Name: חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: למד לבחור ולאפיין DNA aptamers ספציפיים לקבוצה עבור מולקולות קטנות הידרופוביות. השיטה מדגימה פיתוח אפטסנסור אלקטרוכימי רגיש לזיהוי מולקולות אלו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

. אנחנו אסירי תודה על תמיכה כספית של הטבע הקרן הלאומית למדע (21675112), מפתח הפרויקט בתכנית למדע וטכנולוגיה של בייג'ינג ועדת החינוך (KZ201710028027), Yanjing הצעיר המלומד תוכנית של הון רגיל אוניברסיטת...

<ol><li>Vorkamp, K., Riget, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+new+and+current-use+contaminants+in+the+Arctic+environment%3A+Evidence+of+long-range+transport+and+indications+of+bioaccumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation.</a> Chemosphere. 111, 379-395 (2014).</li>
<li>Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence%2C+fate%2C+behavior+and+ecotoxicological+state+of+phthalates+in+different+environmental+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices.</a> Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).</li>
<li>Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+phthalate+esters+in+edible+oils+by+use+of+QuEChERS+coupled+with+ionic-liquid-based+dispersive+liquid-liquid+microextraction+before+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+BioanalChem%22%5BJournal%5D)">Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography.</a> Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).</li>
<li>Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12161-013-9770-x">Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry.</a> Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).</li>
<li>Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+phthalic+acid+esters+in+Chinese+white+spirit+using+dispersive+liquid-liquid+microextraction+coupled+with+sweeping+beta-cyclodextrin-modified+micellar+electrokinetic+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography.</a> J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).</li>
<li>Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+seven+phthalic+acid+esters+in+beverages+using+ultrasound+and+vortex-assisted+dispersive+liquid-liquid+microextraction+followed+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography.</a> J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).</li>
<li>Sun, R., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+gold+nanoparticles+improved+real-time+immuno-PCR+assay+for+detecting+diethyl+phthalate+in+foodstuff+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples.</a> Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).</li>
<li>Sun, R. Y., Zhuang, H. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ay/c4ay02088j">A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody.</a> Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).</li>
<li>Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-sensitive+monoclonal+antibody-based+enzyme-linked+immunosobent+assay+for+dibutyl+phthalate+in+human+urinary%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary.</a> Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).</li>
<li>Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+development+of+sandwich+assay+based+on+the+nanobiotechnologies+for+proteins%2C+nucleic+Acids%2C+small+Molecules%2C+and+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions.</a> Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).</li>
<li>Yin, X. -B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993612000040">Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications.</a> TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).</li>
<li>Nguyen, V. -T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-based+environmental+biosensors+for+small+molecule+contaminants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants.</a> Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).</li>
<li>Groher, F., Suess, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+antibiotic-binding+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of antibiotic-binding aptamers.</a> Methods. 106, 42-50 (2016).</li>
<li>Yang, K. -A., Pei, R., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+and+amplification+protocols+for+isolation+of+aptameric+sensors+for+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules.</a> Methods. 106, 58-65 (2016).</li>
<li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).</li>
<li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+PCB-binding+DNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers.</a> Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).</li>
<li>Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+adverse+effects+of+phthalic+acid+esters+on+human+health%3A+A+review+of+recent+studies+on+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction.</a> Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).</li>
<li>Goodchild, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugates+of+oligonucleotides+and+modified+oligonucleotides%3A+a+review+of+their+synthesis+and+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties.</a> Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).</li>
<li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+oligonucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols+for+Oligonucleotides+and+Analogs%3A+Synthesis+and+Properties%22%5BJournal%5D)">A brief history of oligonucleotide synthesis.</a> Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).</li>
<li>Reese, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-and+poly-nucleotides%3A+50+years+of+chemical+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis.</a> Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).</li>
<li>Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/15257779508014668">An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides.</a> Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+group-specific+phthalic+acid+esters+binding+DNA+aptamers+via+rationally+designed+target+immobilization+and+applications+for+ultrasensitive+and+highly+selective+detection+of+phthalic+acid+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters.</a> Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).</li>
<li>Bartlett, J. M. S., Stirling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+protocols%22%5BJournal%5D)">A short history of the polymerase chain reaction.</a> PCR protocols. , 3-6 (2003).</li>
<li>Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2999980">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18428223">Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> JoVE. (32), e1485(2009).</li>
<li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).</li>
<li>Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCs+of+DNA+aptamer+and+related+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">ABCs of DNA aptamer and related assay development.</a> Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001346861530551X">Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A.</a> Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).</li>
<li>Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evolution+of+functional+DNA+using+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis.</a> J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).</li>
<li>Lou, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromagnetic+selection+of+aptamers+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).</li>
<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+selection+of+DNA+aptamers+through+microfluidic+selection+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).</li>
<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+selection+and+parallel+characterization+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative selection and parallel characterization of aptamers.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).</li>
<li>Song, K. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle-based+colorimetric+detection+of+kanamycin+using+a+DNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer.</a> Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).</li>
<li>Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517313278">Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine.</a> Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).</li>
<li>Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+DNA+monolayer+buffered+dynamic+ranges+of+mercuric+electrochemical+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor.</a> Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).</li>
<li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoprobe-enhanced%2C+split+aptamer-based+electrochemical+sandwich+assay+for+ultrasensitive+detection+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules.</a> Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).</li>
<li>Lou, X., He, L. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400507006181">Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection.</a> Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום עניין פיננסי מתחרות.

