Name: כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי ImageJ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: למד כימות אוטומטי של תאים באמצעות תוספי ImageJ חדשים לניתוח מיקרוגרפיות של המוציטומטר ומבחני ניידות. שיטה זו מספקת ספירה מהירה ומדויקת לחקר ביולוגיה תאית ונוירומדע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר הבריאות ל-CP (OR 142730 ו-OR 89931). ברצוננו להודות לילנה ברקיץ' על הרעיון הראשוני שלה לניתוח חלקיקים בינאריים ב-ImageJ.

<ol><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e752(2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2016).</li>
<li>Graham, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coulter+principle%3A+foundation+of+an+industry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">The coulter principle: foundation of an industry.</a> J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).</li>
<li>Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrmerod%2C+MG+%22Animal+Cell+Culture%22">Animal Cell Culture</a>. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Imaging+Software+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Imaging Software Tools.</a> Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).</li>
<li>Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLouis%2C+KS+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).</li>
<li>Scott, W. N. Invasion and motility assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScott%2C+WN+%22Cancer+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22">Cancer Cell Culture: Methods and Protocols</a>. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-378a-5p+promotes+trophoblast+cell+survival%2C+migration+and+invasion+by+targeting+Nodal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal.</a> J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).</li>
<li>Adorno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mutant-p53%2FSmad+Complex+Opposes+p63+to+Empower+TGFbeta-Induced+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis.</a> Cell. 137, 87-98 (2009).</li>
<li>Chung, T. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+microRNA-204+mediates+migration+and+invasion+of+endometrial+cancer+by+regulating+FOXC1%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1.</a> Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%2FRev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">et al. In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+cell-counting+algorithm+for+fluorescently-stained+cells+in+migration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays.</a> Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+Intern%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Grishagin, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+cell+counting+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Automatic cell counting with ImageJ.</a> Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).</li>
<li>Thomas, C. R., Paul, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+image+analysis+in+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Applications of image analysis in cell technology.</a> Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appreciating+data%3A+warts%2C+wrinkles+and+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Appreciating data: warts, wrinkles and all.</a> Nat. Cell Biol. 8, 203(2006).</li>
<li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+picture%3F+The+temptation+of+image+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count+objects+in+an+image+in+Adobe+Photoshop%5BTitle%5D)+AND+%22Helpx.adobe.com%22%5BJournal%5D)">Count objects in an image in Adobe Photoshop.</a> Helpx.adobe.com. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html">https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html</a> (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שלבים קריטיים, פתרון בעיות, ומגבלות עצם טבעו של שיטות חישוביות אוטומטיות, במיוחד אלה של ניתוח חלקיקים, מחייבת היכולת המתמטית להגדיר חלקיקים אלה. כתוצאה מכך, את הדיוק של שני מחשבון נייד ריכוזיות דלפק assay ההגירה תלוי majorly על נאמנות תמונה, כלומר, כיצד מקרוב את התמונה שצולמה דומה מדגם תא או קרום assay הגירה. לכן בעל החשיבות העליונה לעקוב מיקרוסקופ ופרוטוקולי כיול תוכנה נלווה בצורה הטובה ביותר אפשרי. זה כולל הגבלת ר...

