חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחור אפטמרים DNA ספציפיים לקבוצה למולקולות קטנות הידרופוביות מאוד ולהשתמש באפטמר שנבחר לפיתוח חיישן ביוכימי רגיש. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום בחירת האפטמרים, כיצד לבחור ולאפיין אפטמרים ספציפיים לקבוצה כאשר המטרות הן מולקולות הידרופוביות מאוד. בעוד שהחלק השימושי ביותר בשיטה זו הוא פיתוח חיישנים ביולוגיים אלקטרוכימיים, לזיהוי כותרות.

חיישנים ביולוגיים אלה אמורים לעבוד גם עבור מדידות הזיקה של האפטמר שלנו. כדי להתחיל בתגובה, הוסף 100 מיקרוליטר מים ללא RNase למוצר ה-aptamer PCR המטוהר. מערבל את התערובת עד שהמשקעים נמסים.

תגובת אקסונוקלאז למבדה רגישה לריכוז המלח והיא תוצר שיש להתרבות על ידי משקעי אתנול אך איזופרופנול אחר. מניחים בכל אחד מחמישה צינורות מיקרו-צנטריפוגה, חמישה מיקרוליטרים מתמיסת האפטמר, 11 מיקרוליטר מים ללא רנאז ושני מיקרוליטרים של מאגר תגובה פי 10. הוסף שני מיקרוליטרים של מים ללא Rnase ותמיסות של שתיים, חמש, שמונה ו-10 יחידות של למבדה אקסונוקלאז במים ללא Rnase לצינור אחד כל אחד.

מערבבים היטב עם פיפטינג עדין. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות ובטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן החזיקו את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס והכינו ג'ל עמוד מקורי של 12%.

הוסף לכל צינור מיקרוליטר אחד של צבע טעינה וארבעה מיקרוליטר מים ללא רנאז. הפעל את התערובות בג'ל הדף המקורי ב -150 וולט למשך 45 דקות. זהה את הכמות הנמוכה ביותר של אקסונוקלאז למבדה הדרושה ליצירת DNA חד-גדילי לחלוטין.

בצע תגובה בקנה מידה גדול ליצירת DNA חד-גדילי. עבור כל יעד קשירה שייבדק, דגרו 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מקודדי DBP פונקציונליים ממוצעים עם 500 מיקרוליטר של תמיסה מיקרו-מולרית אחת של DBP-1 למשך שעה בטמפרטורת החדר תוך כדי סיבוב. ואז השליכו את הסופרנטנט.

שטפו את החרוזים ארבע פעמים עם מנות של 200 מיקרוליטר של מאגר קשירת PAE והשעו מחדש את החרוזים ב-10 מיקרוליטר של מאגר קשירת PAE. השג 10 פיזורי בדיקת יעד קשירה מיקרו-מולרית במאגר קשירה PAE. זה נהדר ללכת לפיזור המטרות ההידרופוביות במאגר קשירת PAE.

כדי להבטיח זאת, יש העשרה של הספרייה, נבחרו במבחני זיקה. הוסף 10 מיקרוליטר של חרוזים מקודדים DBP-1 ל-110 מיקרוליטר מכל תמיסת בדיקת יעד. דגרו על התערובות למשך שעה אחת ואספו את הסופרנטנטים על ידי הפרדה מגנטית.

יש לדלל את הסופרנטנטים פי 100 ולהשתמש בשלושה מיקרוליטרים עבור כל PCR כמותי. חשב את הזיקות היחסיות על ידי חלוקת מספר ה-DBP-1 ששוחרר בנוכחות דגימת הבדיקה במספר ה-DBP-1 ששוחרר במאגר קשירת PAE בלבד. לפני ביצוע המדידות יש לסנתז ולטהר את בדיקת רצף הליבה התיולטי המבוססת DBP-1 ואת בדיקת האיתות.