אחד מהיתרונות aptamers יוצא מן הכלל הוא כי הם מזוהים באמצעות השיטה במבחנה SELEX, בעוד נוגדנים נוצרים באמצעות ויוו immunoreactions. לכן, ניתן לבחור aptamers עם ירידה לפרטים היעד הרצוי בתנאים ניסיוני מעוצב היטב, ואילו נוגדנים מוגבלים בתנאים פיזיולוגיים.
כדי להקל על ההפרדה של רצפי מאוגד של רצפי חינם, מספר SELEX ששונה לאחרונה דווחו, אילו אלקטרופורזה נימי30, מיקרופלואידיקה31, חרוזים מגנטי / אקריליק / agarose חרוזים1...

יחד עם התפתחות כלכלית מהירה, האצה של ה תיעוש, הבנייה העירונית, זיהום סביבתי הוא חמור יותר מאי פעם. טיפוסי מזהמים סביבתיים כוללים יונים של מתכות כבדות, רעלים, אנטיביוטיקה, חומרי הדברה, משבשים האנדוקרינית ו מזהמים אורגניים מתמיד (אבא). מלבד יונים מתכתיים, רעלים, מזהמים אחרים הם מולקולות קטנות לעיתים קרובות מכילים מגוון רחב של congeners. לדוגמה, הטיילת הרעילים ביותר לכלול polychlorinated biphenyls (PCBs), פחמימנים ארומטיים polycyclic (PAHs), polybrominated biphenyl קטונים (PBDEs), dibenzo-p-דיוקסין polychlorinated (PCDDs), polychlorinated dibenzofuran (PCDFs), ו phthalic חומצה אסטרים (פאיס)1,2, אשר כולם מורכב congeners רבים. גילוי מולקולה קטנה בוצעה בעיקר על-ידי טכניקות מבוססות ספקטרומטר מסה/כרומטוגרפיה בשל מגוון של יישומים3,4,5,6. עבור גילויים באתר, נוגדן מבוססי שיטות לאחרונה היה מפותח7,8,9. עם זאת, מאז שיטות אלה הם מאוד ספציפי congener מסוימים, יש לבצע בדיקות מרובות. מה זה חמור יותר הוא כי הרומן congeners לגדול כל כך מהר, כי לא ניתן ליצור נוגדנים שלהם בזמן. לכן, ההתפתחות של קבוצה ספציפית ביולוגיים כדי לנטר את רמות סך כל congeners במבחן אחד עשוי לספק מדד לא בפז להערכת מצב זיהום סביבתי.
לאחרונה, חומצת גרעין aptamers נרחב הוחלו כרכיבים זיהוי של פלטפורמות שונות biosensing עקב שלהם יכולת זיהוי מגוון רחב של מטרות, יונים ומולקולות קטנות חלבונים ותאים10,11 ,12. Aptamers מזוהים באמצעות שיטה במבחנה בשם האבולוציה שיטתית של ליגנדים מאת העשרה מעריכית (SELEX)13,14. SELEX מתחיל עם הספרייה oligonucleotide אקראיים סינתטי לחוט אחד, אשר מכיל כ רצפים15 14-10 10. הגודל של הספרייה אקראי מבטיחה את המגוון של המבנים המועמד RNA או DNA. תהליך SELEX טיפוסי מורכב מספר סיבובים של העשרה עד הספרייה מועשר ברצפים עם זיקה גבוהה וספציפיות אל המטרה. מועשר בבריכה הסופי אז הוא רציף, ולסנן קבועי דיסוציאציה (דK) ואת סלקטיביות נגד פוטנציאל חומרים מפריעות נקבעים על-ידי טכניקות שונות כגון איגוד, כרומטוגרפיית זיקה משטח פלזמון תהודה (SPR), וכו '. 15
בשל מסיסות המים ירודה ביותר וחוסר קבוצות פונקציונליות עבור משטח הנייח, הבחירה aptamer של סבא קשה באופן תיאורטי. התקדמויות משמעותיות עבור SELEX יש speeded את הגילוי של aptamers. עם זאת, הבחירה של קבוצה ספציפית aptamers עבור סבא יש וטרם דווחו. עד כה, רק מחייב PCB DNA aptamers עם ירידה לפרטים גבוה עבור congener מסוימים כבר מזוהה16. פאיס משמשים בעיקר בחומרים פוליוויניל כלוריד, שינוי במבנהו מפלסטיק קשיח לפלסטיק גמיש, ובכך כסוכנות מרכך ומגמיש. כמה פאיס זוהו משבשים האנדוקרינית, יכול לגרום נזק חמור בכבד, תפקוד כליות, להפחית את תנועתיות הזרע הגברי, עלול לגרום סרטן האשכים17ומורפולוגיה זרע לא תקין. המתחם - וגם המיועדות לקבוצות PAE מחייב aptamers דווחו.
מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול ייצוגית לבחירת המיועדות לקבוצות aptamers דנ א כדי מאוד הידרופובי מולקולות קטנות כגון פאיס, קבוצה ייצוגית של אבא. אנחנו גם להוכיח את היישום של aptamer שנבחר לגילוי זיהום סביבתי. פרוטוקול זה מספק הדרכה ותובנות על גילוי aptamer של מולקולות קטנות הידרופוביות אחרות.