בשנת ספירת תאים במבחנה היא טכניקה בסיסית חשובה במגוון רחב של ניסויים בתרבית רקמה. קביעת מספר התאים במדויק בתרבות חיונית שחזור ניסיוני 1,2 סטנדרטיזציה. ספירת תאים יכול להתבצע באופן ידני באמצעות hemocytometer וכן באמצעות מגוון של שיטות אוטומטיות, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משלהם 3,4,5. רוב השיטות האוטומטיות ספירת תאים שייך לאחת משתי כיתות, אלה העושים שימוש עיקרון קולטר או cytometry זרימה. מונה קולטר לנצל התנגדות חשמלית תאים כדי לקבוע את מספר נייד וגודל. הם מהירים, מדויקים יותר זולים מאשר cytometers זרימה. עם זאת, הם משמשים לעתים נדירות עבור ספירת תאים רק בשל הניכר בעלויות שלהם לעומת ספירה ידנית 3. זרימת cytometers, מצד השני, הם יקרים, אבל יש להם יישומים רבים כגון ספירת תאים, ניתוח של צורת התאים, structure ותא פנימי למדידת סמני 4,5. מכונות המשתמשות אחד משני עקרונות אלה זמינות מיצרנים רבים. ספירה ידנית היא זולה אך זמן רב ובכפוף ההטיה בעוד בשיטות האוטומטיות לבוא עם חלק מן הזמן הדרוש הספירה הידנית אלא באמצעות 6 מכונות יקרות. הליכים נפוצים תרבית תאים אחרים נמצאים מבחני תנועתיות תא במבחנה, כלומר, נדידת תאים ופלישה 7. מבחני הגירה ופלישה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תנועתיות התא הפולשנות בתגובה לתגובה chemotactic. בנוסף, הם נמצאים בשימוש נרחב ללמוד התפתחות עוברית, בידול, תגובה דלקתית, וגרורות של סוגי תאים מרובים 7-11. תאים שתהליך ההתפתחות שלהם היגרו או פלשו דרך הממברנה נקבובי של assay הגירה ניתן לכמת בשתי דרכים שונות. ראשית, על ידי צביעה את התאים עם צבע פלואורסצנטי, דיסוציאציה הלוך ושובמ הממברנה, וכימות באמצעות קורא פלורסנט 12. הגבלה של שיטה זו של כימות היא שאף שיא ניתן להיעזר של ממברנות ואין אפשרות לניתוח נוסף 13. שיטת הכימות השנייה עבור היגרו / פלש תא להיות קבוע מוכתם צבע פלואורסצנטי או יותר נפוץ, עם צבעי ציטולוגיה כגון סגול קריסטל, צבע כחול toluidine או hematoxylin; אז תאים לכמת באמצעות תמונות מיקרוסקופיות הפוכות ידני של הקרומים האלה אשר הוא משימה מאוד זמן רב 12,13. כדי להתגבר על החסרונות של ספירת תאים ידנית, שני מוני תא אוטומטיים אמינים ומדויקים עבור ריכוז תא עבור assay הגירה פותחו. אלגוריתמים נגד תא אוטומטי אלו פותחו עבור ImageJ בתור תוסף באמצעות שפת מחשב Java של אורקל. ImageJ הוא כלי עיבוד תמונה ציבורי הנפוצה ביותר לשימוש שפותח על ידי המכון הלאומי של חימוםLTH (NIH) 14,15; וכך, כותב תוספים אלה עבור ImageJ מקל אינטגרציה קלה לתוך הקהילה הביולוגית. אוטומציה של ספירת תאים מבטיחה תפוקת שחזור גבוהות לעומת ספירה ידנית. למרות תוכנות ותוספות אחרות זמינות שניתן להשתמש בם כדי לחשב ריכוז תא באמצעות ניתוח תמונת 5,16,17, תוסף מחשבון ריכוז תא הוא מהיר והוא יכול גם להתמודד עם דילולים של תאים וטיפולים. יתר על כן, כל התוצאות והחישובים משני מונים אלה ניתן לשמור וייצא. שני תוספים המתואר במאמר זה מותאמים לשימוש מיקרוסקופ לעומת שלב הדמיה תא חי ושדה גדול של תצוגה (לכידת הממברנה כולה) הדמיה עבור ממברנות assay הגירה באמצעות היקף הניתוחים. את התוספים זמינים באופן חופשי להורדה עם הוראות התקנה מ: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table><tbody><tr><td>מדיה נוזלית קלאסית של HyClone: RPMI 1640 - עם L-גלוטמין</td><td>פישר Scientific</td><td>SH3002702</td><td>מצעי תרבית תאים&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בוביאני עוברי (FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>אספקת מדיה</td></tr><tr><td>HTR8/SVneo קו תאים טרופובלסט</td><td>תאים התקבלו מד"ר צ'ארלס גרהם (קווין' s University, Kingston, Canada)</td><td></td><td>התוכנה נועדה לעבוד עם כל קו תאים.