להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתייג ולדמיין תאים מרובי ציליים של דג הזברה באתרם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית כגון אילו גורמים מווסתים סולפטים מרובי צילים בכליה של דג הזברה העוברי? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לתייג גם תעתיקי חלבון וגם RNA בו זמנית, מה ששימושי בהיעדר נוגדנים ספציפיים לדג הזברה.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר הלכנו לסמן תאים מרובי ציליים בפרונפרו תוך ניתוח נוכחות ריסים לאחר ביצוע שינויים בעובר. התחל בקיבוע עוברי דג הזברה 24 שעות לאחר ההפריה בחמישה מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד למשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. לאחר מכן, שטפו את העוברים פעמיים ב-PBS עם 0.1%Tween 20 או PBST ולאחר מכן שטיפה אחת עם חמישה מיליליטר של 100% מתנול.

לאחר מכן, דגרו את העוברים בחמישה מיליליטר של אתנול טרי של 100% למשך 20 דקות לפחות במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין את העוברים להכלאה, יש להחזיר את היילודים למים בחמישה מיליליטר של 50% מתנול ו-PBST למשך חמש דקות ולאחר מכן חמש דקות בחמישה מיליליטר של 30% מתנול ו-PBST. שטפו את העוברים פעמיים במשך חמש דקות כל אחד בחמישה מיליליטר PBST ודגרו את העוברים בחמישה מיליליטר של תמיסת 1 ל-1,000 פרוטאינאז K ו-PBST למשך שתי דקות ומיד לאחר מכן שתי שטיפות נוספות בחמישה מיליליטר PBST.

יש לתקן את העוברים בחמישה מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות לפחות בטמפרטורת החדר ואחריהם שתי שטיפות בחמישה מיליליטר של PBST 20. כדי להקל על האינטראקציות בין העוברים לתמיסת ההכלאה, העבירו את העוברים לחמישה מיליליטר PBST בצינורות מיקרו צנטריפוגות זקופים עם תחתית שטוחה במדף מיקרו צנטריפוגות ושטפו את העוברים פעמיים במשך חמש דקות כל אחד ב-1.5 מיליליטר של תמיסת הכלאה. לאחר הכביסה השנייה, דגרו את העוברים ב -1.5 מיליליטר של תמיסת הכלאה טרייה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה למשך ארבע עד שש שעות.

לאחר מכן, החלף את תמיסת ההכלאה ב-10 מיקרוליטר של בדיקת RNA מעניינת ו-500 מיקרוליטר של תמיסת הכלאה להכלאה של בדיקה לילה ב-70 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, שטפו את העוברים פעמיים ב-1.5 מיליליטר של 50% פורממיד ו-2X בופר מלח-נתרן ציטראט או SSC למשך 20 עד 30 דקות לכל שטיפה ב-70 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את העוברים פעם אחת ב-1.5 מיליליטר של 2X SSC בלבד ב-70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן שתי שטיפות ב-1.5 מיליליטר של 0.2X SSC ב-70 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות לכל כביסה.

לאחר הכביסה השנייה, החלף את ה-SSC 0.2X ב-1.5 מיליליטר של מגיב חוסם לדגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, החלף את המגיב החוסם ב-0.2 מיליליטר אנטי-דיגוקסין בחזרת פרוקסידאז ומגיב חוסם ביחס של 1 ל-1,000 למשך דגירה של שלוש שעות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. לאחר מכן, שטפו את העוברים פעמיים עד ארבע פעמים ב-1.5 מיליליטר של חומצה מאלית למשך 10 עד 15 דקות בכל שטיפה ולאחר מכן דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס ב-1.5 מיליליטר של חומצה מאלית טרייה.