<table><tbody><tr><td>UV-2550</td><td>Shimadzu, פרוטוקול יפן</td><td></td><td>, סעיף 3.8.2</td></tr><tr><td>DNA Engnine Thermal Cycler, PTC0200</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>סעיף 3.5.1.2 ו-3.5.2</td></tr><tr><td>C1000 Touch</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>סעיף 5.3.6 ו-6.3</td></tr><tr><td>VMP3 Multichannel potentiostat</td><td>Bio-Logic Science, Claix, צרפת</td><td></td><td>סעיף 7.4, 7.8 ו-7.11</td></tr><tr><td>Sepharose 6B המופעל על ידי אפוקסי</td><td>GE Healthcare (פיסקאטאווי, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td>10220020</td><td>חרוזי ארגרוז, סעיף 2.3 ו-3.3</td></tr><tr><td>חרוזים מגנטיים של חומצה קרבוקסילית M-270</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>420420</td><td>חרוזים מגנטיים, סעיף 5.2. ו-5.3</td></tr><tr><td>Premix Taq גרסת התחלה חמה</td><td>Takara, דאליאן, סין</td><td>R028A</td><td>פולימראז, סעיף 3.5.1.1</td></tr><tr><td>PARAFILM איטום ממברנה</td><td>Bemis, ארה"ב</td><td>PM-996</td><td>סעיף 3.6.5</td></tr><tr><td>Lambda Exonuclease</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>EN0561</td><td>סעיף 3.7.1.2.מאגר התגובה 10 ופעמים מסופק יחד עם &lambda; exonuclease על ידי הספק.</td></tr><tr><td>ד"ר GenTLE נושא משקעים</td><td>Takara, דאליאן, סין</td><td>9094</td><td>סעיף 3.6.2 ו-3.8.1</td></tr><tr><td>UNIQ-10 PAGE ערכת שחזור DNA</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי)</td><td>B511135</td><td>סעיף 4.2</td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל חומצת גרעין זהב</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>1811838</td><td>צבע כתם חומצה נוצלית, סעיף 3.5.1.5</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara, דאליאן, סין</td><td>RR820A</td><td>תערובת פולימראז קונטנינג פולימראז ו-dNTPs, סעיף 5.3.5</td></tr><tr><td>2-(N-מורפולינו)חומצה אתנסולפונית (MES)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CAS: 1132-61-2</td><td>סעיף 5.2.1</td></tr><tr><td>1-אתיל-3-(3-דימתילאמינפרופיל) קרבודימיד הידרוכלוריד (EDC)</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>CAS: 25952-53-8</td><td>סעיף 5.2.2</td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6066-82-6</td><td>סעיף 5.2.3</td></tr><tr><td>מרקפטוהקסנול (MCH)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CAS: 1633-78-9</td><td>סעיף 7.7</td></tr><tr><td>אלקטרודת זהב</td><td>שנחאי Chenhua</td><td>CHI101</td><td>סעיף 7.4. - 7.11</td></tr><tr><td>טריס (2-קרבוקסיאתיל) פוספין הידרוכלוריד (TCEP)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CAS: 51805-45-9</td><td>סעיף 7.5</td></tr><tr><td>O-(2-מרקפטואתיל)-O'-מתיל-הקסה-(אתילן גליקול)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CAS: 651042-82-9</td><td>סעיף 7.7</td></tr><tr><td>דיאתיל-הקסיל פתלט (DEHP)</td><td>המכון הלאומי למטרולוגיה, סין</td><td>CAS: 117-81-7</td><td>סעיף 7.11</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 9005-64-5</td><td>polyoxyethy-lene(20) סורבייטן מונולאורט</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 9002-93-1</td><td>חומר פעיל משטח לא יוני</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>10 מ"מ מאגר פוספט מכיל 1 M NaCl, pH 7.4</td></tr></tbody></table>