</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>מוכן כ-0.20% (w/v) ב-10 ומיקרו; M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים 10 ס"מ</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>כל צלחות שטופלו בתרבית רקמות יתאימו</td></tr><tr><td>מוסיף ממברנה פוליאסטר Transwell - 8.0&nbsp; ומיקרו; m גודל נקבוביות</td><td>Costar 3422 הוזמן מפישר סיינטיפיק</td><td>7200150</td><td>עבור צלחות 24 בארות; גודל נקבוביות: 8.0 ומיקרו; m; קוטר 6.5 מ"מ; 0.33 ס"מ2 אזור גידול</td></tr><tr><td>HARLECO המטולוגיה כתמים וריאגנטים, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3</td><td>EMD Millipore והוזמן מ- VWR</td><td>65044A, B & </td><td>סט כתמי C Hemacolor מורכב משלושה בקבוקי פולי של 500 מ"ל (16.9 אונקיות) וכולל מקבע מתנול (תמיסה 1), כתם אאוזין או חומצה (תמיסה 2), וכתם מתילן כחול או בסיסי (פתרון 3)</td></tr> <tr><td>מוליך כותנה</td><td>Puritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח תעשייתיים חד-קצה</td><td>VWR</td><td>55411 - 055</td><td>עובי: 0.30 מ"מ (0.012 אינץ')</td></tr> <tr><td>שקופיות מיקרוסקופ - נקי מראש/רגיל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12550A3</td><td>מידות: 25 מ"מ x 75 מ"מ x 1.0 מ"מ</td></tr><tr><td>משקפי כיסוי פישרברנד - מלבנים מס' 1</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545E</td><td>עובי: 0.13 עד 0.17 מ"מ; גודל: 50 מ"מ x 22 מ"מ</td></tr><tr><td>פישר כימי הרכבה בינונית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica סטריאו מנתח מיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>המיקרוסופ מצויד במצלמת מיקרוסקופ Leica דגם MC170 HD ותוכנת המצלמה היא Leica App. Suite (LAS E2) גרסה 3.1.1 [בנייה: 490]. חלקי מיקרוסקופ:&nbsp; דגם תאורת אור ספוט LED3000: MEB126, מנשא אופטי Leica M80 דגם M80, נכרומט אובייקטיבי 1.0X, WD=90&nbsp; מ"מ דגם: MOB306 & אכרומט אובייקטיבי 0.32X, WD=303&nbsp; מ"מ דגם: MOB315, מטרת וידאו 0.5X דגם: MTU-293</td></tr><tr><td>עוזר המציטומטר</td><td>גרמניה&nbsp;</td><td></td><td>0.100 מ"מ עומק - 0.0025 מ"מ2</td></tr><tr><td>אולימפוס מיקרוסקופ אור הפוך</td><td>תאגיד אולימפוס</td><td>CKX41SF</td><td>המיקרוסופ מצויד בתוכנת Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & Camera היא אינפיניטי אנליזה גרסה 6.5.2</td></tr><tr><td>ארון זרימה למינרית 1300 סדרה A2</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>דגם: 1375</td><td>כל ארון זרימה למינרי לעבודת תרבית תאים יתאים&nbsp;</td></tr><tr><td>חממת תרביות תאים</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>דגם: 370</td><td>כל חממת תרבית תאים תתאים - התאים תורבבו בסביבה לחה, 5% CO2, 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>גרסה 1.50e</td><td>גרסה מינימלית נדרשת</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment</td><td></td> Oracle <td>גרסה 1.8.0_66</td><td>גרסה מינימלית נדרשת</td></tr></tbody></table>

כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי imagej

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

המכון הלאומי ImageJ של בריאות היא חבילת תוכנת עיבוד תמונה רבת עוצמה, זמין באופן חופשי. ImageJ יש אלגוריתמי ניתוח חלקיקים מקיפים אשר ניתן להשתמש בם ביעילות למנות חלקיקים ביולוגיים שונים. כאשר כותבים מספרים גדולות של דגימות תאים, hemocytometer מציג צוואר בקבוק בכל הנוגע לזמן. כמו כן, ספירת ממברנות מבחני הגירה / פלישה עם דלפק תא תוסף ImageJ, למרות מדויק, הוא עבודה באופן יוצא מן הכלל אינטנסיבי, סובייקטיבי, לשמצה בשל גרימת כאב בפרקי יד. כדי לתת מענה לצורך זה, פיתחנו שני תוספים בתוך ImageJ למשימה הבלעדית של hemocytometer אוטומטיות (או נפח ידוע) ועוד היד נטויה תא הגירה / הפלישה. שני תוספים להסתמך על היכולת לרכוש micrographs באיכות גבוהה עם רקע מינימלי. הם קלים לשימוש אופטימיזציה עבור ספירה וניתוח מהיר של מדגמים גדולים עם כלי ניתוח מובנים כדי לעזור כיול של ספירות. על ידי שילוב של עיקרון הליבהים של מונה סלולארי עם ניתוח אלגוריתם ספירה אוטומטי שלאחר ספירה, זה מגדיל מאוד את הקלות שבה מבחני הגירה יכולים להיות מעובד ללא כל אובדן של דיוק.

