שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להרכיב עוברי דג זברה להדמיה חיה, המאפשרת צמיחה תקינה של אזור הגוף האחורי. ניתן להתאים שיטה זו להדמיה של אזורים אחרים של דג הזברה המתפתח. טכניקה זו עוזרת לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון כיצד התנהגויות של תאים בודדים מובילות למורפוגנזה ברמת הרקמות השלמות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת את המומנט החופשי של הגוף האחורי תוך שמירה על העובר בכיוון הנכון. כדי להתחיל, הוסף אגרוז נקודת התכה נמוכה בריכוז סופי של 1.5% למדיום E3 בשפופרת של 50 מיליליטר, והמיס את האגרוז על ידי חימום במיקרוגל. אפשר לתמיסה להתייצב ל-42 עד 45 מעלות צלזיוס באמבט מים או באינקובטור ספסל.

לאחר משיכת מחטי זכוכית לפי פרוטוקול הטקסט. בעזרת זוג מלקחיים, שברו את המחט ממש מעבר לנקודה שבה היא מתגמשת כדי ליצור מחט נקייה וחדה לכיוון העוברים ולהסרת עודפי אגרוז. להעלות את העוברים עד לשלב המתאים במדיום E3.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ ניתוח דו-עיני, השתמש בזוג מלקחיים חדים כדי לפרק את העוברים. דגרו על העוברים המפורקים למשך חמש דקות לפחות בתמיסת עבודה של טריקאין. לאחר מכן השתמש בפיפטה מזכוכית של פסטר כדי להעביר את העובר המפורק עם E3 מינימלי ישירות לתוך שפופרת של 50 מיליליטר של 45 מעלות צלזיוס אגרוז.

הסר את העובר יחד עם כמיליליטר אחד מהאגרוז ההרכבה והעביר כ-100 מיקרוליטר של המדיום עם העובר למרכז מיקרו-באר של 10 מילימטר בתחתית צלחת פטרי עם תחתית זכוכית של 35 מילימטר. כאשר אמצעי ההרכבה מתייצב, העבר את העובר לקצה מעגל האגרוז, כשהזנב פונה כלפי חוץ. השתמש במחט הנימים כדי לכוון את העובר לרוחב ככל האפשר כדי לדמות את התפתחות הגוף האחורי.

לאחר מכן עם הנימים, שמור על העובר בכיוון הרוחבי הרצוי עד שהג'ל מתייצב לחלוטין. לאחר שטיפה האגרוז התייצבה, השתמש בתמיסת עבודה של טריקאין כדי להציף את צלחת הפטרי. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח עם בסיס אור מועבר, התאם את מיקום המראה ואת זווית האור הפוגע כך שהניגודיות החזקה תאפשר לראות בבירור את החתכים באגרוז

כדי לבצע חיתוך אחד, השתמש במחט הנימים או במיקרו-אזמל כדי לחתוך את האגרוז בתנועת ניסור למעלה ולמטה, צמוד לחלמון ובאמצע הדרך לאורכו, רק אחורי לשדות הלב הנוצרים במורד הסומיט הקדמי החמישי, ולגמרי דרך האגרוז לזכוכית. קריטי כאן כדי להבטיח שהעובר לא יינזק בזמן חיתוך האגרוז מעל שק החלמון. לאחר מכן, בצע את החיתוכים השני והשלישי, החל מהעובר עד לזכוכית, משיקים לחמשת הסומיטים הראשונים, ומאפשרים את התפתחות הגב של הגוף האחורי.

לאחר מכן, החל מההצטלבות של חתך אחד ושלוש, בצע חתך אלכסוני איטי לקראת סוף החתך השלישי תוך הרמה איטית כלפי מעלה כדי לעקור את ריבוע האגרוז המקיף את הגוף האחורי. בעזרת זוג מלקחיים חדים, הסר את גושי האגרוז שנעקרו מהמדיום העוברי על ידי שימוש בדופן צלחת הפטרי כתמיכה תוך הרמת חתיכות האגרוז. לפני הרכבת הדגימה, השתמש ב-1% אגרוז ב-E3 כדי לצפות צלחת פלסטיק של 100 מילימטר לגובה של חמישה מילימטרים ולאפשר לה להתייצב.

לאחר מכן מניחים טיפה של נקודת התכה נמוכה של מיליליטר אחד במרכז המנה ומניחים לה להתייצב גם כן. הטמע את העוברים בנקודת התכה נמוכה כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. עם זאת, הפעם, הוציאו את העובר מצינור האגרוז בנפח 50 מיליליטר עם טיפת תמיסה קטנה יותר, והניחו את הטיפה הקטנה הזו על גבי טיפת המיליליטר במרכז המנה.

השתמש במחט הנימים כדי למקם את העובר במרכז הטיפה הקטנה ולשמור על כיוונו הנכון עד להתייצבות הג'ל. לבסוף, השתמש בתמיסת עבודה של טריקאין כדי להציף את המנה ולהסיר את עודפי האגרוז. דוגמה לעובר דג זברה שהוזרק עם קידוד mRNA לחלבון הפלואורסצנטי הניתן להמרה kikumeGR, ואז הותקן בשלב 15 סומיט ונתון לדמיון זמן-lapse למשך 12 שעות מוצג בסרטון אנימציה זה.

הגוף האחורי מורשה לנוע בחופשיות ומציג שינויים דומים במורפולוגיה כפי שניתן לראות בעוברים המורשים להתפתח ללא כוריון בתנאי תרבית רגילים. בסרטון זה, עוברים הוזרקו בשלב 16 התאים עם mRNA המקודד היסטון 2BRFP, המסמן את הגרעינים, ו-CAAXGFP, המסמן את קרומי התאים. התמונות צולמו במיקרוסקופ זקוף ורב-פוטוני עם יעד טבילה במים פי 25 משלב 10 סומיט למשך שלוש שעות כדי להמחיש את התנהגויות התאים במהלך היווצרות ניצני הזנב.

ניתן לראות תאים המייצרים בליטות פעילות ותנועה כיוונית כאשר ניצן הזנב נוצר כרגיל. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 20 דקות אם היא נעשית כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שהעובר נמצא במצב רוחבי בזמן שג'ל האגרוז מתייצב.

אחרת, אזור העניין ינוע במהירות מחוץ לשדה הראייה במהלך ההדמיה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה ברורה כיצד להרכיב עוברי דג זברה להדמיה חיה של התארכות הגוף האחורית.