חומצה פתלית אסתר מחייב dna aptamer ובחירת, אפיון, ליישום aptasensor אלקטרוכימי

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

חומצה פתלית והפרופסור אסטרים (פאיס) של הקבוצות הגדולות של מזהמים אורגניים מתמיד. זיהוי המיועדות לקבוצות פאיס רצוי מאוד עקב גידול מהיר של congeners. DNA aptamers הוחלו יותר ויותר כרכיבים זיהוי בפלטפורמות ביוסנסור, אך בחירת aptamers לעבר מטרות מולקולה קטנה מאוד הידרופוביות, כגון פאיס, לעתים נדירות דווח. עבודה זו מתאר שיטה המבוססת על חרוז תוכנן כדי לבחור קבוצה ספציפית aptamers ה-DNA אל פאיס. קבוצת אמינו functionalized dibutyl פתלאט (DBP-NH2) המטרה עוגן היה מסונתז, ותשמרו על החרוזים מופעל אפוקסי agarose, מאפשר את התצוגה של קבוצת אסתר phthalic על פני השטח של המטריצה הנייח, ו לכן הבחירה של קלסרים קבוצה ספציפית. אנחנו נקבע את קבועי דיסוציאציה של המועמדים aptamer על ידי תגובת שרשרת הפילמור כמותיים בשילוב עם הפרדה מגנטית. הזיקות היחסי ואת מידת הבררנות של aptamers אל פאיס אחרים נקבעו על ידי מבחני תחרותי, שבו המועמדים aptamer היו ותחום מראש ל DBP-NH2 המצורפת beads מגנטי, שוחרר תגובת שיקוע על דגירה עם פאיס שנבדקו או חומרים מפריעות פוטנציאליים אחרים. וזמינותו תחרותי הוחל משום שסיפקה השוואה נתיישב זיקה בין פאיס שהיה אין קבוצות פונקציונליות עבור משטח הנייח. לבסוף, אנו הפגינו הזיוף של aptasensor אלקטרוכימי, השתמשו בו על זיהוי העדינה, סלקטיבי של פתלאט bis(2-ethylhexyl). פרוטוקול זה מספק תובנות על גילוי aptamer של מולקולות קטנות הידרופוביות אחרות.

אנו תוכנן, מסונתז פתלאט dibutyl את קבוצת אמינו functionalized (DBP-NH2) כיעד עוגן (איור 1F). אנחנו מכן ביצע את מבחר aptamer DNA פאיס באמצעות DBP-NH2 כיעד עוגן ובעקבות היעד הקלאסי מבוסס על הנייח השיטה (איור 2). בכל סבב, PCR פיילוט בוצעה באמצעות העמוד denatured כדי למטב את מחזור מספר PCR (איור 3). העמוד denatured, במקום דף מקורי, הוא הציע בתוקף כי אנחנו ועמיתים אחרים מצאו כי תוצרי...