מחשבון ריכוז התא איור 1 מציג את התהליך הכולל של כיול CCC ורכישת תמונת ספיר. איור 1 א ו -1 B לתאר את תמונת כיול מרובע P וחישוב אורך P-מרובע בפיקסלים. CCC קובע ריכוז התאים בנפח נתון לפי הנוסחה: <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload...

מאמר זה מתאר את הכימות של מיקרוגרפים המוציטומטריים והנדידה/פלישה באמצעות שני תוספים חדשים של ImageJ בקוד פתוח, מחשבון ריכוז תאים ומונה בדיקת הגירה. יתר על כן, הוא מתאר פרוטוקולי קליטת וכיול תמונה וכן דן בפירוט בדרישות הקלט של התוספים.

כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי ImageJ

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להשתמש בכלי ניתוח דיגיטליים כדי לבצע ספירה מדויקת ומהירה של תאים בתמיסה או במעבר על גבי ממברנה של בדיקת פלישה. פרוטוקול זה יכול לסייע לחוקרים לכמת את מספר התאים הנדרש לטכניקות נפוצות ולבדיקות תנועתיות תאים in vitro. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שהיא מספקת ספירת תאים מהירה ומדויקת, תוך שימוש במסננים מרובים ובכלי ניתוח שונים.בתחילה, הגדירו את תאורת המיקרוסקופ למקסימום. עברו לעדשה אובייקטיבית של 4x וודאו שמסנני ניגוד פאזה (phase contrast) בשימוש. לאחר מכן, בתוך תוכנת המיקרוסקופ, הגדירו את הגדרות לכידת התמונה לערכי ברירת המחדל שלהן.כעת הניחו המוצייומטר סטנדרטי על משבתו של המיקרוסקופ וצלמו תמונה לצורך שלב כיול נפח התמונה. התאימו את זמן החשיפה לפי הצורך. ב-ImageJ, תחת מחשבון ריכוז התאים, פתחו את התמונה ולחצו על כפתור Get Image Dimension.פעולה זו ממלאת את תיבות הטקסט של רוחב וגובה התמונה עם רזולוציית התמונה בפיקסלים. לאחר מכן, בחרו את כלי הקו הישר ושרטטו קו ישר לאורך כל המרובע הראשי של ההמוציטומטר על ידי לחיצה וגרירה של הסמן. לאחר מכן, לחצו על מקש M כדי להציג את חלון התוצאות.כעת, הקלידו את הערך מעמודת האורך לתוך תיבת הטקסט p-square length במחשבון ריכוז התאים. לאחר מכן, לחצו על כפתור Calculate Image Volume כדי להפיק את נפח התמונה אל תיבת הטקסט של נפח התמונה. לבסוף, לחצו על כפתור Save כדי להשלים את כיול התוסף.לצורך ניתוח הדגימות, טענו 10 µL של תאים לשני התאים של סרט hemocytometer וכווןו את המיקוד כך שפנים התאים יהיה כהה יותר מקרום התא, כדי להבטיח מיקוד בחתך הרוחבי המרכזי של התא ולא בקטבים. לאחר מכן, כווןו את החשיפה כך שהתאים לא יהיו בחשיפת יתר. קווים של ה-hemocytometer הג görüns גבולים הם מקובלים.כעת, צלמו חמש עד עשר תמונות שאינן חופפות של האזור המרכזי של ההמוציטומטר. הרזולוציה וההגדלה של כל תמונה חייבות להיות זהות לאלו של תמונת כיול הנפח. לאחר מכן, במחשבון ריכוז התאים, לחצו על Count Cells ובחלון הקופץ, בחרו תיקייה לספירה.בשלב הבא, בתיבת הקלט של מספר הדגימות, הזינו את מספר התמונות שצולמו לכל תא, ולחצו על OK. כעת התוסף יאסוף את הנתונים. עיינו בטקסט לפרטים נוספים. כדי להתחיל, הגדירו בתוכנת המיקרוסקופ את הגדרות לכידת התמונה לערכי ברירת המחדל שלהן.עבור במת מיקרוסקופ התבחור (dissecting scope), השתמשו ברקע לבן אחיד ובמקור תאורה מעל הבמה, רצוי שניים נורות LED גמישות. כעת, הניחו על הבמה שקופית עם ממבנה שקיעה (migration assay) שהושלם. תוך התבוננות בתמונה בזמן אמת המוצגת בתוכנה, כווןנו ידנית את ההגדלה כך ששוליים של ממבנה בודד יהיו בדיוק בתוך שדה הראייה של המצלמה.לאחר מכן, כווןו את מיקומי מקור האור ואת זמני החשיפה כדי לשחזר, במידה המקרוב ביותר האפשרית, את התמונה האידיאלית, שבה צבע הרקע מינימלי והממברנה מוארת באופן אחיד. דיוק ספירת התאים תלוי ברכישת תמונה באיכות גבוהה.לפיכך, חשוב ללכוד את התמונה האיכותית ביותר שניתן להשיג באמצעות המצלמה של המשתמש, על מנת להבטיח שימוש יעיל ככל האפשר בתוספים. כעת, הוציאו את השקופית ובצעו איזון לבן (white balance) של התמונה בתוכנת המיקרוסקופ כדי להשלים את הכיול. רגע לפני הצילום, השטיחו כל ממברנה על ידי הפעלת לחץ על זכוכית הכיסוי כדי להסיר כמה שיותר בועות כלואות.כעת, בתוך התוכנה, הגדירו את מיקום תיקיית השמירה. לאחר מכן, צלמו תמונה אחת לכל ממברנה, ושמרו את קבצי התמונה כ-TIFs תוך שימוש במוסכמת שמי names של sample 001 עם עלייה הדרגתית של המספר עבור כל תמונה. מוסכמת שמיים זו נחוצה כדי שהתוסף יוכל למצוא את הקבצים.