוח וטבלו לאט את המגש בתא החיתוך. לאחר מכן, כוונן את סכין הגילוח בזווית של 15 מעלות בהתייחס למישור האופקי. חותכים פרוסות מוח קורונליות של כ-500 מיקרומטר בכיוון האף לפני שמגיעים לחומר השחור.

לאחר מכן התאם את העובי כדי לחתוך פרוסות של 300 מיקרומטר המכילות את אזור העניין. הפרד את הפרוסות מגוש הרקמות בעזרת מחט שופע דקה מאוד המחוברת למזרק במקביל לקצה סכין הגילוח. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לתא המילואים בחום של 34 מעלות צלזיוס למשך שעה.

בהליך זה, העבירו פרוסת מוח לתא ההקלטה. עוגן את הפרוסה בתחתית תא ההקלטה עם טבעת פלטינה, וודא שהפרוסה באיכות טובה עם משטח חלק ואחיד. לאחר מכן בחר נוירון עם דנדריט המשתרע על פני מרחק רב באותו מישור, וודא שניתן לעקוב אחר הדנדריט המעניין לסומה מוגדרת היטב.

לאחר מכן, מלאו את פיפטת התיקון בתמיסת אלקטרודה. כדי לתקן את הדנדריט במצב מחובר לתא, זהה והתמקד בחלק מהדנדריט הפעל לחץ חיובי על הפיפטה, והורד אותה באמצעות המניפולטור המיקרו

לאחר מכן מקם את הפיפטה קרוב לקרום והתאם את הלחץ על מנת ליצור גומה קטנה. לאחר מכן, שחרר את הלחץ על קצה הפיפטה ותקן את הדנדריט, תוך שליטה בהתנגדות הפיפטה. נסה להשיג התנגדות איטום גדולה מג'יגה-אוהם אחד, במקרה הטוב בין שלושה לעשרה ג'יגה-אוהם, עבור הקלטות מחוברות לתא.

לאחר מכן, החזר את הפיפטה הרחק מהקרום, בכמה מיקרומטרים, כדי למנוע עיוות של הדנדריט. זרמי הפעולה הנראים כאן מייצגים את פוטנציאל הפעולה הספונטני של נוירונים ניגרליים. כדי לדכא את זרמי הפעולה, יש למרוח חוסמי תעלות סידן ונתרן על ACSF.

לאחר מכן הפעל שלב מתח של 90 מילי-וולט, מפוטנציאל החזקה של אפס מילי-וולט, כדי לעורר את זרם הקטיון המופעל על ידי היפר-פולריזציה. בסוף ההקלטה, קרע את התיקון כדי להשיג את כל מצב התא. לאחר מכן, משוך לאט ובעדינות את הפיפטה הדנדריטית מהממברנה העצבית כדי לקבל טלאי חיצוני.

כדי להקליט מהסומה המתאימה במצב התא השלם, אתר את הסומה המתאימה של הדנדריט. הורד פיפטה עם התנגדות בין חמישה לעשרה מגה-אוהם עם תמיסה תוך-תאית מבוססת אשלגן לגוף התא. לאחר מכן הפעל לחץ שלילי קצר על קצה הפיפטה כדי לקרוע את הממברנה על מנת להשיג את מצב התא השלם.

בדוק את זהות הנוירון במצב מהדק זרם על ידי הפעלת צעדי זרם היפר ודה-פולריזציה ארוכים, ואפשר לביוציטין מהפיפטה, להתפזר לאורך הדנדריטים. לאחר 10 דקות, משוך את הפיפטה כדי לקבל תיקון חיצוני החוצה. השתמש ברצף של תנועות רוחביות קצרות כלפי מעלה כדי להעדיף סגירה נכונה של קרום התא, ברגע שהפיפטה נמצאת מעל הפרוסה, כדי לצאת לחלוטין מתא ההקלטה.

שמור את הפרוסה בתא ההקלטה למשך 15 דקות נוספות ב-ACSF סטנדרטי כדי לאפשר שיווי משקל של הביוציטין והנוירון המוקלט. לאחר מכן העבירו בעדינות את הפרוסה לבקבוק זכוכית ענבר של 25 מיליליטר המכיל ACSF סטנדרטי להיסטולוגיה. בהליך זה, אתר בערך את הנוירון המסומן בפרוסה עם אפיפלואורסצנטיות.

בחן בקצרה סוכת דנדריטי של נוירונים ואתר את האקסון והבלב האקסונלי באמצעות מטרה פי 10. לאחר מכן, עבור למיקרוסקופ הקונפוקלי, ובחר את דיודת הלייזר של 488 ננומטר כדי לעורר את הנוירון המסומן. עקוב אחר הרחבת האקסון והדנדריטים בציר Z, והקלט תמונות עוקבות על מנת לקבל מחסנית Z עבור התא כולו.

התאם את הרזולוציה של ציר Z ואסוף את התמונות הקונפוקליות של התא בהגדלה נמוכה וגבוהה. בסוף, פתח את קובץ התמונה של הנוירון באמצעות תוכנת הדמיה. השווה את תמונת ההקרנה Z עם תמונת IR-DGC בעין כדי לאתר את המיקום המדויק של פיפטת התיקון במהלך ההקלטה האלקטרופיזיולוגית.

מוצגת כאן תמונת IR-DGC של נוירון דופמין ופיפטה על הדנדריט הפרוקסימלי. עקבות הזרם מציגות את הקיבולת של זרמי דליפת ה-EN בתגובה לפקודת מתח של חמישה מילי-וולט, בתצורה מחוברת לתא, עם התנגדות איטום של חמישה ג'יגה-אוהם. שלב מתח היפרפולריזציה, מפוטנציאל ממברנה של אפס מילי-וולט, גרם לזרם קטיון המופעל על ידי היפרפולריזציה המופעל באיטיות.

עקבות הזרם היו הפוכות וצוידו בפונקציה מעריכית אחת, שנותנת קבוע זמן של 632 אלפיות השנייה. להלן תגובות המתח של כל התא שהוקלט סומה לפולסים של זרם היפר ודפולריזציה של שנייה אחת בנוכחות חוסמי זרם נתרן וסידן מגודרים במתח כדי להסיר פוטנציאל פעולה במהלך הקלטה מחוברת לתא. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו ביום אחד, אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשיג רקמה בריאה ותנאי הקלטה יציבים. בעקבות ההליך הזה, שיטות אחרות, כמו אימונוהיסטוכימיה, יכולות להתבצע במטרה לענות על שאלות נוספות כמו זהות תא העצב המוקלט. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירופיזיולוגיה לחקור את תפקודן ותפקידן של תעלות יונים מגודרות מתח בתאים מעוררים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקליט ולבחון את התפלגות הזרמים הזורמים דרך תעלות יונים מגודרות מתח בדנדריטים.