פרוטוקול כדי להפוך את הבחירה במבחנה אפיון של חומצה פתלית המיועדות לקבוצות אסתר-איגוד ה-DNA aptamers מוצג. היישום של aptamer שנבחר ב aptasensor אלקטרוכימי נכלל גם.

חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחור אפטמרים DNA ספציפיים לקבוצה למולקולות קטנות הידרופוביות מאוד ולהשתמש באפטמר שנבחר לפיתוח חיישן ביוכימי רגיש. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום בחירת האפטמרים, כיצד לבחור ולאפיין אפטמרים ספציפיים לקבוצה כאשר המטרות הן מולקולות הידרופוביות מאוד. בעוד שהחלק השימושי ביותר בשיטה זו הוא פיתוח חיישנים ביולוגיים אלקטרוכימיים, לזיהוי כותרות.חיישנים ביולוגיים אלה אמורים לעבוד גם עבור מדידות הזיקה של האפטמר שלנו. כדי להתחיל בתגובה, הוסף 100 מיקרוליטר מים ללא RNase למוצר ה-aptamer PCR המטוהר. מערבל את התערובת עד שהמשקעים נמסים.תגובת אקסונוקלאז למבדה רגישה לריכוז המלח והיא תוצר שיש להתרבות על ידי משקעי אתנול אך איזופרופנול אחר. מניחים בכל אחד מחמישה צינורות מיקרו-צנטריפוגה, חמישה מיקרוליטרים מתמיסת האפטמר, 11 מיקרוליטר מים ללא רנאז ושני מיקרוליטרים של מאגר תגובה פי 10. הוסף שני מיקרוליטרים של מים ללא Rnase ותמיסות של שתיים, חמש, שמונה ו-10 יחידות של למבדה אקסונוקלאז במים ללא Rnase לצינור אחד כל אחד.מערבבים היטב עם פיפטינג עדין. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות ובטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן החזיקו את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס והכינו ג'ל עמוד מקורי של 12%.הוסף לכל צינור מיקרוליטר אחד של צבע טעינה וארבעה מיקרוליטר מים ללא רנאז. הפעל את התערובות בג'ל הדף המקורי ב -150 וולט למשך 45 דקות. זהה את הכמות הנמוכה ביותר של אקסונוקלאז למבדה הדרושה ליצירת DNA חד-גדילי לחלוטין.בצע תגובה בקנה מידה גדול ליצירת DNA חד-גדילי. עבור כל יעד קשירה שייבדק, דגרו 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מקודדי DBP פונקציונליים ממוצעים עם 500 מיקרוליטר של תמיסה מיקרו-מולרית אחת של DBP-1 למשך שעה בטמפרטורת החדר תוך כדי סיבוב. ואז השליכו את הסופרנטנט.שטפו את החרוזים ארבע פעמים עם מנות של 200 מיקרוליטר של מאגר קשירת PAE והשעו מחדש את החרוזים ב-10 מיקרוליטר של מאגר קשירת PAE. השג 10 פיזורי בדיקת יעד קשירה מיקרו-מולרית במאגר קשירה PAE. זה נהדר ללכת לפיזור המטרות ההידרופוביות במאגר קשירת PAE.כדי להבטיח זאת, יש העשרה של הספרייה, נבחרו במבחני זיקה. הוסף 10 מיקרוליטר של חרוזים מקודדים DBP-1 ל-110 מיקרוליטר מכל תמיסת בדיקת יעד. דגרו על התערובות למשך שעה אחת ואספו את הסופרנטנטים על ידי הפרדה מגנטית.יש לדלל את הסופרנטנטים פי 100 ולהשתמש בשלושה מיקרוליטרים עבור כל PCR כמותי. חשב את הזיקות היחסיות על ידי חלוקת מספר ה-DBP-1 ששוחרר בנוכחות דגימת הבדיקה במספר ה-DBP-1 ששוחרר במאגר קשירת PAE בלבד. לפני ביצוע המדידות יש לסנתז ולטהר את בדיקת רצף הליבה התיולטי המבוססת DBP-1 ואת בדיקת האיתות.להרכיב מחדש את הגשושית התיולטיבית ואת בדיקת האיתות וכ-100 תמיסות מיקרו-טוחנות במים נטולי נוקלאז. לאחר מכן יש ללטש אלקטרודת זהב בקוטר שני מילימטר למשטח דמוי מראה עם אבקת אלומינה אחת, 0.3 ו-0.5 מיקרון ומטלית מיקרופייבר למשך חמש דקות כל אחת. סוניקציה של האלקטרודה במים טהורים במיוחד למשך חמש דקות לאחר כל ליטוש.