אם ברצונך לבצע תיקון שדה שטוח (flatfield correction), מצא עבור כל שקופית אזור ריק וצלם תמונת רקע (blank image). שמור את הקובץ בשם sample name blank. לאחר מכן, פתח ב-ImageJ את תוסף ה-TC.בתוך TC, לחץ על כפתור ה-Flatfield, ובתיבת הדיאלוג Choose Directory בחר בתיקייה שבה נשמרו תמונות הממברנה. כעת, פתח תמונת ממברנה של בדיקת נדידה (migration assay) ובחר ב-Color Threshold. בחלון שנפתח, הגדר את השיטה ל-Shanbhag.הגדירו את צבע הסף (threshold) ללבן. הגדירו את מרחב הצבע ל-RGB ובטלו את הסימון של אפשרות הרקע הכהה. לאחר מכן, העבירו את המכוונים העליונים לאפס ואת המכוונים התחתונים ל-255 כדי להפוך את התמונה ללבנה לחלוטין.ברגע שהצבע הופך ללבן, כוון את השורות של הצבעים הירוק והאדום עד שרק הגרעינים יהיו גלויים. בתוסף ה-TC, העתק את ערכי שורות ה-RGB לתיבות הטקסט המתאימות של סף ה-RGB בהגדרות הקונפיגורציה. לאחר מכן, לחץ על כפתור Add/Modify ועדכן את הקונפיגורציה.בתוך פאנל הגדרות התצורה, לחץ על Save כדי לשמור את ההגדרות בכונן הקשיח. כעת, כדי לספור את התמונות באמצעות תוסף ה-TC, לחץ על Count Folder ובחר את התיקייה לספירה. לאחר מכן, התוכנה תעבד את התמונות ותוסיף את הנתונים לטבלה הראשית באופן אוטומטי.כעת, בטבלה הראשית, יופיע סימן וי בעמודת ?Calibrate אם התמונה סומנה לכיול על סמך דמיון למדדי האידיאל. בחרו את כל הדגימות שסומנו לכיול.לאחר מכן, לחצו לחיצה ימנית ובחרו ב-Recount and Suggested Size. פעולה זו תספור מחדש את התמונות עם שטח החלקיקים המינימלי המוצע. לאחר מכן, לחצו שוב לחיצה ימנית ובחרו ב-Show Plot.תמונה אידיאלית תציג גרף הדומה להתפלגות נורמלית עם זנב ימני ארוך. במידת הצורך, התאימו את טווח הגדלים התחתון או את הגדרות סף ה-RGB על ידי בחירת הדגימה, לחיצה ימנית ובחירה ב-Recount and Manual Settings. לאחר מכן, הזינו את ההגדרות הרצויות ולחצו על Count כדי לספור מחדש את התמונה.כדי לכוון את הספירות באופן ידני, בחרו את הדגימות, לחצו לחיצה ימנית על הטבלה ובחרו ב-Open image with counts. התמונה המקורית תיפתח עם סימנים אדומים המייצגים כל חלקיק שנספר על ידי התוסף. בנוסף, ניתן להשתמש באפשרות Show counted binary image כדי לבדוק עד כמה תאים בודדים מובחנים היטב באמצעות סף הצבע (color thresholding).כדי להוסיף ספירה באופן ידני, החזיקו את מקש הבקרה (control) לחוץ ובצעו לחיצה שמאלית. פעולה זו תוסיף סימון במיקום הסמן, אשר יתווסף לספירה הכוללת. כדי להסיר סימון באופן ידני, לחצו לחיצה ימנית על התמונה והתוסף יסיר את הסימון הקרוב ביותר לסמן.כדי להסיר קבוצה של סמנים, בחרו אזור עניין ולחצו קליק ימני על האזור תוך לחיצה על מקש ה-control. תהליך מחשבון ריכוז התאים תלוי בתמונת כיול ה-p-square ובחישוב האורך והפיקסלים של ה-p-square. ל-p-square של המוסימטר (hemocytometer) יש נפח של 100 nanoliters, ובהינתן קבוע זה, ניתן לחשב את הנפח הכולל של התמונה לאחר המרת פיקסלים למילימטרים.השוואה בין ספירות ידניות ואוטומטיות על פני 57 תמונות מניסויים שונים ומסוגי תאים שונים, מראה כי קיים מתאם הדוק מאוד בין שתי השיטות. ריכוזים שבין חמישה מיליון ל-2,000 תאים למילליליטר נספרו במדויק באמצעות התהליך האוטומטי. המדד Q מייצג את רמת הצלילות הכללית של התמונות בהתבסס על התפלגות גדלי החלקיקים המובחנים.ערך Q הולם הוא הגבוה מ-0.5. כאשר מחילים מדדים אלו על מבחר תמונות באיכות בינונית עד מצוינת מבחינת בהירות ורעש רקע, ספירות התמונות המכוללות היו קרובות באופן משמעותי לספירות ידניות מאשר ספירות תמונות שאינן מכוללות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובהB לגבי האופן שבו ניתן לספור תאים באופן מדויק ויעיל בתמיסות ובבדיקות ניידות תאים באמצעות תוספי ImageJ מסוג CCC ו-TC.ברגע ששולטים בתוסף ה-TC, ניתן לבצע רכישת נתונים, כימות והתאמה של ספירת תאים בתוך פחות משעה. שני התוספים מסתמכים על תכונת ספירת החלקיקים של ImageJ וניתן לשנותם על ידי עריכת המקרואים המשמשים את ImageJ. דבר זה מעניק למשתמש גמישות רבה יותר להרחיב את תחום פעילות התוספים לחלקיקים אחרים.

