כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי ImageJ

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להשתמש בכלי ניתוח דיגיטליים כדי לבצע ספירה מדויקת ומהירה של תאים בתמיסה או במעבר על גבי ממברנה של בדיקת פלישה. פרוטוקול זה יכול לסייע לחוקרים לכמת את מספר התאים הנדרש לטכניקות נפוצות ולבדיקות תנועתיות תאים in vitro. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שהיא מספקת ספירת תאים מהירה ומדויקת, תוך שימוש במסננים מרובים ובכלי ניתוח שונים.

בתחילה, הגדירו את תאורת המיקרוסקופ למקסימום. עברו לעדשה אובייקטיבית של 4x וודאו שמסנני ניגוד פאזה (phase contrast) בשימוש. לאחר מכן, בתוך תוכנת המיקרוסקופ, הגדירו את הגדרות לכידת התמונה לערכי ברירת המחדל שלהן.

כעת הניחו המוצייומטר סטנדרטי על משבתו של המיקרוסקופ וצלמו תמונה לצורך שלב כיול נפח התמונה. התאימו את זמן החשיפה לפי הצורך. ב-ImageJ, תחת מחשבון ריכוז התאים, פתחו את התמונה ולחצו על כפתור Get Image Dimension.

פעולה זו ממלאת את תיבות הטקסט של רוחב וגובה התמונה עם רזולוציית התמונה בפיקסלים. לאחר מכן, בחרו את כלי הקו הישר ושרטטו קו ישר לאורך כל המרובע הראשי של ההמוציטומטר על ידי לחיצה וגרירה של הסמן. לאחר מכן, לחצו על מקש M כדי להציג את חלון התוצאות.

כעת, הקלידו את הערך מעמודת האורך לתוך תיבת הטקסט p-square length במחשבון ריכוז התאים. לאחר מכן, לחצו על כפתור Calculate Image Volume כדי להפיק את נפח התמונה אל תיבת הטקסט של נפח התמונה. לבסוף, לחצו על כפתור Save כדי להשלים את כיול התוסף.

לצורך ניתוח הדגימות, טענו 10 µL של תאים לשני התאים של סרט hemocytometer וכווןו את המיקוד כך שפנים התאים יהיה כהה יותר מקרום התא, כדי להבטיח מיקוד בחתך הרוחבי המרכזי של התא ולא בקטבים. לאחר מכן, כווןו את החשיפה כך שהתאים לא יהיו בחשיפת יתר. קווים של ה-hemocytometer הג görüns גבולים הם מקובלים.

כעת, צלמו חמש עד עשר תמונות שאינן חופפות של האזור המרכזי של ההמוציטומטר. הרזולוציה וההגדלה של כל תמונה חייבות להיות זהות לאלו של תמונת כיול הנפח. לאחר מכן, במחשבון ריכוז התאים, לחצו על Count Cells ובחלון הקופץ, בחרו תיקייה לספירה.

בשלב הבא, בתיבת הקלט של מספר הדגימות, הזינו את מספר התמונות שצולמו לכל תא, ולחצו על OK. כעת התוסף יאסוף את הנתונים. עיינו בטקסט לפרטים נוספים. כדי להתחיל, הגדירו בתוכנת המיקרוסקופ את הגדרות לכידת התמונה לערכי ברירת המחדל שלהן.

עבור במת מיקרוסקופ התבחור (dissecting scope), השתמשו ברקע לבן אחיד ובמקור תאורה מעל הבמה, רצוי שניים נורות LED גמישות. כעת, הניחו על הבמה שקופית עם ממבנה שקיעה (migration assay) שהושלם. תוך התבוננות בתמונה בזמן אמת המוצגת בתוכנה, כווןנו ידנית את ההגדלה כך ששוליים של ממבנה בודד יהיו בדיוק בתוך שדה הראייה של המצלמה.

לאחר מכן, כווןו את מיקומי מקור האור ואת זמני החשיפה כדי לשחזר, במידה המקרוב ביותר האפשרית, את התמונה האידיאלית, שבה צבע הרקע מינימלי והממברנה מוארת באופן אחיד. דיוק ספירת התאים תלוי ברכישת תמונה באיכות גבוהה.

לפיכך, חשוב ללכוד את התמונה האיכותית ביותר שניתן להשיג באמצעות המצלמה של המשתמש, על מנת להבטיח שימוש יעיל ככל האפשר בתוספים. כעת, הוציאו את השקופית ובצעו איזון לבן (white balance) של התמונה בתוכנת המיקרוסקופ כדי להשלים את הכיול. רגע לפני הצילום, השטיחו כל ממברנה על ידי הפעלת לחץ על זכוכית הכיסוי כדי להסיר כמה שיותר בועות כלואות.

כעת, בתוך התוכנה, הגדירו את מיקום תיקיית השמירה. לאחר מכן, צלמו תמונה אחת לכל ממברנה, ושמרו את קבצי התמונה כ-TIFs תוך שימוש במוסכמת שמי names של sample 001 עם עלייה הדרגתית של המספר עבור כל תמונה. מוסכמת שמיים זו נחוצה כדי שהתוסף יוכל למצוא את הקבצים.

אם ברצונך לבצע תיקון שדה שטוח (flatfield correction), מצא עבור כל שקופית אזור ריק וצלם תמונת רקע (blank image). שמור את הקובץ בשם sample name blank. לאחר מכן, פתח ב-ImageJ את תוסף ה-TC.