טבלו את האלקטרודה המלוטשת בתמיסה של 0.5 מולרית של חומצה גופרתית. נקה את האלקטרודה עם 35 סריקות וולטמטריה מחזוריות רצופות ממינוס 0.4 לחיובי 1.2 וולט לעומת קלומל כספית ב-100 מילי-וולט לשנייה. לאחר מכן, הכינו בצינור צנטריפוגה דק דופן תערובת של 0.5 בדיקה תיולרית מיקרו-מולרית DBP-1.ו-0.5 מיקרומולר FC שינה את DBP-1 ב-100 מיקרוליטר של PBS. מחממים את התערובת באמבט מים המוגדר ל 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן הניחו לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר באמבט המים.מוסיפים לתערובת המקוררת מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי TCEP של 10 מילי-מולרית ושומרים בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן טבלו את אלקטרודת הזהב הנקייה בתערובת למשך 12 שעות בטמפרטורת החדר. שטפו את האלקטרודה עם PBS ולאחר מכן טבלו את האלקטרודה בתמיסה של מילי-מולרית אחת של PEG תיולטי ב-PBS למשך שעה.שטפו היטב את האלקטרודה עם מאגר קשירת PAE ללא מטרה וטבלו את האלקטרודה במאגר. לאחר מכן תאים אלקטרוליטיים סוניקטיים של אלקטרודת נגד פלטינה ואלקטרודת ייחוס קלומל רוויה למשך שתי דקות כל אחד במים טהורים במיוחד ומאגר מחייב PAE ברצף. פתח את הגל המרובע של תוכנת מכשיר וולטמטריה והזן את פרמטרי הניסוי.מלאו תא אלקטרוליטי נקי במאגר מחייב PAE ללא מטרה. חבר את שלוש האלקטרודות הנקיות לפוטנציוסטט וטבול את האלקטרודות במאגר. רכוש סריקת SWV ברקע.לאחר מכן טבלו את האלקטרודה העובדת בזהב בתמיסת DEHP של 10 פיקמולר במאגר קשירה PAE למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו היטב את האלקטרודה עם מאגר מחייב PAE. טבלו את כל שלוש האלקטרודות במאגר קשירת PAE טרי ואספו עקומת SWV נוספת תוך שימוש באותם פרמטרים כמו קודם.חזור על תהליך זה עם הגדלת ריכוזים של DEHP כדי לקבל עקומת טיטרציה. הכמות המינימלית של למבדה אקסונוקלאז הדרושה להשגת DNA גדיל יחיד בלבד נמצאה כשתי יחידות המבוססות על תגובות בקנה מידה קטן. מועמד האפטמר DBP-1 זוהה על ידי SELEX ואחריו ריצוף תפוקה גבוה.DBP-1 הראה ספציפיות קבוצתית טובה לקונגנרים PAE. חיישן aptasensor אלקטרוכימי המשתמש ב-DBP-1 הגיב באופן סלקטיבי ל-DEHP על פני מזהמים סביבתיים נפוצים אחרים. ה-aptasensor היה רגיש מאוד ל-DEHP עם תגובה בריכוזים נמוכים עד 10 פיקמולר.חלקיק לייזר שבו בחירה ואפיון של אפטמרים למולקולות קטנות הידרופוביות מסוכנות. אפיון ונידוף של אפטאמרים של מולקולות קטנות הידרופוביות כמו PAE הוא בדרך כלל מאתגר למדי, בשל המסיסות המוגבלת ביותר במים והמשקל המולקולה הנמוך של ה-PAEs. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור aptasensors אלקטרוכימיים וכיצד להשתמש בו כדי לזהות את הכותרות.

phthalic-acid-ester-binding-dna-aptamer-selection-characterization

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

פרוטוקולים Selex מהווים סבבים רבים של ברירה, שכל אחד מהם דורש התחדשות של ligands כבול, אשר בתורו דורשים רצפים פריימר קבוע איגוף האזורים ספריה אקראי. רצפים אלה תחל קבוע יכול להפריע בתהליך הבחירה (חיוביות שגויות תשלילים). כאן אנו מציגים פריימר ללא פרוטוקול.