להרכיב מחדש את הגשושית התיולטיבית ואת בדיקת האיתות וכ-100 תמיסות מיקרו-טוחנות במים נטולי נוקלאז. לאחר מכן יש ללטש אלקטרודת זהב בקוטר שני מילימטר למשטח דמוי מראה עם אבקת אלומינה אחת, 0.3 ו-0.5 מיקרון ומטלית מיקרופייבר למשך חמש דקות כל אחת. סוניקציה של האלקטרודה במים טהורים במיוחד למשך חמש דקות לאחר כל ליטוש.

טבלו את האלקטרודה המלוטשת בתמיסה של 0.5 מולרית של חומצה גופרתית. נקה את האלקטרודה עם 35 סריקות וולטמטריה מחזוריות רצופות ממינוס 0.4 לחיובי 1.2 וולט לעומת קלומל כספית ב-100 מילי-וולט לשנייה. לאחר מכן, הכינו בצינור צנטריפוגה דק דופן תערובת של 0.5 בדיקה תיולרית מיקרו-מולרית DBP-1.

ו-0.5 מיקרומולר FC שינה את DBP-1 ב-100 מיקרוליטר של PBS. מחממים את התערובת באמבט מים המוגדר ל 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן הניחו לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר באמבט המים.

מוסיפים לתערובת המקוררת מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי TCEP של 10 מילי-מולרית ושומרים בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן טבלו את אלקטרודת הזהב הנקייה בתערובת למשך 12 שעות בטמפרטורת החדר. שטפו את האלקטרודה עם PBS ולאחר מכן טבלו את האלקטרודה בתמיסה של מילי-מולרית אחת של PEG תיולטי ב-PBS למשך שעה.

שטפו היטב את האלקטרודה עם מאגר קשירת PAE ללא מטרה וטבלו את האלקטרודה במאגר. לאחר מכן תאים אלקטרוליטיים סוניקטיים של אלקטרודת נגד פלטינה ואלקטרודת ייחוס קלומל רוויה למשך שתי דקות כל אחד במים טהורים במיוחד ומאגר מחייב PAE ברצף. פתח את הגל המרובע של תוכנת מכשיר וולטמטריה והזן את פרמטרי הניסוי.

מלאו תא אלקטרוליטי נקי במאגר מחייב PAE ללא מטרה. חבר את שלוש האלקטרודות הנקיות לפוטנציוסטט וטבול את האלקטרודות במאגר. רכוש סריקת SWV ברקע.

לאחר מכן טבלו את האלקטרודה העובדת בזהב בתמיסת DEHP של 10 פיקמולר במאגר קשירה PAE למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו היטב את האלקטרודה עם מאגר מחייב PAE. טבלו את כל שלוש האלקטרודות במאגר קשירת PAE טרי ואספו עקומת SWV נוספת תוך שימוש באותם פרמטרים כמו קודם.

חזור על תהליך זה עם הגדלת ריכוזים של DEHP כדי לקבל עקומת טיטרציה. הכמות המינימלית של למבדה אקסונוקלאז הדרושה להשגת DNA גדיל יחיד בלבד נמצאה כשתי יחידות המבוססות על תגובות בקנה מידה קטן. מועמד האפטמר DBP-1 זוהה על ידי SELEX ואחריו ריצוף תפוקה גבוה.

DBP-1 הראה ספציפיות קבוצתית טובה לקונגנרים PAE. חיישן aptasensor אלקטרוכימי המשתמש ב-DBP-1 הגיב באופן סלקטיבי ל-DEHP על פני מזהמים סביבתיים נפוצים אחרים. ה-aptasensor היה רגיש מאוד ל-DEHP עם תגובה בריכוזים נמוכים עד 10 פיקמולר.

חלקיק לייזר שבו בחירה ואפיון של אפטמרים למולקולות קטנות הידרופוביות מסוכנות. אפיון ונידוף של אפטאמרים של מולקולות קטנות הידרופוביות כמו PAE הוא בדרך כלל מאתגר למדי, בשל המסיסות המוגבלת ביותר במים והמשקל המולקולה הנמוך של ה-PAEs. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור aptasensors אלקטרוכימיים וכיצד להשתמש בו כדי לזהות את הכותרות.