שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

המטרה הכללית של שיטה זו היא קיבוע של עוברים של Zebrafish לצורך דימות חי, המאפשר צמיחה תקינה של אזור הגוף האחורי. ניתן להתאים שיטה זו לדימות של אזורים אחרים ב-Zebrafish המתפתח. טכניקה זו מסייעת במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של ההתפתחות, כגון כיצד התנהגויות של תאים בודדים מובילות למורפוגנזה ברמת רקמות שלמות.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת תנועה חופשית של החלק האחורי של הגוף תוך שמירה על העובר באוריינטציה הנכונה. ראשית, הוסיפו agarose בנקודת התכה נמוכה בריכוז סופי של 1.5% למצע E3 במבחנה של 50 milliliters, והמיסו את ה-agarose על ידי חימום במיקרוגל. המתינו עד שהתמיס יגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 42 עד 45 degrees celsius במקלח מים או באינקובטור שולחני.

לאחר משיכת מחטי זכוכית לפי הפרוטוקול הכתוב. בעזרת פינצטה, שברו את המחט מעט אחרי הנקודה שבה היא גמישה כדי ליצור מחט נקייה וחדה להכוונת עוברים ולהסרת עודפי אגרוז. הגדילו את העוברים עד לשלב המתאים במצע E3.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה בינוקולרי, השתמשו בפינצטה חדה כדי להסיר את הדחור (dechorionate) מהעוברים. הדגרימו את העוברים לאחר הסרת הדחור למשך חמש דקות לפחות בתמיסת עבודה של tricaine. לאחר מכן, השתמשו בפיפטת פסטור מזכוכית כדי להעביר את העובר ללא הדחור עם כמות מינימלית של E3 ישירות לשפופרת של 50 מיליליטר המכילה agarose בטמפרטורה של 45 degree celsius.

הוציאו את העוברי יחד עם כמיליליטר אחד של האגרוז למס and העבירו כ-100 µL מהמדיום עם העובר למרכז של מיקרו-באר בעלת קוטר של 10 מ"מ בתחתיתה של צלחת פטרי עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ. בזמן שהמדיום למס מתמצק, העבירו את העובר לקצה מעגל האגרוז, כאשר הזנב פונה החוצה. השתמשו במחט קפילרית כדי לכוון את העובר למצב צדדי ככל האפשר לצורך דימות של התפתחות הגוף האחורית.

לאחר מכן, בעזרת הקפילריה, החזיקו את העובר באוריינטציה לטרלית הרצויה עד שהג'ל יתקשח לחלוטין. לאחר שטיפת האגרוזה התקשחה, השתמשו בתמיסת עבודה של tricaine כדי להציף את צלחת הפטרי. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי עם בסיס תאורה תחתון, כווננו את מיקום המראה ואת זווית האור הפוגע כך שהניגודיות החזקה תאפשר לראות בבירור את החיתוכים באגרוזה.

לביצוע החתך הראשון, השתמשו במחט קפילרית או במיקרו-סקלפל כדי לחתוך את האגרוז בתנועת מסור מעלה ומטה, בסמוך ובאמצע החלמון, ממש מאחורי שדות הלב שנוצרים, במורד הסומריט החמישי הקדמי, ועד חדירה מלאה דרך האגרוז לזכוכית. נקודה קריטית כאן היא להבטיח שהעובר לא ייפגע בזמן חיתוך האגרוז מעל שק החלמון. לאחר מכן, בצעו את החתכים השני והשלישי, החל מהעובר ומטה עד לזכוכית, במשיק לחמשת הסומריטים הראשונים, כדי לאפשר פתיחה גבית של הגוף האחורי.

לאחר מכן, החל מהמפגש של חיתוכים אחת ושלוש, בצעו חיתוך אלכסוני איטי לכיוון סוף חיתוך שלוש תוך כדי הרמה איטית כלפי מעלה כדי לשחרר את ריבוע האגרוז המקיף את הגוף האחורי. באמצעות פינצטה חדה, הסירו את גושי האגרוז ששוחררו מתוך תווך העוברים, כאשר אתם נשענים על דופן פטרית הפטרי כדי להוציא את חלקי האגרוז. לפני קיבוע הדגימה, השתמשו ב-1% agarose ב-E3 כדי לצפות צלחת פלסטיק של 100 מילימטר עד לגובה של חמישה מילימטרים והמתינו להת굳דות.

לאחר מכן, הניחו טיפה של 1 ml אגרוז בנקודת התמסכות נמוכה במרכז הצלחת והמתינו שגם היא תתקשה. הטמיעו את העוברים באגרוז בנקודת התמסכות נמוכה כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. עם זאת, הפעם, הוציאו את העובר מהמבחנה של 50 ml אגרוז באמצעות טיפה קטנה של תמיסה, והניחו טיפה קטנה זו מעל לטיפה של 1 ml במרכז הצלחת.

השתמשו במחט הקפילרית כדי למקם את העובר במרכז הטיפה הקטנה ושמרו על הכיוון הנכון שלו עד להתגבשות הג'ל. לבסוף, השתמשו בתמיסת עבודה של tricaine כדי להמריץ את הצלחת ולהסיר את עודפי האגרוז. סרטון מונפש זה מציג דוגמה לעובר Zebrafish שהוזרק לו mRNA המקודד עבור החלבון הפלואורסצנטי הפוטוקונברטיבי kikumeGR, לאחר מכן קובע בשלב של 15 סומיטים ועבר דימיון בשיטת time-lapse למשך 12 שעות.

חלקו האחורי של הגוף נותר חופשי לתנועה ומציג שינויים מורפולוגיים דומים לאלו הנראים בעוברי שניתן להם להתפתח ללא הכוריון שלהם בתנאי תרבית רגילים. בסרטון זה, עוברי שלב 16 התאים הוזרקו ב-mRNA המקודד ל-histone 2BRFP, המסמן את הגרעינים, ול-CAAXGFP, המסמן את ממברנות התאים. תמונות צולמו במיקרוסקופ multiphoton אנכי עם עדשת שיקוע במים 25X, החל משלב 10 הסומיטים ובמשך שלוש שעות, כדי להמחיש את התנהגות התאים במהלך היווצרות ניצן הזנב.

ניתן לראות תאים המייצרים בליטות פעילות ותנועה כוונית בעודו של ניצן הזנב נוצר באופן תקין. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 20 דקות במידה והיא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שהעובר נמצא במצב צדי בזמן הת굳דות ג'ל האגרוז.

אחרכך, אזור העניין יזוז במהירות אל מחוץ לשדה הראייה במהלך ההדמיה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה ברורה של אופן קיבועו של עובר דג זברה (Zebrafish) להדמיה חיה של התארכות הגוף האחורית.