פריימר ללא aptamer לבחירה באמצעות ספריית ה-DNA אקראיים

"ה-DNA" חיישנים, reagentless, biosensors אלקטרוכימיים כי ביצועים טובים גם כאשר תיגר ישירות בדם מטריצות מורכבות אחרות, הותאמו זיהוי של מגוון רחב של חומצת גרעין חלבון, ו analytes מולקולה קטנה. כאן אנו מציגים הליך כללי עבור ייצור ושימוש של חיישנים כאלה.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

פרוטוקול מסופק לבחירת אפטמרים ממתגי מבנה עבור מטרות מולקולות קטנות בהתבסס על שיטת בחירת חרוזים מגנטיים קפדנית ניתנת לכוונון. אפטמרים שנבחרו עם תכונות מיתוג מבנה מועילים לבדיקות הדורשות שינוי קונפורמציה כדי לאותת על נוכחות מטרה, כגון בדיקת ננו-חלקיקי הזהב המתוארת.

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

MicroScale Thermophoresis (MST) היא טכנולוגיה רגישה לאפיון אינטראקציות aptamer-מטרה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול MST לאפיון אינטראקציות בין אפטמר למולקולות קטנות.

מיפוי אתר הקישור של Aptamer על ATP שימוש microscale Thermophoresis

פרוטוקול לפיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA הכוללת של אלקטרודות פחמן חלקיקי-לאחרונה, המסך המודפס מיוצב חומצה, זהב polylactic לזהות ויבריו parahaemolyticus מוצג.

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

פעילות נוקלאז שונה היתה קשורה לתנאים אנושיים שונים, המשמש כבסיס הפוטנציאל שלה כמו סמנים. מודולרי וקל ליישם את מתודולוגיית ההקרנה הציג בנייר זה מאפשר את הבחירה של חומצות גרעין ספציפיים בדיקה לרתימת פעילות נוקלאז כמו סמנים של מחלה.

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) כדי לנתח את קינטיקה של הקשר והדיסוציאציה של הקשירה בין אפטמר DNA לטטרציקלין, כולל הכנת דגימות, הפעלת תקנים ודגימות, ופענוח הנתונים המתקבלים.

קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה

צעד הכרחי בפיתוח אפטמר נגד סרטן הוא לבחון את קשירתו למטרה. אנו מדגימים בדיקה מבוססת ציטומטריה של זרימה כדי לחקור את הקשירה הזו, תוך הדגשת החשיבות של הכללת אפטמר בקרה שלילית ותאים סרטניים חיוביים או שליליים עבור אותו חלבון מסוים.

בדיקת קשירה של חלבון פני התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה להערכת סלקטיביות וספציפיות של אפטמר אנטי-סרטני

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת הגברה מעריכית מהירה, תלת שלבית, מבוססת אפטמר כדי לזהות מטרות. הכנת דגימות, הגברת אותות ופיתוח צבע מכוסים כדי ליישם מערכת זו כדי לזהות נוכחות של תיאופילין על פני זה של קפאין.

זיהוי מטרות מבוסס Aptamer המתאפשר על ידי תגובת הגברה מעריכית איזותרמית G-Quadruplex תלת-שלבית

פרוטוקול זה מתאר את התכנון של בדיקות הכלאה מפוצלות תוך שימוש באפטמר מואר פלואורסצנטי DAP-10-42 כמדווח אותות ויישומם לזיהוי חומצות גרעין והבחנה בין מטרות עם החלפות נוקלאוטידים בודדים.

בדיקת הכלאה מפוצלת המשתמשת באפטמר אור פלואורסצנטי של DNA כמדווח אותות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות לרצף

למד לבחור ולאפיין DNA aptamers ספציפיים לקבוצה עבור מולקולות קטנות הידרופוביות. השיטה מדגימה פיתוח אפטסנסור אלקטרוכימי רגיש לזיהוי מולקולות אלו.

חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי

גלה סרטונים נוספים