למחרת בבוקר, החלף את מאגר החומצה המאלית ב-1.5 מיליליטר PBS ושטוף את העוברים פעמיים ב-1.5 מיליליטר PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה. דגרו את העוברים ב-0.2 מיליליטר של תמיסה עומדת פלואורסצנטית Si3 למשך 60 דקות ולאחר מכן ארבע שטיפות רצופות של 10 דקות ב-1.5 מיליליטר של ריכוזי מתנול עולים. לאחר הדגירה האחרונה, דגרו את העוברים בטמפרטורת החדר ב -1.5 מיליליטר של מי חמצן 1% ומתנול למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שטפו את העוברים במשך 10 דקות בכל שטיפה בתמיסות מתנול יורדות של 1.5 מיליליטר ולאחר מכן שתי שטיפות של חמש דקות ב-1.5 מיליליטר PBS. לאחר מכן, שטפו את העוברים ב -1.5 מיליליטר מים מזוקקים כפולים למשך חמש דקות ולאחר מכן שטיפה של שבע דקות ב -1.5 מיליליטר מינוס 20 מעלות צלזיוס אצטון. שטפו את העוברים בעוד 1.5 מיליליטר מים מזוקקים כפולים למשך חמש דקות ולאחר מכן שטיפה של חמש דקות ב-1.5 מיליליטר PBST עם 1% DMSO או PBDT.

דגרו את העוברים בטמפרטורת החדר ב-1.5 מיליליטר PBDT עם 10% FBS על נדנדה למשך שעתיים. לאחר מכן, החלף את ה-PBDT וה-FBS ב-1.5 מיליליטר של הנוגדנים העיקריים לדגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, שטפו את העוברים ב-1.5 מיליליטר PBDT, FBS ו-0.1 נתרן כלורי מולארי למשך דקה אחת עם נדנוד ואחריו חמש שטיפות נדנדה של 30 דקות ב-1.5 מיליליטר PBDT, FBS ונתרן כלורי.

לאחר השטיפה האחרונה, שטפו את העוברים פעם אחת ב-1.5 מיליליטר PBDT ו-FBS למשך 30 דקות בלבד עם נדנוד ואחריו דגירה של לילה ב-200 מיקרוליטר של הנוגדנים המשניים המתאימים בארבע מעלות צלזיוס מוגנים מפני אור. למחרת בבוקר, שטפו במהירות את העוברים פעמיים ב-1.5 מיליליטר PBDT ולאחר מכן דגירה של 15 דקות ב-1.5 מיליליטר DAPI על נדנדה. לאחר מכן, שטפו את העוברים שלוש פעמים ב-1.5 מיליליטר PBDT עם FBS ונתרן כלורי למשך 15 עד 20 דקות בכל שטיפה ואחסנו את העוברים ב-1.5 מיליליטר PBDT בארבע מעלות צלזיוס מוגנים מאור הסביבה.

כדי לדמות את כליות דג הזברה, הניחו את העוברים לרוחב על שקופיות זכוכית בכ-10 מיקרוליטר PBDT. בעזרת זוג מלקחיים עדינים ומיקרוסקופ מנתח, סחטו את העובר הראשון מאחורי העיניים כדי להסיר את הראש וחלק מכדור החלמון. לאחר מכן, מגרדים בעדינות את כדור החלמון שנותר מגוף העובר.

בעת הסרת כדור החלמון, היזהר לא לגעת בהארכת שק החלמון מכיוון שהרקמה המעניינת נקרעת בקלות וממוקמת ישירות מעל הארכה. השתמש ברקמה דקה כדי להסיר את החלמון המנותק והנוזל הנוסף מהשקופית. לאחר מכן, הוסף טיפה של אמצעי הרכבה לזנב הנותר ומקם את הזנב לרוחב.

משטחים את הזנב בעזרת החלקת כיסוי ומניחים את המגלשה בקופסת שקופיות מכוסה. לאחר מכן, השתמש באובייקט 60X במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לדמות את הריסים של הכליה בתעלות הפלואורסצנטיות המתאימות. בתמונות המייצגות הבאות של עובר דג זברה צבוע כפי שהודגם זה עתה, ניתן לזהות תאים מרובי צילים על סמך הדמיה של ריבופרוב האנטי-סנס המשמש לזיהוי ביטוי תעתיק ODF3B, הגמט טובולין המסומן בגופי בסיס ואלפא טובולין המסומן באצטילציה המסומן ריסים.

ואכן, בהגדלה זו של הפרונפרוס העוברי, ניתן להבחין בתא מרובה ציליונים עם תעתיקי ODF3B, גופי בסיס מרובים וריסים. ניתן להבחין בין התא החד-צילילי הסמוך על ידי גופו הבסיסי היחיד ופנוטיפ הסיליום היחיד שלו. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בעוברים קבועים טריים ולשמור על הדגימות מוגנות מפני אור הסביבה לאחר הוספת הנוגדן הראשון.