בתוך TC, לחץ על כפתור ה-Flatfield, ובתיבת הדיאלוג Choose Directory בחר בתיקייה שבה נשמרו תמונות הממברנה. כעת, פתח תמונת ממברנה של בדיקת נדידה (migration assay) ובחר ב-Color Threshold. בחלון שנפתח, הגדר את השיטה ל-Shanbhag.

הגדירו את צבע הסף (threshold) ללבן. הגדירו את מרחב הצבע ל-RGB ובטלו את הסימון של אפשרות הרקע הכהה. לאחר מכן, העבירו את המכוונים העליונים לאפס ואת המכוונים התחתונים ל-255 כדי להפוך את התמונה ללבנה לחלוטין.

ברגע שהצבע הופך ללבן, כוון את השורות של הצבעים הירוק והאדום עד שרק הגרעינים יהיו גלויים. בתוסף ה-TC, העתק את ערכי שורות ה-RGB לתיבות הטקסט המתאימות של סף ה-RGB בהגדרות הקונפיגורציה. לאחר מכן, לחץ על כפתור Add/Modify ועדכן את הקונפיגורציה.

בתוך פאנל הגדרות התצורה, לחץ על Save כדי לשמור את ההגדרות בכונן הקשיח. כעת, כדי לספור את התמונות באמצעות תוסף ה-TC, לחץ על Count Folder ובחר את התיקייה לספירה. לאחר מכן, התוכנה תעבד את התמונות ותוסיף את הנתונים לטבלה הראשית באופן אוטומטי.

כעת, בטבלה הראשית, יופיע סימן וי בעמודת ?Calibrate אם התמונה סומנה לכיול על סמך דמיון למדדי האידיאל. בחרו את כל הדגימות שסומנו לכיול.

לאחר מכן, לחצו לחיצה ימנית ובחרו ב-Recount and Suggested Size. פעולה זו תספור מחדש את התמונות עם שטח החלקיקים המינימלי המוצע. לאחר מכן, לחצו שוב לחיצה ימנית ובחרו ב-Show Plot.

תמונה אידיאלית תציג גרף הדומה להתפלגות נורמלית עם זנב ימני ארוך. במידת הצורך, התאימו את טווח הגדלים התחתון או את הגדרות סף ה-RGB על ידי בחירת הדגימה, לחיצה ימנית ובחירה ב-Recount and Manual Settings. לאחר מכן, הזינו את ההגדרות הרצויות ולחצו על Count כדי לספור מחדש את התמונה.

כדי לכוון את הספירות באופן ידני, בחרו את הדגימות, לחצו לחיצה ימנית על הטבלה ובחרו ב-Open image with counts. התמונה המקורית תיפתח עם סימנים אדומים המייצגים כל חלקיק שנספר על ידי התוסף. בנוסף, ניתן להשתמש באפשרות Show counted binary image כדי לבדוק עד כמה תאים בודדים מובחנים היטב באמצעות סף הצבע (color thresholding).

כדי להוסיף ספירה באופן ידני, החזיקו את מקש הבקרה (control) לחוץ ובצעו לחיצה שמאלית. פעולה זו תוסיף סימון במיקום הסמן, אשר יתווסף לספירה הכוללת. כדי להסיר סימון באופן ידני, לחצו לחיצה ימנית על התמונה והתוסף יסיר את הסימון הקרוב ביותר לסמן.

כדי להסיר קבוצה של סמנים, בחרו אזור עניין ולחצו קליק ימני על האזור תוך לחיצה על מקש ה-control. תהליך מחשבון ריכוז התאים תלוי בתמונת כיול ה-p-square ובחישוב האורך והפיקסלים של ה-p-square. ל-p-square של המוסימטר (hemocytometer) יש נפח של 100 nanoliters, ובהינתן קבוע זה, ניתן לחשב את הנפח הכולל של התמונה לאחר המרת פיקסלים למילימטרים.

השוואה בין ספירות ידניות ואוטומטיות על פני 57 תמונות מניסויים שונים ומסוגי תאים שונים, מראה כי קיים מתאם הדוק מאוד בין שתי השיטות. ריכוזים שבין חמישה מיליון ל-2,000 תאים למילליליטר נספרו במדויק באמצעות התהליך האוטומטי. המדד Q מייצג את רמת הצלילות הכללית של התמונות בהתבסס על התפלגות גדלי החלקיקים המובחנים.

ערך Q הולם הוא הגבוה מ-0.5. כאשר מחילים מדדים אלו על מבחר תמונות באיכות בינונית עד מצוינת מבחינת בהירות ורעש רקע, ספירות התמונות המכוללות היו קרובות באופן משמעותי לספירות ידניות מאשר ספירות תמונות שאינן מכוללות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובהB לגבי האופן שבו ניתן לספור תאים באופן מדויק ויעיל בתמיסות ובבדיקות ניידות תאים באמצעות תוספי ImageJ מסוג CCC ו-TC.

ברגע ששולטים בתוסף ה-TC, ניתן לבצע רכישת נתונים, כימות והתאמה של ספירת תאים בתוך פחות משעה. שני התוספים מסתמכים על תכונת ספירת החלקיקים של ImageJ וניתן לשנותם על ידי עריכת המקרואים המשמשים את ImageJ. דבר זה מעניק למשתמש גמישות רבה יותר להרחיב את תחום פעילות התוספים לחלקיקים אחרים.