automated-quantification-analysis-cell-counting-procedures-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Micropatterns דבק כי לנרמל ארכיטקטורה הסלולרי יכול לשמש כדי להגביר את הרגישות של זיהוי של השפעות התרופה, לשפר reproducibility ולפשט רכישת התמונה ניתוח אוטומטי. טכנולוגיה זו ייהנו סמים / siRNA מבחני המיון, שבוצעה על התרבות תומך קונבנציונלי התא וכתוצאה מכך סובל השתנות התא אל התא מוגזמת.

ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

אנו מתארים את שיטת האבטיפוס לייצור coverslips מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצופה ג'לטין להמחשת הפחתת מטריצת invadopodia בתיווך. טכניקות חישוב באמצעות תוכנה זמינה מוצגות לכימות הרמות כתוצאה של proteolysis מטריצה ​​של תאים בודדים בתוך אוכלוסייה מעורבת וקבוצות תאיות המקיפות את השדות מיקרוסקופים שלמים.

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

מקור: Dodge, R., et al. ספירת יחידות יוצרות מושבה מהירה בפורמט צלחת של 96 בארות המיושמת על המיקרוביום של דרוזופילה . J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים את הכימות של יחידות יוצרות מושבה (CFUs) של חיידקים הקשורים למעיים בזבובי דרוזופילה באמצעות גישת דילול וציפוי סדרתי. דגימות זבובים הומוגניות המכילות חיידקי מעיים מדוללות באופן סדרתי, מצופות על אגר ומודגרות כדי לאפשר צמיחת מושבה. לאחר מכן מנותחים תמונות של הלוחות באמצעות תוכנה ליישור, פילוח וספירת מושבות בכל נקודה, מה שמאפשר כימות מדויק של CFU.

כימות יחידות יוצרות מושבה של חיידקים הקשורים למעיים בזבובי דרוזופילה

פרוטוקול זה מתאר פונקציונליזציה של פני השטח הניתנת להתאמה אישית של מערכת הדסטיוביוטין, הסטרפטווידין וה-APTES על מנת לבודד סוגי תאים ספציפיים מעניינים. בנוסף, כתב יד זה מכסה את היישומים, האופטימיזציה והאימות של תהליך זה.

שיטה של ​​בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

האמבות החברתיות Dictyostelium discoideum הוקמה לאחרונה כמערכת לחקר קיפול שגוי של חלבונים ופרוטאוסטזיס. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה חדשה מבוססת הדמיה לחקר צבירת חלבונים המושרה על ידי טמפרטורה ותגובת הלחץ התאית ב-D. discoideum.

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

המאמר מתאר את הכמת של 1) את גודל ומספר של הידעיות מיקוד ו 2) אינדקס צורת תא ואת ההתפלגות שלה מתוך תמונות קונפוקלית וקד של המונאולאיירס הקונאולית של תאים MCF7.

קוונפיקציה של אזור הדבקה בתשתית התא והפצות צורות התא ב-MCF7 Cell Monolayers

אנו מציגים שיטה, המשתמשת בגישת ניתוח תמונות מבוססת שטח הניתנת להכללה כדי לזהות את ספירת התאים. ניתוח של אוכלוסיות תאים שונות ניצל את ההבדלים המשמעותיים בגובה התא ובמבנה בין סוגי תאים שונים בתוך אלגוריתם אדפטיבי.

אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים

כאן, שיטה מוצגת לניתוח של קינטיקה הצטברות חלבון נמטודה Caenorhabditis elegans. בעלי חיים מאוכלוסייה מסונכרנת גיל הם בתמונה בנקודות זמן שונות, ואחריו ספירת הכללה חצי אוטומטית CellProfiler והתאמה למודל מתמטי באמילופיט.

ניטור הצטברות חלבונים קינטיקה ב Vivo באמצעות ספירת הכללה אוטומטית ב Elegans Caenorhabditis

שיטה זו מכמתת את השפע המיקרוביאלי באמצעות תבנית צלחת של 96 בארות ליחידות יוצרות מושבות לוחות (CFUs) ומיושמת על המיקרוביום Drosophila בדגימות הומוגניות של זבובים שלמים. יחידות CFU נספרות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות אוטומטית המסופקת כאן.

ספירת יחידות יוצרות מושבה מהירה בתבנית צלחת 96 בארות המיושמת על מיקרוביום הדרוזופילה

מאמר זה מתאר שיטות צעד-אחר-צעד לאוטומציה של כימות גרעינים מבוססי תמונה באמצעות תוכנית הפעלה בקוד פתוח המאומתת על פני מגוון צפיפויות תאים. תוכנית זו מספקת אלטרנטיבה המטפלת בחסמים הקשורים לעלות, נגישות למשתמשים בעלי כישורים טכנולוגיים מוגבלים ואימות ספציפי ליישום שעלול להגביל את התועלת של טכנולוגיות קיימות.

שימוש בספריות ראייה ממוחשבת לייעול כימות הגרעינים

למד כימות אוטומטי של תאים באמצעות תוספי ImageJ חדשים לניתוח מיקרוגרפיות של המוציטומטר ומבחני ניידות. שיטה זו מספקת ספירה מהירה ומדויקת לחקר ביולוגיה תאית ונוירומדע.

כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי ImageJ

גלה סרטונים נוספים